وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية، (منحة رقم 0842701 لIOS-CAC)، والمعهد الوطني للصحة (R00MH080599 لBY، R21 NS062313 إلى NC، وNS069844 إلى CAC). نود أن نعترف جيمس شوت، إميلي هان، ويني ترونج للدعم التقني، ومركز الأسهم بلومنجتون لخطوط الطيران. ملفقة جميع رقائق في مرفق Nanofabrication لوري في جامعة ميشيغان.

1. جعل رقاقة PDMS لجعل شريحة PDMS من العفن SU-8، اتبع الخطوات 1،1-1،7. إذا كان هو رقاقة على يد، لكنه يحتاج إلى تجميعها لاستخدامها، انتقل إلى الخطوة 1.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 45 غراما من قاعدة PDMS و 4.5 غرام من وكيل علاج (نسبة 10:1) من مجموعة PDMS في وعاء صغير من البلاستيك يمكن التخلص منها ومزجها جيدا باستخدام ضجة عصا من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحاوية في وعاء فراغ (مثل مجفف) لمدة 10 دقيقة لإزالة أي فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العفن SU-8 في الجزء السفلي من 150 ملم في القطر طبق من البلاستيك وتصب ببطء الخليط PDMS على القالب. والحرص على عدم توليد فقاعات في حين صب PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج PDMS في فرن (أو الحاضنة) في 650 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العفن PDMS/SU-8 الشفاء من الفرن واتركها تبرد لبضع دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شفرة حلاقة، وقطع PDMS شفي على طول حافة القالب SU-8 وسلخه من SU-8 العفن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم بلاطة PDMSفي PDMS الفردية رقائق باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة 21 G الاستغناء، كزة حفرة في ميناء فراغ (مبين في الشكل 1A) من رقاقة PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الاستغناء إبرة 23 G وتحريف طرف الإبرة من قاعدتها عدة مرات لكسر إبرة تلميح الخروج من مركز القفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج إبرة غيض 23 G إلى قطعة صغيرة من أنابيب البولي ايثيلين بحيث يغطي على الأقل أنابيب المليمتر من الإبرة. ثم استخدام شفرة حلاقة لقطع الأنابيب الزائدة بعيدا عن إبرة. وهذا يخلق حلقة بلاستيكية حول واحدة من نهاية الإبرة، الأمر الذي سيخلق ختم عند إدراجها في منفذ كمية فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للاستخدام مع مجهر مقلوب (الأرقام 1B و 2A-B): إدراج إبرة غيض 23 G في حفرة من ميناء فراغ. للاستخدام مع المجهر تستقيم (أرقام 1C و2C-D): كزة حفرة الثاني على جانب رقاقة PDMS مع الدهانات 21 Gnsing إبرة؛ وهذا الثقب توفير الوصول إلى الفتحة الأولى من الجانب. ثم أدخل إبرة غيض 23 G مع عصابة أنابيب في حفرة جانبية. ضع قطعة من الشريط على الوجهين عبر الجزء العلوي من الشريحة PDMS لاغلاق الفتحة العلوية (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ قطعة من أنابيب البولي اثيلين أن ما يقرب من 20 سم في الطول. ربط جانب واحد من الأنابيب لطرف الإبرة التي يتم إدراجها في منفذ فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الجانب الآخر من الأنبوب إلى أحد موانئ صمام 3 الطريقة (انظر &#39;3 في اتجاه ومحبس &quot;في قائمة المواد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق حقنة 20 مل في واحدة من اثنين من الموانئ المتبقية. ميناء مشاركة مفتوحة للبيئة. </li></ol> 2. باستخدام رقاقة اليرقة للتصوير لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف رقاقة PDMS مع شريط لاصق شفاف. نعلق قطعة من الشريط إلى أسفل الشريحة. تأكد من أن الشريط لمس سطح PDMS بأكمله، ثم