This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through &#8220;MIS Confocal Microscopy&#8221;, &#8220;Cr&#233;dit aux Chercheurs&#8221; grants and the &#8220;Nanomotility FRFC project&#8221; (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and G&#233;raldine Circelli for confocal imaging.

1. تفعيل سطح coverslips الزجاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips مكان الزجاج الدائرية (25 مم) في طبق بتري والتشويه 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم حل عليه لمدة 5 دقائق (الدخان الكيميائية غطاء مستحسن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وتزج تماما coverslips مع DDH العقيمة 2 O لمدة 20 دقيقة في حين هزاز بلطف على طبق هزاز في غطاء الثقافة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف العقيمة DDH 2 O وكرر الخطوة 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لل coverslips مع ملاقط معقمة ووضعها في طبق بيتري جديدة مع تنشيط الوجه لأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips الجافة في ظل تدفق مستمر من عالية النقاء غاز النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء الثقافة العقيمة، تشويه طبقة رقيقة من 3- (trimethoxysilyl) بروبيل أكريليت (92٪) على الجانب تنشيط ساترة لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips الزجاج على نطاق واسع مع 3 يغسل من DDH العقيمة 2 O وتزج بهم في DDH العقيمة 2 O في طبق بتري جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستفادة من طبق بتريمع parafilm ووضعه على لوحة الروك تحت الإثارة لطيف لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لل coverslips من DDH 2 O مع ملاقط معقمة مع نصائح الجميلة ووضعها في طبق بيتري جديدة مع تنشيط الوجه لأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين في RT في مكان جاف مع رقائق الألومنيوم لتجنب الغبار من الالتصاق لل coverslips. </li></ol> 2. إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد والوزن من 65 ملغ من مادة الأكريلاميد N-هيدروكسي إيثيل (HEA) في 1.5 مل إيبندورف أنبوب. من المهم إعداد حل HEA الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من 50 ملي HEPES عازلة لHEA وتخلط باستخدام vortexer حتى HEA حل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من 40٪ ث / ث في HEPES حل الأكريلاميد وحجم المطلوب من 2٪ ث / ث في HEPES مكرر الأكريلاميد حل (انظر الجدول 1) للوصول إلى تصلب هيدروجيل المطلوب. ضبط مع 50 ملي HEPES إلى الحجم النهائي من 5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل باستخدام vortexer وديغا ذلكفي فراغ الغرفة لمدة 20 دقيقة من أجل الحد من تركيز الأكسجين في الحل، والذي يمنع هيدروكسي PAAm البلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء العقيمة، تصفية حل degased مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام مرشح من أجل تعقيمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل coverslips الزجاج الدائرية (22 مم) في نظافة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون خلال 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 100 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS) حل، وهذا هو APS 10 ملغ في 100 ميكرولتر DDH 2 O. من المهم إعداد حل APS الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر من رباعي ميثيلين ثنائي الأمين (TEMED) و 25 ميكرولتر من الحل APS إلى تعقيم هيدروكسي PAAm الحل (الخطوة 2.5) لبدء البلمرة. مزيج الحل بواسطة 3 pipettings التوالي دون إدخال فقاعات، تحت ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء العقيمة، ضع قطرة 25 ميكرولتر من الحل هيدروكسي PAAm على 25 مم ساترة (متوفر من الخطوة 1.9) وعلى الفور وضع 22 ملم GLالحمار ساترة (أعدت في الخطوة 2.5) على رأس الحبرية للضغط الحل هيدروكسي PAAm. توسيط زجاج 22 مم ساترة مع ملاقط معقمة وتذليل أي فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي إلى تتبلمر في RT لمدة 15 دقيقة. عكس يدويا المتبقية حل هيدروكسي PAAm في أنبوب إيبندورف لمتابعة استكمال عملية البلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج تماما coverslips مع العقيمة DDH 2 O وفصل بعناية coverslips 22 ملم الزجاج عن طريق إدخال حافة شفرة حلاقة بين coverslips 22 ملم الزجاج وطبقة هيدروجيل هيدروكسي PAAm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مع برنامج تلفزيوني العقيمة (3 تبادل PBS) والسماح المواد الهلامية مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني العقيمة للحفاظ على الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي في برنامج تلفزيوني العقيمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام. </li></ol> 3. Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp تلفيق ملاحظة: تلفيق الماجستير السيليكون مطلوب قبل ستاRT في تلفيق PDMS microstamp. ويمكن أن يتم هذا التصنيع الدقيق للسيد السيليكون بواسطة تقنيات الطباعة الحجرية، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة والتدريب. ويتم تشجيع التعاون مع مرفق nanofabrication الى افتعال سيد السيليكون. بدلا من ذلك، اتصل على الشركة التي بتصنيع السيليكون microstructured سادة مصنوعة خصيصا حسب الطلب. من المهم أن نلاحظ أن تلفيق سيد السيليكون يحتاج فقط إلى أن يتم مرة واحدة. في الواقع، وسادة السيليكون microstructured يمكن استخدامها لأجل غير مسمى لإنتاج الطوابع المرنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج PDMS وكيل المعالجة في 10: 1 نسبة في كوب من البلاستيك وتخلط جيدا باستخدام ماصة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ديغا الخليط PDMS تحت فراغ لإزالة فقاعات الهواء التي تشكلت خلال الخطوة 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع سيد السيليكون microstructured في طبق بتري ويلقي طبقة سميكة 10 ملم من نزع الغاز PDMS الخليط على ذلك دون تشكيل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا علاج PDMS لمدة 2 ساعة على 60 درجة مئوية فيالفرن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في بيئة خالية من الغبار، وطبقة PDMS-تقشر والمكوس 1 سم 2 microstamps مع مشرط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، ومكان PDMS microstamps نمط المتابعة في طبق بيتري. </li></ol> 4. Micropatterning هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان PDMS microstamps في الإيثانول / الماء (50/50) الحل ويصوتن لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الطوابع مع تدفق تيار من النيتروجين ووضعها نمط المتابعة في نظافة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون (λ &lt;200 نانومتر) لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء العقيمة، ضع قطرة 150 ميكرولتر من الحل المنشود البروتين (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني أو 25 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في PBS) على سطح microstructured من 1 سم 2 PDMS الطوابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: تعديل تركيز المحلول البروتين لتعديل كثافة خلية يجند. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر حل البروتين على سطح ختم بنقلها مع طرف العقيمة ماصة تجاه كل ركن منالطابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الحل البروتين على كثف على الطوابع PDMS لمدة 60 دقيقة تحت غطاء العقيمة. إيقاف تشغيل المصابيح لتجنب الضرر البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء العقيمة، ونقل هيدروكسي PAAm coverslips المغلفة (متاح من الخطوة 2.13) في طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS الزائدة من سطح ركائز هيدروكسي PAAm مع تيار النيتروجين المنخفض تحت ظروف معقمة. وقف الإجراءات في أقرب وقت لوحظ أي دليل على المياه الراكدة على سطح هلام. لا ينبغي أن تجفف هلام تماما في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجافة بعناية سطح منظم من PDMS ختم مع تدفق مستمر من عالية النقاء غاز النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم الطابع المغلفة البروتين مع خلع الملابس ملقط الأنسجة ووضع سطح منظم في اتصال مع سطح هيدروجيل المجففة. تطبيق نقاط الضغط وجيزة مع غيض من ملاقط على رأس الطابع PDMS لضمان اتصال جيد بين microfeatures الطوابع وسطح هيدروجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الطابع PDMS على الالبريد سطح مائي لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة PDMS الطوابع من الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm خلع الملابس مع ملقط الأنسجة واتبع الخطوة 4.1 لتنظيف الطوابع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل نطاق واسع في الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مختومة من 3 تبادل PBS (درجة الحموضة = 7.4) في ظروف معقمة لمدة 10 دقيقة في الصرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: micropatterns إضافية من البروتينات ECM أخرى يمكن أن تضاف إلى هيدروكسي PAAm سطح باتباع الخطوات 4،5-4،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف فاعلية مناطق غير مطبوعة مع محلول معقم من BSA بمعدل 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني خلال ليلة واحدة في 4 درجات مئوية تحت الإثارة لطيف على طبق هزاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل نطاق واسع بنسبة 3 تبادل PBS (درجة الحموضة = 7.4) في ظروف معقمة لمدة 10 دقيقة في الصرف. في هذه المرحلة، وختمها الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد. </li></ol> 5. ترسب الخلايا على Micropatterned هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips الخلية في وسائل الإعلام لمدة 30-45 دقيقة قبل الطلاء جملتعلمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا الملتصقة مثقف في 75 سم 2 قارورة الثقافة مع برنامج تلفزيوني العقيمة عند 37 درجة مئوية وسلخه مع 3 مل من التربسين-EDTA أو accutase لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المبلغ المطلوب من قبل تحسنت كاملة النمو المتوسطة مناسبا لخط الخلوي في قارورة تحتوي على خلايا منفصلة وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في ز × 650. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف مع micropipette وresuspend الخلايا في كامل مستنبت في 15-20،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من محلول الخلية إلى ساترة micropatterned (تم الحصول عليها من الخطوة 5.1) ووضع ساترة المغطاة خلية في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية والرطوبة 5٪ لمدة 1-2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بلطف الخلايا غير مرتبط واستبدال الثقافة المتوسطة. العودة الخلايا تعلق على الحاضنة والسماح لهم انتشرت بالكامل (3-6 ساعة، اعتمادا على نوع من الخلايا). </li></ol>

