1. عزل غضروفية مفصلي الابتدائية الحصاد 10-15 الغضروف سمك شرائح كاملة من السطوح المفصلية للمفاصل الحيوان (مثل المشط المشتركة-السلامية من الأبقار الناضجين هيكليا تم الحصول عليها من abbatoir المحلية). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح الغضروف مكان في صحن بتري 100 ملم واحتضان في 20 مل من 0.5٪ في البروتيني للحم الخنزير F-12 (W / V) لمدة 2 ساعة في 37 ° C. شطف ثلاث مرات في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12، واحتضان مع 20 مل من كولاجيناز 0.15٪ A في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية التعليق الخلية من خلال مرشح شبكة الشاشة 200 في طبق نظيف. غسل تصفية مع 5 مل من لهام F-12 وإضافة إلى الطبق. نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب 50 مل المخروطية. غسل طبق بتري مع 10 مل من لهام F-12 وإضافة إلى أنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 600-800 لمدة 6-8 دقيقة إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، وضمان عدم تعكير صفو اله الخلية بيليه في 40 مل وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 إعادة تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 600-800 إطار التعاون الإقليمي لمدة 6-8 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.4 و 1.5 ضعف ليصبح المجموع 3 مرات. قبل الطرد المركزي للمرة الثالثة، وإعادة تعليق بيليه عن طريق التحريض والحصول على 500 ميكرولتر قسامة لفرز الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد خلايا قابلة للحياة باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق 9 مع عدادة الكريات ومجهر مقلوب ضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وإعادة تعليق بيليه في حجم وسائل الإعلام F-12 هام لمضاعفة كثافة البذر المطلوب (على سبيل المثال 20 × 10 6 خلية / مل لتركيز النهائي من 10 × 10 6 خلية / مل بعد التغليف). </li></ol> 2. خلية غضروفية-الاغاروز هيدروجيل تغليف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة 0،8 نوع تعقيمها ز السابع الاغاروز في 20 مل من 1X PBS العقيمة (درجة الحموضة 7.4) على طبق ساخن تعيين إلى 120 درجة مئوية حتى يذوب. حل مرة واحدة، وانخفاض الحرارة إلى 60 ° C وارتفاع درجات الحرارة فيلل تؤثر بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 50 مل المخروطية، مزيج دقيق أحجام متساوية لتعليق الخلية مع التركيز ضعف المطلوب من الاغاروز (على سبيل المثال التعليق الاغاروز 4٪ لهيدروجيل النهائي الاغاروز 2٪). تجنب خلق فقاعات كبيرة لأنها يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية وبناء الحياة التعب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية قسامة 10 مل من الخليط خلية غضروفية-الاغاروز في طبق بتري قطرها 60 مم، مع تجنب خلق فقاعات كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسمحوا الوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة حتى تبلور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على ما يصل عينات هيدروجيل خلية غضروفية-الاغاروز حسب الحاجة (20-30 عادة) باستخدام لكمة خزعة 4 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس وتسجيل الأبعاد المادية (قطر والارتفاع) من عينات تمثيلية باستخدام ميكرومتر. يجب أن تكون بنيات حوالي 5 ملم في الطول، وتجاهل أي عينات تم الحصول عليها من منطقة حيث التباين ارتفاع العينة كان أكبر من 2٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينات إلى 60 مم الطازجة طبق بتري والملحقمع 10 مل من وسائل الاعلام متكامل (مثال: 20٪ مصل بقري جنيني في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 مع 20 HEPES مم، 100 ميكروغرام حامض الاسكوربيك / مل، والمضادات الحيوية 2X / antimycotics). </li></ol> 3. تحفيز الميكانيكية وRadiolabelling من خلية غضروفية-الاغاروز الهلاميات المائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف المكونات المعدنية للتلاعب الضغط. تعقيم المكونات البلاستيكية مع الايثانول 70٪ (بين عشية وضحاها) وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية (ما لا يقل عن 15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحفاظ على ثوابت من السقوط، وذلك باستخدام ملقط، مكان 12 حلقات بلاستيكية معقمة الاحتفاظ (مع القطر الداخلي أكبر من قطر بناء) (ن = 6، والعينات والضوابط) داخل آبار لوحة الثقافة 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، بعناية نقل الهلاميات