ومن المسلم به الدعم المالي لVECT-حورس من فون الفريدة Interministériel (مشروع FUI / MEDUL) وVECT-حورس والمختبر UMR7259 من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR، TIMPAD، VECtoBrain، VEC2Brain، ADHOC والمشاريع التعاونية PREVENTAD) . كما يقر المختبر UMR7259 الدعم المالي من CNRS وإيكس مرسيليا من جامعة.

1. إنتاج الجرذ النجمية لكل إعداد استخدام 10 فئران ويستار حديثي الولادة من كلا الجنسين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران عن طريق خفض الرؤوس مع زوج من مقص ونقلها على الفور في طبق بتري الجافة تحت غطاء تدفق الصفحي. إزالة أدمغة من الجمجمة دون المخيخ ونقلها على الفور في طبق بتري تحتوي العازلة تشريح الباردة: تستكمل HBSS مع 1٪ الأبقار مصل الزلال (مستوى منخفض من الذيفان الداخلي BSA)، البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض العقول في النصف، للفصل بين نصفي الكرة المخية (2) ونقلها إلى طبق بيتري نظيفة مع العازلة تشريح على الجليد. قطع العصب البصري وإزالة السحايا تحت stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قطعة القشرية على نطاق واسع في 50 مل من العازلة تشريح الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة القشرية من 3 العقول في أنبوب 15 مل الصقر وفصل من قبل pipetting صعودا وهبوطا انقلابلو مرات مع 10 مل ماصة المتاح مجهزة مع طرف زرقاء في 6 مل من التربسين 0.05٪ - EDTA 0.02٪ لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 24 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ والمضادات الحيوية التالية، البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل، وسائل الاعلام اسمه وسائل الاعلام الخلية الدبقية (GCM)، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT. وقد تم اختيار دفعات FBS والتحقق من صحتها لنمو وبقاء cutures نجمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية تحتوي على خلايا فصلها في 10 مل GCM وصفيحة إلى 75 سم 2 T-قارورة (T75). تغيير المتوسطة في اليوم التالي لإزالة الحطام الخلية والحمض النووي. استبدال سائل الإعلام والثقافة مرتين في الأسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 اسبوع من الانتشار، ويهز بلطف الخلايا الدبقية مع شاكر المداري في 60 دورة في الدقيقة خلال 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في GCM. إذا لا يمكن أن توضع T75 في حاضنة مع 5٪ CO 2/95٪ الهواء عند 37 درجة مئوية جو مرطب، تكملة وسائل الإعلام مع 5 ملي HEPES. غسل الخلايا مرتين لصemove خلايا دبقية غير ملتصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أسابيع من البذر، وغسل الخلايا مرتين مع DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة 3 مل من التربسين 0.05٪ الحارة-EDTA 0.02٪، واحتضان عند 37 درجة مئوية والانتظار حتى يتم فرقت طبقة الخلايا (عادة 5 دقائق). تمنع النشاط التربسين وذلك بإضافة 10 مل من GCM، ونقل تعليق خلية في 15 مل فالكون أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 120 x ج لمدة 8 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية نجمية في 90٪ FBS - 10٪ DMSO، نقلها إلى cryovials (2 × 10 6 خلايا في cryovial) وتخزينها في النيتروجين السائل. </li></ol> 2. عزل الدماغ الجرذ Microvessels تمت الموافقة على إجراءاتنا التجريبية من قبل لجنة الأخلاقيات من كلية الطب في مرسيليا وتتفق مع اللوائح الوطنية والأوروبية (توجيه الاتحاد الأوروبي رقم 86/609). تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل إعداد واحد لexperimenteص، استخدام 3 فئران ويستار خمسة أسابيع من العمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم الاثنين من الأسبوع الأول، وإعداد 2 قوارير T75 بواسطة طلاء مع نوع الكولاجين الرابع وفبرونيكتين، سواء على 1 ميكروغرام / سم 2 في الماء المعقم ثقافة (10 مل لكل T75). تسمح التمسك عند 37 درجة مئوية حتى microvessel البذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صباح يوم الأربعاء من الأسبوع الأول، الموت ببطء الفئران تحت تدفق متزايد من CO 2 للحث على النعاس، وفقدان الموقف والتنفس انقطاع، ثم تليها خلع عنق الرحم. رش رؤساء مع الايثانول 70٪. قطع الرؤوس مع زوج من مقص ونقلها إلى طبق بتري الجافة تحت غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أدمغة من الجمجمة دون المخيخ والأعصاب البصرية، ثم نقلها إلى طبق بيتري المبردة على الجليد ومليئة العازلة تشريح الباردة (HBSS تستكمل مع 1٪ BSA، البنسلين 100 وحدة / مل الستربتوميسين و100 ميكروغرام / مل) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض العقول في نصف لفصل نصفي الكرة المخية والدماغ المتوسط ​​2 منفصلة عن لebrain. نقل forebrains في طبق بتري نظيفة على الجليد مع العازلة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستغرق بضعة نصفي الكرة الأرضية في طبق بتري جديدة مع العازلة تشريح البارد لإزالة بعناية السحايا من forebrains تحت stereomicroscope مع N ° 5 ملقط المنحني. ثم، وتنظيف المناطق الداخلية من الدماغ لإزالة حاف المايلين والحصول على قذيفة من القشرة. وينبغي لهذه الخطوات لا تأخذ أكثر من 2 ساعة للحفاظ على الأنسجة وبقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل القشرة من 3 إلى 6 أدمغة مل من العازلة تشريح الباردة في 7 مل الخالط Dounce بنسبة 10 صعودا وهبوطا السكتات الدماغية مع كل من المطاحن 2 من التصاريح مختلفة، 71 ميكرومتر تليها 20 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم التعليق للحصول على ما يعادل 1 القشرة في 1 مل من 50 مل فالكون أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم تعليق من القشرة 1 مع 1 مل من محلول الأنزيمية التي تحتوي على مزيج من collagenases / dispase (60 ميكروغرام / مل R11؛ 0.3 U / مل)، الدناز النوع الأول (35 ميكروغرام / مل - 20 K وحدة / مل) والجنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) في شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 1 مل من 1 هضم القشرة مع 10 مل من 25٪ BSA / HBSS 1X ومنفصلة بواسطة الطرد المركزي كثافة تعتمد على 3،600 x ج لمدة 15 دقيقة في RT. نقل بعناية القرص العلوي (المايلين والدماغ حمة) وطاف في أنبوب 50 مل نظيفة فالكون وتكرار الطرد المركزي. الحفاظ على بيليه الناتجة تحتوي على microvessels الدماغ في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل بعناية القرص العلوي وطاف. في resuspend كل من الكريات الناتجة تحتوي على microvessels الدماغ مع 1 مل من البرد HBSS 1X ونقل إلى أنبوب 50 مل نظيفة فالكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل microvessels بإضافة 20 مل من البرد HBSS 1X وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من هضم microvessels من 1 القشرة مع 1 مل من نفس الحل الأنزيمية كما هو موضح في الخطوة 2.9 خلال 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في ركلات الترجيحالعكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، مزج microvessels هضمها من كل من 3 قشرات في أنبوب واحد وكذلك فصل إلى قسمين 50 مل أنابيب فالكون للحصول على microvessels المستخرجة من تعادل واحد ونصف (1.5) القشرة في الأنبوب. إضافة 30 مل من العازلة تشريح الباردة وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية microvessel في 10 مل من DMEM/F12 تستكمل مع 20٪ الصفيحات البقري البلازما المستمدة الفقراء في الدم، الخلايا الليفية الأساسية عامل النمو (bFGF، 2 نانوغرام / مل)، الهيبارين (100 ميكروغرام / مل)، جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) وHEPES (2.5 ملم)، واسمه وسائل الاعلام الخلايا البطانية (ECM) تستكمل مع بوروميسين في 4 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ المغلفة 2 قوارير T75 من الحاضنة، نضح تتجاوز طلاء وطبق على microvessels من كل أنبوب في