<ol>
	<li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues.">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li><li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking.">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li><li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing.">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288 (2013).</li><li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Th&#233;odoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+microfluidic+method+to+select,+isolate,+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays.">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li><li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes.">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li><li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation.">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li><li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications.">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li><li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces.">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li><li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture.">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li><li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+"ink"+followed+by+chemical+etching.">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li><li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve.">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499 (2012).</li><li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology.">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli.">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics:+steps+towards+optimization+and+alternative+uses.">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury.">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899 (2011).</li><li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays.">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li><li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces.">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li><li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels.">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells.">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671 (2012).</li><li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Confinement:+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus.">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li><li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness:+a+material's+perspective.">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

وقد أجريت العديد من الملاحظات المختبر في بيولوجيا الخلايا الحديثة على coverslips الزجاج جامدة، وغالبا المغلفة بطبقة رقيقة من البروتينات ECM أو الببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على تسلسل RGD. ومع ذلك، هذه ركائز الثقافة الأساسية لا ألخص تعقيد الفيزيائية كله من ECM وب?...

العديد من المكروية الخلوية المحلية الجوانب (على سبيل المثال، وصلابة، حجم المسام، وطبيعة البروتينات، أو الكثافة خلية يجند) توفر الإحداثيات مجموعة من الإشارات التنظيمية التي تتحكم في العمليات الخلوية مثل الحركة، تكاثر الخلايا، التمايز، والتعبير الجيني. التعديلات من الخصائص الفيزيائية للبيئة خارج الخلية يمكن أن ينظر إليها من قبل الخلايا وتتسبب في عواقب فيزيولوجية مختلفة، بما في ذلك تشويه الاستقطاب الخلوي، والهجرة، والتمايز. يبقى من غير الواضح، مع ذلك، كيف خلايا تترجم إلى إشارات ECM التعديلات البيوكيميائية الخلوية. بالتالي من أهمية كبرى للمهندس رقابة في microenvironments المختبر التي يمكن أن تتكاثر التفاعلات بين الخلايا والمكروية من أجل دراسة مسارات mechanotransduction هو عليه. لمعالجة هذه المشكلة، أدخلنا مؤخرا طريقة رواية 1، ودعا الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي، لتوليد بسهولة يومين الدايممصفوفات nsional الناعمة التي تسمح للسيطرة بشكل مستقل العظة mechanotransduction مهمة: مصفوفة الصلابة، هندسة الخلايا والحبس، طبيعة البروتين وكثافة خلية يجند. ECM يوجه العمليات الخلوية عبر التدرجات في morphogens (الكيميائي)، والبروتينات لاصقة (haptotaxis)، وتصلب (durotaxis). على مدى العقود القليلة الماضية، تقدما في منصات المختبر وضعت لعزل هذه الاشارات خارج الخلية من أجل استخلاص خلايا كيف هي قادرة على ترجمة ميزات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية في العمليات الفسيولوجية 2-5. وقد وضعت الإلكترون شعاع 6، 7 ضوئيه، تجميد الضوئي 8، أو بمساعدة تقنيات البلازما 9 لتوجيه نمو الخلايا الحية على ركائز micropatterned. على الرغم من أن هذه التقنيات قد أسفرت عن نتائج مهمة، ومعظمهم لا تسمح بالتمييز بين النفوذ الفردي للمنبهات مختلفة على سلوك الخليةوأنها تتطلب مرافق تقنية المختبرات القليلة التي لا تستطيع تحمله. ومن بين هذه التقنيات، microcontact الطباعة (μCP)، برزت كوسيلة قوية والوصول إلى إنشاء خلية لاصقة الصغيرة الجزر 10. وفي الآونة الأخيرة، بذلت جهود واسعة 11-14 لتطوير μCP على الهلاميات المائية مع الجمود الانضباطي من أجل إنتاج مجموعة واسعة من الجمود الملحوظ في الأنسجة الحية. ومن بين هذه الأعمال، أصبح بولي أكريلاميد (PAAm) شعبية 15 و هو بالفعل واحدة من المصفوفات البوليمر المستندة الأكثر استخداما لالميكانيكا الحيوية الخلية المقايسات. وبين functionalized السطوح PAAm عادة مع heterobifunctional عبر رابط ترتبط N-sulfosuccinimidyl-6- [4&#39;-azido-2&#39;-nitrophenylamido] (سلفو-SANPAH) والبروتينات ECM إلى السطح عن طريق تفعيل الأشعة فوق البنفسجية من nitrophenyl سلفو-SANPAH مجموعات أزيد 16. يتكون أسلوب آخر في اقتران الهيدرازين للبروتينات التي تتأكسد بشدةمع بريودات 17. قدم Hynd وزملاء العمل للتقنية الزخرفة الأسطح هيدروجيل بيوميمتيك مع البروتينات والببتيدات التي تتطلب في بلمرة ضوئية المنشأ جود مونومر-acroyl streptavidin 18. وفي الآونة الأخيرة، تسنغ آخرون. وأفادت طريقة جديدة micropatterning 19 على أساس التعرض للأشعة فوق البنفسجية العميقة من PAAm من خلال قناع الكوارتز البصرية التي تتطلب لاحتضان المواد الهلامية PA تفعيلها مع 1 إيثيل-3- [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) وN-hydroxysuccinimide (NHS) قبل حلول المياه لإضافة البروتين. على الرغم من قدرة هذه التقنيات لخلق متجانسة وقابلة للتكرار البروتينات micropatterns، معظمهم يعانون القيود الرئيسية: عمليات التوليف طويلة (مثل غسيل الكلى، تجفيد، الخ)، ومركبات كيميائية باهظة الثمن (مثل حمض الهيالورونيك، سلفو-SANPAH) أو الأشعة فوق البنفسجية العميقة التشعيع. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات لا تسمح التشكيل مستقلة عن صلابة الركيزة، micropatternهندسة، ECM طبيعة البروتين، وكثافة الخلايا يجند. أخذ هذه القيود في الاعتبار، قمنا بتطوير نهج قائم على مادة الأكريلاميد الرواية وبسيط يسمح تجميد مجموعة متنوعة من البروتينات والجزيئات الحيوية على الهلاميات المائية لينة ويسمح ضبط مستقلة عن العظة mechanotransduction من أجل فك دورها على الوظائف الخلوية. بدلا من التعامل مع الهلاميات المائية PAAm المركبات الكيميائية القاسية، ونحن نقدم مونومر الأكريلاميد التجاري مع مجموعات الهيدروكسيل PAAm خلال البلمرة. هذه العملية بسيطة تتغلب على الملكية المضادة لللاصقة الجوهرية للالهلاميات المائية PAAm دون أي شروط فنية أخرى. وجود مجموعات الهيدروكسيل يؤدي إلى تقارب عالية من الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي عن البروتينات والجزيئات الحيوية التي تشكل التفاعلات الهيدروجين الترابط. في تركيبة مع μCP، الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي تمكن جيل السريع للثقافة منصة ثنائية الأبعاد مع مراقبة مستقلةعلى صلابة مصفوفة، نوع من البروتينات ECM، الكثافة خلية يجند والإلتصاق المحصورة، والتي تصور أن يكون منصة قوية لدراسة mechanotransduction. والغرض من هذا البروتوكول هو توفير المعلومات اللازمة لاتخاذ بسهولة الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي دون أي خبرة في العلوم المادية. الهدف النهائي هو توفير وسيلة للباحثين لطرح الأسئلة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في مستويات الخلايا والأنسجة التي قد تؤدي إلى فهم أفضل لمسارات mechanotransduction تشارك في آليات المرضية في جسم المريض.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">UV/Ozone Photoreactor</td>
			<td style="width:71px;">Ultra-Violet Products</td>
			<td style="width:119px;">Model PR-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Rocking plate</td>
			<td style="width:71px;">IKAcWerke</td>
			<td style="width:119px;">Model KS 130 Basic</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Vortexer</td>
			<td style="width:71px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:119px;">Model Vortex Genie2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Vacuum degassing chamber</td>
			<td style="width:71px;">Applied Vacuum Engineering</td>
			<td style="width:119px;">DP- 8-KIT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Parafilm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Stainless steel forceps with fine tip</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z225304-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Dressing tissue forceps</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F4392-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Petri dishes in polystyrene</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5731-500EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Aluminium foil, thickness 0.5&#160;mm</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">266574-3.4G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Isopore membrane filter (0,2 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GTTP Filter code</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (22 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Round glass coverslip (25 mm diameter)</td>
			<td style="width:71px;">Neuvitro</td>
			<td style="width:119px;">GG-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Variable volume micropipette</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z114820</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Protein microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z666505-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel handles</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2896-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2771-100EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Cell culture flasks (75 cm2)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS430641</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z613983-1EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Polydimethylsiloxane&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Acrylamide (powder)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3553</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N&#8217;-Methylenebis(acrylamide)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">146072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N-Hydroxyethylacrylamide</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">697931</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Amonium PerSulfate (APS)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3678</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1805</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Human Plasma Fibronectin</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Laminin from EHS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L2020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium hydroxyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221465-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Double-distilled water (ddH2O)</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:71px;">Cells Applications</td>
			<td style="width:119px;">211K-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C-003-5C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Accutase</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">L11-007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">HEPES buffer solution 1M in H20</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83264-500ML-F</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Antibiotics-antimycotics</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">P11-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Phosphate Buffer Saline solution</td>
			<td style="width:71px;">PAA laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H15-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phaloidin</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-vinculin antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V9131</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine</td>
			<td style="width:71px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">T-2762</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Fibronectin</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">F3648</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">41469</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Laminin antibody</td>
			<td rowspan="2" style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">L9393</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">(rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-rabbit IgG-FITC</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3924-100ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459844-2.5L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of hydroxy-paam hydrogels for decoupling the effects of mechanotransduction cues