انزع الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة أعلاه 2-3X للتأكد من عدملا توجد جزيئات أو زيت (المدورة من التجارب السابقة) على سطح الرقاقة PDMS. منذ رقاقة PDMS هي قابلة لإعادة الاستخدام، من المهم جدا لإزالة بقايا النفط لأنها يمكن أن تؤثر على التصاق PDMS على الزجاج ويؤدي إلى عدم كفاية الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل في وقت مبكر (أي تستخدم علفا) 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة إلى طبق بتري تحتوي على الماء. (وتستخدم علفا 3 طور مرحلي الثالثة مرحلة اليرقات في الطعام، بدلا من الجانب من القارورة الثقافة). يستحم اليرقات في المياه لإزالة ثقافة المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ ساترة الزجاج نظيفة ووضع قطرة صغيرة من النفط الهالوكربون 700 في وسطها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، واختيار بلطف صعودا نظيفة، في وقت مبكر، نظموا 3 يرقة طور مرحلي الثالثة من الماء (ينبغي أن تكون اليرقة ~ 3.5-4 ملم في الطول). وضع الحيوان لفترة وجيزة على مسح خفيفة الوزن أو منشفة ورقية لإزالة الماء الزائد، ثم وضعه على انخفاض اسعار النفط. يجب أن يكون قطرة صغيرة بما فيه الكفاية بحيث القصبة الهوائية من اليرقات لا المغلفة. دعونا ستا يرقةy على انخفاض اسعار النفط لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة اليرقة من انخفاض اسعار النفط ومن ثم وضعه على ساترة الزجاج نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقة إلى ساترة الزجاج نظيف آخر. هذه الخطوة يزيل فائض المعروض النفطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيلاء الاهتمام لتوجه اليرقة. لتصوير النخاع والأعصاب قطعي العصبية، وينبغي أن الجانب البطنية من يرقة الجلوس على ساترة. في الجانب الظهري، وتتميز أنبوبين القصبة الهوائية الطولية، يجب أن تواجه صعودا. ملاحظة: هذا هو التوجه اليرقة يفضل بشكل طبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف رقاقة PDMS على رأس اليرقة. يجب أن تكون محاذاة اليرقة إلى منتصف وسط microchamber، مع ذيله الموجهة نحو ميناء فراغ. كن حذرا أن اليرقة لا تلمس حواف الغرفة. هذا مهم خاصة بالنسبة للمحطات القصبة الهوائية الأمامية والخلفية. ملاحظة: من الأفضل القيام بهذه الخطوة تحت stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع رقاقة PDMS ضد ساترة الزجاج لتحقيق ختم جيدة. تأكد من أن اليرقة تماماالمغلقة من قبل microchamber عندما رقاقة PDMS لمس ساترة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل 3 الطريقة صمام على ان هذه الحقنة يمكن سحب الهواء من microchamber PDMS (من خلال أنابيب) لخلق فراغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيد واحدة، وعقد ساترة PDMS رقاقة / زجاج بحزم. استخدام اليد الأخرى لسحب المكبس المحاقن. سحب 2-2.5 مل من الهواء، حتى يشعر المقاومة في التعامل مع حقنة، لخلق فراغ. الفراغ تنتج ختم ضيق بين رقاقة PDMS، والنفط، واجهات ساترة ويحد من التنقل من اليرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل صمام قبالة بحيث رقاقة PDMS عزل من حقنة ومن البيئة. ونتيجة لذلك، يتم الحفاظ على مستوى مستقر نسبيا فراغ في microchamber دون الحاجة لعقد المكبس المحاقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق اليرقة تحت المجسام للتأكد من أن جسم الحيوان كله يتم وضعها داخل microchamber، وهذا الحيوان غير متحرك. يجب أن تكون القصبة الهوائية مرئية. بقيةوينبغي أن يكون PDMS رقاقة في اتصال مع ساترة. ملاحظة: انظر الشكلين 2E و2F للحصول على أمثلة