واحدة قارورة T75 (microvessels المستخرجة من القشرة 1.5 في قارورة T75). </li></ol> 3. تنقية وانتشار المكتب الإقليمي Primocultures <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية: من الأربعاء إلى الجمعة، إضافة puromفايز في 4 ميكروغرام / مل إلى وسائل الإعلام والثقافة. تغيير متوسطة يوم الخميس. يوم الجمعة، وغسل الخلايا وإضافة بوروميسين في 2 ميكروغرام / مل حتى يوم الاثنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتشار: يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، وغسل الخلايا وإضافة الأنسولين، ترانسفيرين والصوديوم زيلونيت تكملة لوسائل الإعلام والثقافة حتى الثقافات تصل إلى 90٪ التقاء يوم الأربعاء من الأسبوع الثاني. </li></ol> 4 التمايز: إعداد نموذج في المختبر BBB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، وإعداد مرشحات (البولي ايثلين و12 بئرا، المسام حجم 1.0 ميكرون) من خلال طلاء مع مزيج من نوع الكولاجين الرابع وفبرونيكتين سواء في 0.5μg/cm 2 في الماء المعقم ثقافة (500 ميكرولتر من المزيج في المقصورة العلوية و 1.5 مل من الماء المعقم الثقافة في الطبقة السفلى من المقصورة). تسمح التمسك عند 37 درجة مئوية حتى المكتب الإقليمي البذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم الاثنين من الأسبوع الثاني، وذلك قبل خمسة أيام من إنشاء الثقافة المشتركة، ذوبان الجليد في الخلايا النجمية من cryovials عند 37 درجة مئوية ونقلفي فالكون 15 مل مع 10 مل GCM. الطرد المركزي تعليق في 120 x ج لمدة 8 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية نجمية في GCM وصفيحة في كثافة 30 × 10 3 خلية لكل سم 2 في لوحات 12 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأربعاء من الأسبوع الثاني، قبل تفكك المكتب الإقليمي مع التربسين، ويغسل مرتين مرشح قبل المغلفة مع DMEM/F12 المتوسط. قبل ملء الغرف مع ECM: 1.5 مل في أسفل المقصورة و 0.5 مل في المقصورة العليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم الأربعاء من الأسبوع الثاني، ويغسل مرتين مع المكتب الإقليمي DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. إضافة 4 مل من التربسين الدافئ 0.05٪ - EDTA حل 0،02٪ عند 37 درجة مئوية في قارورة T75 خلال 30 ثانية بالضبط. ثم إزالة 3.5 مل من محلول التربسين ومراقبة تحت المجهر. عندما تبدأ طبقة الخلايا لفصل من المصفوفة، ومساعدتهم من خلال استغلال بلطف حافة القارورة T75 حتى جميع الخلايا العائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 9 مل من ECM في T75 القارورة ونقل في أنبوب 15 مل الصقر. فصل بلطف جدا الخليةتعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 4 مرات مع ماصة 10 مل مزودة غيض الأصفر (تجنب إنتاج فقاعات في الحل). عد الخلايا في التعليق (حوالي 3 × 10 6 cells/T75) وطبق على الفور على مرشحات قبل المغلفة والمعبأة سلفا في مناطق ذات كثافة عالية (160 × 10 3 خلية / تصفية بالتالي ما يقرب من 18 filters/T75) (الشكل 8 ). في اليوم التالي (الخميس) مرتين تغيير وسيلة من المقصورة العلوية لإزالة الحطام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخميس الأسبوع الثاني، وقبل يوم من إنشاء الثقافة المشتركة، تحل محل وسائل الإعلام الثقافة نجمية بنسبة 1.5 مل من وسائل الإعلام التمايز (ECM مع الهيدروكورتيزون في 500 نانومتر) التي يمكن أن تستكمل مع 1/3 المتوسط ​​مكيفة من المقصورة القاعدية من السابق شارك في الثقافة (3 أيام من الاتصال بين الخلايا البطانية والخلايا النجمية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويعرف الجمعة من الاسبوع الثاني كما في اليوم 0 من التمايز؛ استبدال سائل الإعلام والثقافة من كونتا الفلاترining في المكتب الإقليمي مع وسائل الإعلام التمايز. نقل المكتب الإقليمي الفلاتر في الآبار التي تحتوي على الخلايا النجمية. في ظل هذه الظروف، في المختبر نماذج التفريق والتعبير عن البروتينات المرتبطة مفترق خلال 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نماذج حفاظ على التمايز الأمثل خلال 3 أيام أخرى، وبين الاثنين والاربعاء من الاسبوع الثالث. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