والآن راسخة بأن العديد من الوظائف الخلوية وينظم تفاعلات الخلايا مع العظة الفيزيائية والميكانيكية للمن المصفوفة خارج الخلية (ECM) البيئة. الخلايا حقيقية النواة الشعور باستمرار المكروية المحلية من خلال mechanosensors السطح لتنبيغ التغيرات الجسدية من ECM إلى إشارات البيوكيميائية، ودمج هذه الإشارات إلى تحقيق تغييرات معينة في التعبير الجيني. ومن المثير للاهتمام، والبارامترات الفيزيائية والميكانيكية للزوجين يمكن ECM مع بعضها البعض لتنظيم مصير الخلية. ولذلك، فإن المفتاح لفهم mechanotransduction هو فصل المساهمة النسبية إشارات ECM على الوظائف الخلوية. هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل بسرعة وبسهولة لتوليد الهلاميات المائية ذات الصلة بيولوجيا لضبط مستقل من العظة mechanotransduction في المختبر. نحن معدلة كيميائيا الهلاميات المائية بولي أكريلاميد (PAAm) إلى التغلب على جوهرها غير ADHES-إيف الخصائص من خلال دمج مونومرات الأكريلاميد، بين functionalized الهيدروكسيل خلال البلمرة. حصلنا على رواية PAAm هيدروجيل، ودعا هيدروكسي PAAm، الذي يسمح تجميد المرجوة من أي نوع من البروتينات ECM. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تتيح للسيطرة بشكل مستقل مورفولوجيا الخلايا واحدة، وصلابة مصفوفة، وطبيعة وكثافة البروتينات ECM. نحن نقدم طريقة بسيطة والسريع الذي يمكن أن يقام في كل مختبر علم الأحياء للدراسة في العمليات mechanotransduction خلية المختبر. نحن تحقق من صحة هذه الرواية منصة ثنائية الأبعاد عن طريق إجراء التجارب على الخلايا البطانية أن يبرهن على وجود اقتران الميكانيكية بين صلابة ECM والنواة.