المائية خلية غضروفية-الاغاروز من طبق بتري إلى لوحة 24 أيضا، وتأمين كل واحد في حلقة الاحتفاظ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 400 ميكرولتر من وسائل الاعلام متكامل (مثال: 20٪ FBS في وسائل الإعلام هام في الثقافة F-12 مع 20 HEPES مم، 100 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، و2X المضادات الحيوية / antimycotics) لكل عينة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع تلاعب ضغط تعقيم (الشكل 1) وتأمين محدلات مع مجموعة البراغي. إرفاق تلاعب ضغط على لوحة الثقافة 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إطلاق سراح وإعادة تأمين، مجموعة براغي لإنشاء الصوانى-هيدروجيل الاتصال (صفر دولة سلالة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل تلاعب ضغط تجميعها في A-1 ماخ نظام اختبار الميكرو ميكانيكية. آمنة تلاعب لمرحلة الرأسي عن طريق دبوس تحديد مكان وقفل في مكان مع مجموعة المسمار. إزالة رقصة التباعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل تطبيق الضغط الديناميكي في السعة المطلوبة (على سبيل المثال 10٪ السعة سلالة استنادا إلى الارتفاع الأصلي للعينات)، التردد (على سبيل المثال 1 هرتز) ومدتها أو عدد من الدورات (على سبيل المثال فترات زمنية تصل إلى 60 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من التحفيز الميكانيكي، يستعاض عن رقصة التباعد، وتخفيف مجموعة دبوس مكان المسمار وإزالة الضغط وتلاعب لوحة الثقافة من-1 ماخ نظام اختبار الميكرو ميكانيكية. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> Radiolabel الخلايا هيدروجيل من خلال استكمال البنى وسائل الإعلام مع 5 μCi من النظائر المطلوبة (على سبيل المثال [3 H] التسمية البروتين البرولين لتخليق الكولاجين خلية غضروفية محددة و[35 S] الكبريت لتخليق بروتيوغليكان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 24 يبني رديولبلد ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد يبني هيدروجيل رديولبلد وشطف 3 مرات في برنامج تلفزيوني 1X (درجة الحموضة 7.4) لإزالة أي النظائر غير مدمج. عينات باستخدام غراء دايجست (40 ميكروغرام / مل في 20 ملي خلات الأمونيوم، 1 ملم حمض ethyldiaminetetraacetic و 2 dithiothreitol ملم على 65 درجة مئوية لمدة 72 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص DNA خلاصة للمحتوى باستخدام مقايسة صبغ PicoGreen 11 و أدرجت النشاط النظائر، إلى المضمون تطبيع DNA، بواسطة β-التلألؤ السائل عد 12،13 الهضم غراء التالية مباشرة. </li></ol> ملاحظة: شراء والتخلص من المواد المشعة (النظائر النفايات والمواديجب أن ربما يكون قد حان في المواد المشعة الاتصال) اتباع المؤسسية ذات الصلة (و / أو الحكومية) السياسات والإجراءات لأمان المناولة والتخلص من المواد المشعة. 4. ممثل النتائج وحفز ميكانيكيا البقري المفصلية الغضروفية-الاغاروز يبني الهلاميات المائية (2٪ الاغاروز مع 10 × 6 خلايا 10 / خلايا مغلفة مل) على اتساع سلالة الضغط 10٪ على تردد 1 هرتز لمدة 20 إلى 60 دقيقة (أو دورات 1200 إلى 3،600 ) ويعاير لمحتوى DNA خارج الخلية وتخليق مصفوفة من التأسيس النظائر المشعة. وتأثر الحمض النووي خارج الخلية وتخليق مصفوفة بطريقة تعتمد على الجرعة. عرض محتوى DNA انخفاض ملحوظ بنسبة 35٪ نتيجة ل20 أو 30 دقيقة من التحفيز (P &lt;0.01)، في حين 60 دقيقة من التحفيز عرض أي تأثير (الشكل 2). الغضروف محددة توليف الكولاجين وبروتيوغليكان (التي يحددها [H 3]-البرولين و<html> عرضت [35 S] الكبريت التأسيس، على التوالي) زيادات كبيرة ما يقرب من 60٪ ردا على 20 أو 30 دقيقة من الاستثارة (P &lt;0.01)، مع 60 دقيقة من التحفيز واظهار أي تأثير ملحوظ (الشكل 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> انفجرت رأي يظهر المكونات الفردية: الشكل 1 تخطيطي للتلاعب مبنية خصيصا ضغط دينامية لحفز خلية غضروفية-الاغاروز يبني من الزمن:. تلاعب تجميعها الحق. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الهلاميات المائية حفز ميكانيكيا الشكل 2. التغييرات في محتوى DNA من خلية غضروفية-الاغاروز تحت الضغط سلالة السعة 10٪ في 1 هرتز لمدة 20 إلى 60 دقيقة (يعني ± SEM، ن = 6/group). her.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الهلاميات المائية حفز ميكانيكيا الشكل 3. التغييرات في تركيب المصفوفة خارج الخلية (الكولاجين وبروتيوغليكان) من الاغاروز-خلية غضروفية أقل من 10٪ في السعة سلالة الضغط 1 هرتز لمدة 20 إلى 60 دقيقة (يعني ± SEM، ن = 6/group).