من الحيوانات يجمد بشكل صحيح في رقاقة. وتظهر بعض التوجهات غير صحيحة في أرقام 2G و 2H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع رقاقة يرقة (PDMS رقاقة + الزجاج ساترة) على المجهر. وينبغي التعامل مع رقاقة يرقة، وأنابيب المحقنة بعناية لتجنب مفرزة من رقاقة من PDMS ساترة. لمجهر تستقيم، وتحديد الجانب &#39;رأس&#39; من الشريحة إلى مرحلة المجهر مع الوجهين الشريط (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هدفا عالية التكبير (النفط الغمر، فمن المستحسن 40-63X) لتحديد موقع هيكل الحيوان (ق) من الفائدة وإجراء التصوير. في بعض الحالات، قد تكون هناك حاجة إلى التكبير أقل لتحديد المنطقة المطلوب للتصوير قبل أن ينتقل إلى تضخم أعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال التصوير، وإطلاق سراح الفراغ عن طريق التحول صمام لموقفمنفتحة على البيئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل رقاقة من PDMS ساترة. وينبغي أن تكون اليرقة متحركة على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لإزالة اليرقة من microchamber وبلطف وضع اليرقة على طبق أجار العنب عصير لتحقيق الانتعاش. </li></ol> 3. الأمر الذي أدى إلى إصابة العصب سحق إلى الأعصاب القطاعي اليرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوة 2.3 أعلاه لعزل نظموا في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة من النمط الجيني المطلوب. كما هو موضح في الخطوة 2.3 يستحم اليرقات في المياه لإزالة الطعام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام محطة التخدير القياسية ذبابة CO 2، CO أبقى مع 2 وسادة تحت stereomicroscope تشريح، لإخضاع اليرقات. ينبغي أن تصبح يرقات immotile بعد التنسيب على CO 2 وسادة لمدة 1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن وضع اليرقة تخدير واحدة على عصير العنب لوحة آغار تحت stereomicroscope. بدوره الجانب البطني الحيوانية تصل إلى تصور الحبل البطني العصب والأعصاب قطعي من خلال بشرة ( <strأونج&gt; الشكل 3). تأكد من أن اليرقة هو immotile تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام عدد Dumostar-5 ملقط، قرصة الأعصاب قطعي بإحكام من خلال بشرة لمدة 5-10 ثانية. عندما يتم ذلك بشكل صحيح، يبقى بشرة سليمة وليس اخترقت جدار الجسم. ملاحظة: يمكن أن تتم الإصابة في مواقع مختلفة على طول محور الجسم الأمامي الخلفي، طالما أن الحبل البطني العصب، والغدد اللعابية، والأمعاء لا التالفة. الموقع الأكثر فعالية الإصابة في نهاية الجزء الثالث 3 في البطن، كما هو مبين في الشكل 3D. إصابة في هذا الموقع يضر معظم الأعصاب وأسهل لإعادة إنتاج من دون قتل الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإصابة، وتحويل الحيوان بحيث الجانب البطني إلى أسفل على لوحة العنب. يجب أن تكون قادرة على التحرك رأسه وتناول الطعام. إذا كانت الاصابة ناجحة، ثم ستصاب بالشلل في النصف الخلفي من يرقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوانات المصابة على لوحة أجار عصير العنب في 25 و# 176؛ مئوية لمدة الوقت المطلوب وفقا للهدف التجريبية. لالعصبونات الحركية، ويبدأ الجذع الأقرب إلى تنبت في غضون 8-10 ساعة من إصابة 14، والجدعة البعيدة يبدأ تتحول في غضون 6-8 ساعة 15. لفئة IV دا الخلايا العصبية الحسية، ويبدأ الجذع الأقرب إلى تنبت في غضون 4-6 ساعة، وبدء الجدعة البعيدة لتتحول في غضون 3-4 ساعة بعد الاصابة. ملاحظة: مع السائقين GAL4 المناسبة وصحفيين الفلورسنت، وتنتشر وانحطاط يمكن ملاحظتها في رقاقة يرقة (على سبيل المثال، انظر الشكل 6). </li></ol>