ويعرض الشكل 1A المشارك البلمرة الأكريلاميد (علاء) وbisacrylamide (مكرر AAM) مع N-hydroxyethylacrylamide (HEA) أحادية تحتوي على الهيدروكسيل الأساسي التي شكلتها بلمرة جذرية العشوائية شبكة ماء من بولي أكريلاميد مع مجموعات الهيدروكسيل جزءا لا يتجزأ من (هيدروكسي PAAm) . في هذا البروتوكول...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues at JoVE.com

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

نقدم بولكرلميد هيدروجيل جديد يسمى هيدروكسي PAAm، التي تسمح ملزم مباشرة من البروتينات ECM مع الحد الأدنى من التكلفة أو الخبرة. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تسهل مراقبة مستقلة للعديد من العظة من المكروية الخلية الطبيعية لدراسة mechanostransduction الخلوية.

إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.2K Views.  Université de Mons.  نقدم بولكرلميد هيدروجيل جديد يسمى هيدروكسي PAAm، التي تسمح ملزم مباشرة من البروتينات ECM مع الحد الأدنى من التكلفة أو الخبرة. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تسهل مراقبة مستقلة للعديد من العظة من المكروية الخلية الطبي...

Video: Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

بروتين منخفض الوزن الجزيئي تخصيب اليورانيوم على أفلام السيليكا Mesoporous رقيقة لاكتشاف العلامات البيولوجية

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

وتوليف الهلاميات المائية functionalized RGD-كأداة للتطبيقات العلاجية

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

توليف الهلاميات المائية مع خصائص المضادة للحشف والأغشية لتنقية المياه

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

سلالة تسيطر عليها من هيدروجيلس 3D تحت التصوير المجهري لايف

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...