<ol>
	<li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces.">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li><li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease.">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li><li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints.">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li><li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes.">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li><li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li><li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels:+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness.">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li><li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte/agarose+culture.">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li><li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants.">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li><li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation,+culture+characteristics,+and+morphology.">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li><li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs:+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain.">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li><li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258.">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li><li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage.">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li><li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture.">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li><li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro.">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li><li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage.">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li><li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds.">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li><li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression.">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

<html> الطريقة الموضحة لتطبيق محفزات الميكانيكية للرقابة إلى الهلاميات المائية الاغاروز الخلية المصنف يسمح للتحقيق مباشرة في تأثيرات القوى الديناميكية الضغط على عملية التمثيل الغذائي خلية غضروفية. شريطة أن يكون استخدام للتلاعب مخصص لاختبار بالتزامن مع الاحتفاظ الخو...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف أو المعدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> لحم الخنزير في F-12 </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> كولاجيناز A </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> البروتيني </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> أسكوربات </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> المضادات الحيوية / antimycotics </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop كندا المحدودة </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> التريبان الأزرق </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> رايشرت برايت لاين عدادة الكريات </td><td> Hausser العلمية </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> ضليع في الرياضيات-IT PicoGreen </td><td> إينفيتروجن </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> غراء من اللاتكس البابايا </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> خلات الأمونيوم </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic حمض </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> انخفاض ذوبان نقطة الاغاروز، نوع VII </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> شبكة الشاشة (200) تصفية </td><td> سيغما الدريتش المحدودة </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> ماخ-1 تستر الميكرو ميكانيكية </td><td> شركة Biomomentum </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> ضغط تحميل الرقصة </td><td> مبنية خصيصا </td><td></td><td> يمكن توفير منتج مماثل من قبل شركة Biomomentum </td></tr><tr><td> الصقر 24 لوحة الثقافة حسنا </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-السائل التألق مكافحة </td><td> بيكمان كولتر </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] برولاين </td><td> بيركن إلمر- </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] الكبريت </td><td> بيركن إلمر- </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

mechanical stimulation of chondrocyte-agarose hydrogels

الغضروف المفصلي يعاني من قدرة محدودة إصلاح عندما تضررت من إهانة أو الميكانيكية التي تدهورت بفعل المرض، مثل هشاشة العظام. لمعالجة هذا النقص، وقد وضعت العديد من التدخلات الطبية. أسلوب واحد من هذا القبيل هو لتطفو على السطح المنطقة المتضررة مع الأنسجة المهندسة الغضروف، إلا أن الأنسجة المهندسة تفتقر عادة خصائص البيوكيميائية ومتانة الغضروف الأصلي، والتشكيك في البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. وهذا يحد من تطبيق هندسة الأنسجة الغضروف لإصلاح العيوب الصغيرة الاتصال، والاعتماد على الأنسجة المحيطة بها لحماية المواد مزروع. لتحسين خصائص الأنسجة المتقدمة، والتحفيز الميكانيكي هو وسيلة شعبية تستخدم لتعزيز توليف المصفوفة خارج الخلية الغضروفية وكذلك خصائص الميكانيكية الناتجة من الأنسجة المهندسة. التحفيز الميكانيكي ينطبق قوات إلى الأنسجة يبني مماثلة لتلك الخبرة في الجسم الحي. هذاويستند على أساس أن البيئة الميكانيكية، في جزء منه، ينظم تطوير وصيانة الأنسجة 1،2 الأصلية. الشكل الأكثر شيوعا من تطبيق التحفيز الميكانيكية في هندسة الأنسجة الحيوية ضغط الغضروف هو فيزيولوجي في سلالات من حوالي 5-20٪ على تردد 1 هرتز 1،3. العديد من الدراسات التي بحثت في الآثار المترتبة على دينامية وضغط أظهرت أن يكون لها تأثير إيجابي على التمثيل الغذائي والحيوي خلية غضروفية، مما يؤثر في نهاية المطاف على الخصائص الفنية لل4-8 الأنسجة المتقدمة. في هذه الورقة، ونحن توضيح طريقة لتحفيز ميكانيكيا يبني هيدروجيل خلية غضروفية-الاغاروز تحت ضغط دينامية وتحليل التغيرات في التركيب الحيوي من خلال فحوصات الكيمياء الحيوية والنظائر المشعة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الأسلوب بسهولة لتقييم أي تغييرات محتملة في الاستجابة الناجمة الخلوية نتيجة للمؤثرات الميكانيكية.