<ol>
	<li>Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+and+Dynein+are+the+primary+motors+for+fast+transport+of+mitochondria+in+Drosophila+motor+axons.">Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons.</a> Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).</li><li>Gunawardena, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila.">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li><li>Miller, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+demonstrates+that+Liprin-alpha+is+required+for+trafficking+of+synaptic+vesicles.">Direct observation demonstrates that Liprin-alpha is required for trafficking of synaptic vesicles.</a> Curr. Biol. 15, 684-689 (2005).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo.">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nat. Neurosci. 11, 659-666 (2008).</li><li>Fuentes-Medel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+muscle+sculpt+neuromuscular+arbors+by+engulfing+destabilized+synaptic+boutons+and+shed+presynaptic+debris.">Glia and muscle sculpt neuromuscular arbors by engulfing destabilized synaptic boutons and shed presynaptic debris.</a> PLoS Biol. 7, (2009).</li><li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. , 476-480 (2012).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance.">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108, 434-446 (2008).</li><li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> J. Physiol. 558, 489-502 (2004).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+vivo+neuronal+transport+in+genetic+model+organisms+using+microfluidic+devices.">Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices.</a> Traffic. 12, 372-385 (2011).</li><li>Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chips+for+in+vivo+imaging+of+cellular+responses+to+neural+injury+in+Drosophila+larvae.">Microfluidic chips for in vivo imaging of cellular responses to neural injury in Drosophila larvae.</a> PloS one. 7, (2012).</li><li>Schmid, A., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuromuscular+junctions:+histology+and+in+vivo+imaging.">Analysis of neuromuscular junctions: histology and in vivo imaging.</a> Methods Mol. Biol. 420, 239-251 (2008).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+turnover+of+the+Wallenda/DLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury.">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li><li>Xiong, X., Collins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditioning+lesion+protects+axons+from+degeneration+via+the+Wallenda/DLK+MAP+kinase+signaling+cascade.">A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade.</a> J. Neurosci. 32, 610-615 (2012).</li><li>Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Laser+Axotomy+in+C.+elegans.">In vivo Laser Axotomy in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li><li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructing+a+Low-budget+Laser+Axotomy+System+to+Study+Axon+Regeneration+in+C.+elegans.">Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2.</a> 2, 2024-2032 (2007).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li><li>Rao, S., Lang, C., Levitan, E. S., Deitcher, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neuropeptide+expression,+transport,+and+exocytosis+in+Drosophila+melanogaster.">Visualization of neuropeptide expression, transport, and exocytosis in Drosophila melanogaster.</a> J. Neurobiol. 49, 159-172 (2001).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130, 5385-5400 (2003).</li><li>Rietdorf, J., Steitz, A., Heidelberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+unmixing+macro+for+ImageJ.">Linear unmixing macro for ImageJ.</a> European Advanced Light Microscopy Network. , (2004).</li><li>Koon, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulatory+and+paracrine+control+of+synaptic+and+behavioral+plasticity+by+octopaminergic+signaling.">Autoregulatory and paracrine control of synaptic and behavioral plasticity by octopaminergic signaling.</a> Nat. Neurosci. 14, 190-199 (2011).</li><li>Yarali, A., Gerber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Neurogenetic+Dissociation+between+Punishment-,+Reward-,+and+Relief-Learning+in+Drosophila.">A Neurogenetic Dissociation between Punishment-, Reward-, and Relief-Learning in Drosophila.</a> Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).</li><li>Kuo, C. T., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrite-specific+remodeling+of+Drosophila+sensory+neurons+requires+matrix+metalloproteases,+ubiquitin-proteasome,+and+ecdysone+signaling.">Dendrite-specific remodeling of Drosophila sensory neurons requires matrix metalloproteases, ubiquitin-proteasome, and ecdysone signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15230-15235 (2005).</li><li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Microfluidic+Devices+for+in+vivo+Imaging+of+C.+elegans,+Drosophila.">Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biol. 10, (2012).</li><li>Shin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+leucine+zipper+kinase+is+required+for+retrograde+injury+signaling+and+axonal+regeneration.">Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration.</a> Neuron. 74, 1015-1022 (2012).</li><li>Watkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DLK+initiates+a+transcriptional+program+that+couples+apoptotic+and+regenerative+responses+to+axonal+injury.">DLK initiates a transcriptional program that couples apoptotic and regenerative responses to axonal injury.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 4039-4044 (2013).</li><li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nat. Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), (2009).</li><li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite.">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 767-777 (2010).</li><li>Miller, D. L., Ballard, S. L., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+growth+and+function+in+Drosophila+with+an+extended+larval+stage.">Analysis of synaptic growth and function in Drosophila with an extended larval stage.