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels at JoVE.com

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

يمكن أن تتأثر الحيوي من المصفوفة خارج الخلية الغضروفية غضروفية من قبل تطبيق محفزات الميكانيكية. يصف هذا الأسلوب أسلوب تطبيق سلالات الضغط الديناميكي للغضروفية مغلفة في بنيات 3D وتقييم التغيرات في التمثيل الغذائي الناجمة عن خلية غضروفية.

الميكانيكية حفز خلية غضروفية-الاغاروز الهلاميات المائية

Articular cartilage suffers from a limited repair capacity when damaged by mechanical insult or degraded by disease, such as osteoarthritis. To remedy ...

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Queen's University. يمكن أن تتأثر الحيوي من المصفوفة خارج الخلية الغضروفية غضروفية من قبل تطبيق محفزات الميكانيكية. يصف هذا الأسلوب أسلوب تطبيق سلالات الضغط الديناميكي للغضروفية مغلفة في بنيات 3D وتقييم التغيرات في التمثيل الغذائي الناجمة عن خلية غضروفية.

Video: Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

خارج الحي تحميل الميكانيكية للوتر

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Mechanical Stimulation of Stem Cells Using Cyclic Uniaxial Strain

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated phenomena such as bone remodeling, muscular hypertrophy, and smooth muscle cell plasticity. However, the forces involved are often extremely complex and difficult to monitor and control in vivo. To better investigate the effects of mechanical forces on cells, we have developed an in vitro method for applying uniaxial cyclic tensile strain to adherent cells cultured on elastic membranes. This method utilizes a custom-designed bioreactor with a motorized cam-rotor system to apply the desired force. Here we present a step-by-step video protocol demonstrating how to assemble the various components of each "stretch chamber", including, in this case, a silicone membrane with micropatterned topography to orient the cells with the direction of the strain. We also describe procedures for sterilizing the chambers, seeding cells onto the membrane, latching the chamber into the bioreactor, and adjusting the mechanical parameters (i.e. magnitude and rate of strain). The procedures outlined in this particular protocol are specific for seeding human mesenchymal stem cells onto silicone membranes with 10 &micro;m wide channels oriented parallel to the direction of strain. However, the methods and materials presented in this system are flexible enough to accommodate a number of variations on this theme: strain rate, magnitude, duration, cell type, membrane topography, membrane coating, etc. can all be tailored to the desired application or outcome. This is a robust method for investigating the effects of uniaxial tensile strain applied to cells in vitro.

It is widely understood that mechanical forces in the body can influence cell differentiation and proliferation. Here we present a video protocol demonstrating the use of a custom-built bioreactor for delivering uniaxial cyclic tensile strain to stem cells cultured on flexible micropatterned substrates.

الميكانيكية حفز الخلايا الجذعية عن طريق دائرى سلالة أحادي المحور

The role of mechanical forces in the development and maintenance of biological tissues is well documented, including several mechanically regulated ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

تغليف الخلوية في الهلاميات المائية للهندسة الأنسجة 3D

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to investigate cells behavior at sub-cellular level with high spatial and temporal resolution was developed. Thus, an atomic force microscope (AFM) was integrated with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy and fast-spinning disk (FSD) confocal microscopy. The integrated system is broadly applicable across a wide range of molecular dynamic studies in any adherent live cells, allowing direct optical imaging of cell responses to mechanical stimulation in real-time. Significant rearrangement of the actin filaments and focal adhesions was shown due to local mechanical stimulation at the apical cell surface that induced changes into the cellular structure throughout the cell body. These innovative techniques will provide new information for understanding live cell restructuring and dynamics in response to mechanical force. A detailed protocol and a representative data set that show live cell response to mechanical stimulation are presented.

This paper aims to instruct the reader in the operation of an integrated atomic force-optical imaging microscope for mechanical stimulation of live cells in culture. A step-by-step protocol is presented. A representative data set that shows live cell response to mechanical stimulation is presented.