</a> J. Neurosci. 32, 13776-13786 (2012).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، وقد استخدمت بوصفها النموذج الحي لأكثر من 100 سنة، ولقد أثبتت تأثيرها الفعال في تحديد الإشارات الأساسية والمسارات التنموية التي يتم حفظها من اللافقاريات إلى الإنسان. التصوير الحي هو مدخلا مهما لدراسة الآليات الخلوية، والخطة بسيطة وبشرة الجسم الشفاف لليرقة ذبابة الفاكهة يجعلها جذابة للنظام التصوير الحية، لا سيما وأن هناك العديد من الأدوات الجينية المتاحة للتعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently في أنواع معينة من الخلايا. تحديا هاما للتقنيات التصوير الحية يتمثل في شل noninvasively ووضع حيوان للفحص المجهري. وتشمل النهج الشلل التقليدية تشريح 1،2 أو استخدام الكلوروفورم، وكلاهما قتل الحيوان. والتخدير استخدمت أيضا الأثير 4 وisofluorane 5-8. بينما توفر العديد من المزايا التخدير، كما أنها تمنع النشاط العصبي وعلم وظائف الأعضاء الهامة (بما في ذلك ضربات القلب) 9-11، وبالتالي يمكن أن يؤثر على عملية دراسة وخلق الضغط على الحيوان. وهناك أيضا مخاوف تتعلق بالسلامة الإنسان للعمل مع الأثير، وisofluorane. قمنا بتطوير طريقة خالية من المخدرات لشل حركة يرقات ذبابة الفاكهة في طبقة PDMS الجهاز ميكروفلويديك واحد، والذي نسميه &#39;رقاقة اليرقة&#39; 12. وهذا البروتوكول تصف كيفية الحصول أو جعل رقاقة يرقة، وكيفية الاستفادة منه لتصوير حي في أوائل نظموا 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات. تتألف الرقاقة من microchamber تركيب دافئ، والتي، بناء على طلب من فراغ عن طريق حقنة، يشل الحيوان عن طريق القوة الميكانيكية لطيف. طريقة تجميد يجلب هياكل بطني مثل الحبل العصبي والأعصاب قطعي، وعضلات جدار الجسم، على مقربة من ساترة الزجاج. وهذا يسمح لتصوير عالية الدقة من هذه الهياكل مع أبر العددية عاليةتلح (تضخم عالية) الأهداف. وتشمل المزايا التي تتمتع بها رقاقة اليرقة على التقنيات التقليدية الأخرى ما يلي: (ط) استخدام رقاقة يرقة يحل محل استخدام المواد الكيميائية، والسماح لفي الجسم الحي التصوير من الحيوانات unanesthetized. (ب) استعادة اليرقات على الفور بعد الافراج عن رقاقة (على النقيض من فترة نقاهة 2 ساعة لisofluorane 8،13). وهذا يسمح للتصوير على جداول زمنية واسعة، بدءا من ميلي ثانية إلى دقيقة، لساعات وأيام. (ج) استخدام PDMS، والذي هو مادة قابلة للاختراق الغاز، وتمكن لنشر المستمر من الأوكسجين / الهواء من البيئة إلى الجسم اليرقة. (د) رقاقة سهلة وآمنة للاستخدام، و (ت) هو قابل لإعادة الاستخدام، ويمكن تصنيعها بأقل تكلفة. بالإضافة إلى التعليمات الخاصة باستخدام رقاقة يرقة، وهذا البروتوكول تقديم عدة أمثلة لاستخدامه لدراسة الأحداث العصبية في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات. وتشمل هذه التصوير الحي من axonaالنقل لتر، الكالسيوم الاستجابات للإصابة، ودراسات الوقت الفاصل بين الاتجار وصور قابلة للتحويل البروتينات عبر مسافات طويلة وجداول زمنية. تطبيق آخر من الشريحة هو دراسة الاستجابات العصبية للإصابة محور عصبي. لهذا يوصف إجراء إضافية (في الجزء 3) لإصابة في الأعصاب الطرفية محاور عصبية من قبل سحق العصب قطعي. هذا الفحص بسيط يمكن أن يؤديها على حد سواء بسرعة وبتكاثر تحت stereomicroscope تشريح القياسية، والذي يسمح لكثير من الحيوانات التي سيتم تجهيزها في نفس الوقت. الاستجابات الخلوية إلى إصابة يمكن دراستها عن طريق التصوير الحي في رقاقة اليرقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1170">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:259px;">0.5 mm Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-170-11B</td>
			<td style="width:449px;">Polyethylene tubing, I.D. = 0.023&#8217;&#8217;, O.D. = 0.038&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1 mm Polyurethane tubing</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">BB521-63</td>
			<td style="width:449px;">Polyurethane tubing, I.D. = 0.063&#8217;&#8217;,&#160; O.D. = 0.125&#8217;&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">barb to barb connector</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8300</td>
			<td style="width:449px;">0.8 mm barb to barb connector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">3-way stopcock valve</td>
			<td style="width:171px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:291px;">732-8104</td>
			<td style="width:449px;">Screw on valve for the syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Syringe (20 ml)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">14-817-33</td>
			<td style="width:449px;">Screw on 20 ml syringe for&#160; generating vacuum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;">75165A684</td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D.,&#160; .8mm O.D.)</td>
			<td style="width:171px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:291px;"><a href="http://www.mcmaster.com/#75165A679" title="Close">75165A679</a></td>
			<td style="width:449px;">Needle for outlet connection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Halocarbon oil</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:291px;">H8898</td>
			<td style="width:449px;">Halocarbon oil 700</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Dumostar Number 5 Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Roboz</td>
			<td style="width:291px;">RS-498</td>
			<td style="width:449px;">For nerve crush</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">PDMS Kit (Base and curing agent)</td>
			<td style="width:171px;">Ellsworth</td>
			<td style="width:291px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td style="width:449px;">Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;">Glass Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:291px;">12-544-C</td>
			<td style="width:449px;">24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Disposable Plastic Cup (9 oz.)</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Plastic coffee stirrer stick</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Razor Blade</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">Grape juice agar plates</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:449px;"><a href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925">See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in drosophila larvae

التصوير الحي هو أسلوب مهم لدراسة العمليات البيولوجية الخلية، ولكن هذا يمكن أن يكون تحديا في الحيوانات الحية. بشرة شفافة من يرقة ذبابة الفاكهة يجعلها كائن نموذجا جذابا للدراسات التصوير الحي. ومع ذلك، تحديا هاما للتقنيات التصوير الحية يتمثل في شل noninvasively ووضع حيوان على المجهر. ويعرض هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسهلة الاستخدام للشل حركة والتصوير يرقات ذبابة الفاكهة على polydimethylsiloxane (PDMS) جهاز ميكروفلويديك، الذي نسميه &#39;رقاقة اليرقة&#39;. وتتألف الشريحة اليرقة من PDMS microchamber تركيب دافئ التي يتم تركيبها على الزجاج ساترة رقيقة، والتي، بناء على طلب من فراغ عن طريق حقنة، يشل الحيوان ويجلب هياكل بطني مثل الحبل العصبي والأعصاب قطعي، والجسم عضلات جدار، على مقربة من ساترة. وهذا يسمح لالتصوير ذات الدقة العالية، والأهم من ذلك، يتجنب استخدام انوsthetics والمواد الكيميائية، مما يسهل دراسة مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية. منذ اليرقات بسهولة استعادة من الشلل، ويمكن أن تخضع بسهولة لجلسات التصوير متعددة. وهذا يسمح للدراسات طولية على دورات زمنية تتراوح بين ساعات إلى أيام. يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيفية إعداد شريحة وكيفية الاستفادة من رقاقة لتصوير حي للأحداث العصبية في 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات. وتشمل هذه الأحداث في النقل السريع من العضيات في محاور عصبية، والاستجابات الكالسيوم إلى الإصابة، ودراسات الوقت الفاصل بين الاتجار وصور قابلة للتحويل البروتينات لمسافات طويلة وجداول زمنية. تطبيق آخر من الشريحة هو دراسة التجدد والاستجابات التنكسية للإصابة محور عصبي، وبالتالي فإن الجزء الثاني من هذا البروتوكول يصف الإجراء الجديد وبسيطة للإصابة محاور داخل الأعصاب الطرفية عن طريق سحق العصب قطعي.