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the brain, liver, retina, cochlea and vasculature. In experimental settings, intercellular Ca2+-waves can be elicited by applying a mechanical stimulus to a single cell. This leads to the release of the intracellular signaling molecules IP3 and Ca2+ that initiate the propagation of the Ca2+-wave concentrically from the mechanically stimulated cell to the neighboring cells. The main molecular pathways that control intercellular Ca2+-wave propagation are provided by gap junction channels through the direct transfer of IP3 and by hemichannels through the release of ATP. Identification and characterization of the properties and regulation of different connexin and pannexin isoforms as gap junction channels and hemichannels are allowed by the quantification of the spread of the intercellular Ca2+-wave, siRNA, and the use of inhibitors of gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-wave in monolayers of primary corneal endothelial cells loaded with Fluo4-AM in response to a controlled and localized mechanical stimulus provoked by an acute, short-lasting deformation of the cell as a result of touching the cell membrane with a micromanipulator-controlled glass micropipette with a tip diameter of less than 1 &mu;m. We also describe the isolation of primary bovine corneal endothelial cells and its use as model system to assess Cx43-hemichannel activity as the driven force for intercellular Ca2+-waves through the release of ATP. Finally, we discuss the use, advantages, limitations and alternatives of this method in the context of gap junction channel and hemichannel research.

Intercellular Ca2+-waves are driven by gap junction channels and hemichannels. Here, we describe a method to measure intercellular Ca2+-waves in cell monolayers in response to a local single-cell mechanical stimulus and its application to investigate the properties and regulation of gap junction channels and hemichannels.

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, the effect of tissue elasticity on cell function is a major area of mechanobiology research because tissue stiffness modulates with disease, development, and injury. Static tissue-mimicking materials, or materials that cannot alter stiffness once cells are plated, are predominately used to investigate the effects of tissue stiffness on cell functions. While information gathered from static studies is valuable, these studies are not indicative of the dynamic nature of the cellular microenvironment in vivo. To better address the effects of dynamic stiffness on cell function, we developed a DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel system (DNA gels). Unlike other dynamic substrates, DNA gels have the ability to decrease or increase in stiffness after fabrication without stimuli. DNA gels consist of DNA crosslinks that are polymerized into a polyacrylamide backbone. Adding and removing crosslinks via delivery of single-stranded DNA allows temporal, spatial, and reversible control of gel elasticity. We have shown in previous reports that dynamic modulation of DNA gel elasticity influences fibroblast and neuron behavior. In this report and video, we provide a schematic that describes the DNA gel crosslinking mechanisms and step-by-step instructions on the preparation DNA gels.

Our laboratory has developed DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels, a dynamic hydrogel system, to better understand the effects of modulating tissue stiffness on cell function. Here, we provide schematics, descriptions, and protocols to prepare these hydrogels.

إعداد crosslinked-DNA بولي أكريلاميد الهلاميات المائية

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. It has been discovered and rigorously studied using the patch-clamp technique for almost three decades. Its basic role of translating tension applied to the cell membrane into permeability response makes it a strong candidate to function as a mechanoelectrical transducer in artificial membrane-based biomolecular devices. Serving as building blocks to such devices, droplet interface bilayers (DIBs) can be used as a new platform for the incorporation and stimulation of MscL channels. Here, we describe a micropipette-based method to form DIBs and measure the activity of the incorporated MscL channels. This method consists of lipid-encased aqueous droplets anchored to the tips of two opposing (coaxially positioned) borosilicate glass micropipettes. When droplets are brought into contact, a lipid bilayer interface is formed. This technique offers control over the chemical composition and the size of each droplet, as well as the dimensions of the bilayer interface. Having one of the micropipettes attached to a harmonic piezoelectric actuator provides the ability to deliver a desired oscillatory stimulus. Through analysis of the shapes of the droplets during deformation, the tension created at the interface can be estimated. Using this technique, the first activity of MscL channels in a DIB system is reported. Besides MS channels, activities of other types of channels can be studied using this method, proving the multi-functionality of this platform. The method presented here enables the measurement of fundamental membrane properties, provides a greater control over the formation of symmetric and asymmetric membranes, and is an alternative way to stimulate and study mechanosensitive channels.

Bacterial mechanosensitive channels can be used as mechanoelectrical transducers in biomolecular devices. Droplet interface bilayers (DIBs), cell-inspired building blocks to such devices, represent new platforms to incorporate and stimulate mechanosensitive channels. Here, we demonstrate a new micropipette-based method of forming DIBs, allowing the study of mechanosensitive channels under mechanical stimulation.

متعددة الوظائف، طريقة Micropipette القائم لتأسيس وتحفيز القنوات Mechanosensitive البكتيرية ايون في القطرة واجهة طبقات ثنائية

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

الحنق التصوير في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

تحلل Proteolytically Alginate Hydrogels والميكروبات الهيدروفوبية ل Porcine Oocyte تغليف

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...