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae at JoVE.com

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

يرقات ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجا جذابا للتصوير الحية نظرا لبشرة شفافة وعلم الوراثة الخاصة بهم قوية. يصف هذا البروتوكول كيفية الاستفادة من جهاز PDMS طبقة واحدة، ودعا &#39;رقاقة اليرقة&#39; للتصوير حية من العمليات الخلوية داخل الخلايا العصبية من 3 طور مرحلي الثالثة يرقات ذبابة الفاكهة.

باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

using-microfluidics-chips-for-live-imaging-study-injury-responses

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

15.4K Views.  University of Michigan.  يرقات ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجا جذابا للتصوير الحية نظرا لبشرة شفافة وعلم الوراثة الخاصة بهم قوية. يصف هذا البروتوكول كيفية الاستفادة من جهاز PDMS طبقة واحدة، ودعا 'رقاقة اليرقة' للتصوير حية من العمليات الخلوية داخل الخلايا العص...

Video: Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or bioartificial scaffold materials, entrapment of cardiac myocytes in hydrogels such as fibrin or collagen and stacking of myocyte monolayers 1. These concepts aim at restoration of compromised cardiac function (e.g. after myocardial infarction) or as experimental models (e.g. predictive toxicology and substance screening or disease modelling). Precise monitoring of cell survival after implantation of engineered heart tissue (EHT) has now become possible using in-vivo bioluminescence imaging (BLI) techniques 2. Here we describe the generation of fibrin-based EHT from a transgenic rat strain with ubiquitous expression of firefly luciferase (ROSA/luciferase-LEW Tg; 3). Implantation is performed into the greater omentum of different rat strains to assess immune responses of the recipient organism following EHT implantation. Comparison of results generated by BLI and the Enzyme Linked Immuno Spot Technique (ELISPOT) confirm the usability of BLI for the assessment of immune responses.

Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue EHT

This video demonstrates the use of in vivo bioluminescence imaging to study immune responses after implantation of Engineered Heart Tissue (EHT) in rats.

التصوير تلألؤ بيولوجي لتقييم الاستجابات المناعية عقب زرع أنسجة القلب المهندسة (EHT)

Various techniques of cardiac tissue engineering have been pursued in the past decades including scaffolding strategies using either native or ...

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). We demonstrate in this video article how blast TBI-relevant impulsive pressurization is applied to the neuronal cells in vitro. This is achieved by using well-controlled pressure pulse created by a specialized Kolsky bar device, with complete pressure history within the cell pressurization chamber recorded. Pressurized neuronal cells are inspected immediately after pressurization, or further incubated to examine the long-term effects of impulsive pressurization on neurite/axonal outgrowth, neuronal gene expression, apoptosis, etc. We observed that impulsive pressurization at about 2 MPa induces distinct neurite loss relative to unpressurized cells. Our technique provides a novel method to investigate the molecular/cellular mechanisms of blast TBI, via impulsive pressurization of brain cells at well-controlled pressure magnitude and duration.

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate the molecular/cellular mechanisms of blast-induced traumatic brain injury.

التسرع الضغط من الخلايا العصبية في الدماغ الرضية لدراسة الإصابات

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;،<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; واسماك الزرد

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

الطباعة المغمورة من خلايا على سطح معدلة باستخدام التدفق المستمر Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

تدريب الأشخاص ذوي إصابة الحبل الشوكي لAmbulate باستخدام الهيكل الخارجي بالطاقة

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

تذوب الكتابة اليكتروسبينينج من السقالات Poly(ε-caprolactone) ثلاثي الأبعاد مع مورفولوجيس يمكن السيطرة عليها لتطبيقات هندسة الأنسجة

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...