وضعت العديد من الأدوية لعلاج الجهاز العصبي المركزي (CNS) اضطرابات غير قادرين على الوصول إلى لحمة الدماغ في تركيزات ذات الصلة علاجيا. ويحمي الدماغ BBB النسيج العصبي من تذبذب تكوين البلازما، من العوامل الممرضة، ويحافظ على التوازن من لحمة الدماغ عن طريق تقييد تدفق غير محددة من الأيونات، والببتيدات والبروتينات وحتى الخلايا داخل وخارج الدماغ 1. وبفعل الخصائص BBB والتي تحتفظ بها القرب الحميم وعبر الحديث بين الطبقة المتخصصة microvessel الدماغ الخلايا البطانية والعناصر المجاورة من حدة العصبية الدبقية والأوعية الدموية (NGVU) مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية (على نحو أدق نجمية نهاية أقدام)، وpericytes مغمد في الغشاء القاعدي الذي يتألف أساسا من نوع الكولاجين الرابع، فبرونيكتين، laminin والبروتيوغليكان 2،3. Pericytes تغطية حوالي 22 - 32٪ من البطانة على المستوى الشعري وتضطلع بدور هامدور في تنظيم انتشار البطانة، الأوعية الدموية والعمليات الالتهابية. الخلايا البطانية تشكيل ورقة المستمر الذي يغطي السطح الداخلي للالشعيرات الدموية. مترابطة من قبل TJS، والتي تشكل بنية تشبه الحزام في المنطقة القمية والتي تسهم في الاستقطاب الخلية. الخلايا النجمية تنظيم خصائص BBB ومصادر من العوامل التنظيمية الهامة مثل TGF-β، GDNF، bFGF وIL-6. الخلايا النجمية نقص في GFAP مع وظيفة غير مكتملة ليست قادرة على تنظيم خصائص BBB 4. الخلايا العصبية لا يشاركون مباشرة هيكليا في تشكيل BBB ولكن أيضا تنظيم جوانب هامة من البروتين التعبير وظائف BBB 5. من أجل مواصلة دراسة بنية، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من BBB، وقد وضعت في المختبر نماذج من BBB كأدوات للبحث. وقد تم استخراج الخلايا البطانية الدماغ من الأنواع المختلفة لتنفيذ نماذج في المختبر BBB مقرهاعلى انخفاض مرور الثقافات الأولية من الأبقار 6،7، 8،9 الخنازير، الفئران 10،11،12، والماوس 13 وأيضا الإنسان 14،15. ومن المعروف أن هذه النماذج لمحاكاة في الجسم الحي BBB، ولا سيما عندما شارك في تربيتها مع الخلايا الدبقية من الفئران أو الفئران و / أو pericytes 16،12، و / أو السلف المستمدة من الخلايا النجمية العصبية 17 و / أو الخلايا العصبية 18. غالبا ما تنتج نماذج &quot;في مختبر&quot; من القوارض لأنها تسمح في المختبر / في التجارب المجراة ومقارنات و / أو دراسة الخلايا البطانية الدماغ المنتجة من النماذج المعدلة وراثيا 19. وضعت حديثا في نماذج BBB المختبر كما تم تصميمها للمساعدة في التنبؤ امتصاص الدماغ من المرشحين المحتملين للمخدرات CNS قبل في الجسم الحي اختبار 15،20،21،3،6،22،11،23. وعادة ما تستخدم في المختبر نماذج BBB للمقارنة نقل المخدرات مع: ط) المعروف تغلغل في الجهاز العصبي المركزي أو مع لترآه نفاذية عبر BBB وليس له آثار المركزية، والثاني) الظاهر بي من نفس العقاقير قياس في النماذج الحيوانية من نفس النوع. الأدوية التي تمر بسهولة BBB هي في معظمها محبة للدهون وعبور أغشية الخلايا البطانية الدماغ عن طريق بوساطة الدهون نشرها مجانا (الكافيين، كاربامازيبين، الخ). المخدرات تنقل سلبا مثل الديجوكسين، فيراباميل أو السيكلوسبورين A تنبثق بنشاط الدماغ البطانية نقل هروب رأس المال مثل P-GP. ومع ذلك، فإن العديد من الجزيئات العلاجية المطورة حديثا هي المستحضرات الصيدلانية البيولوجية، مثل البروتينات المؤتلف، الرناوات siRNAs أو الاجسام المضادة. معظمهم لا عبور BBB بسبب: أ) عدم وجود نقل معينة، والثاني) طبقة معبأة بإحكام من الخلايا البطانية التي تمنع الجزيئات عالية الوزن الجزيئي من تمر مرور paracellular. مع هذه الحدود، وقد تم تنفيذ استراتيجيات &quot;حصان طروادة&quot; باستخدام ناقلات (الأجسام المضادة، الببتيدات) ضد مستقبلات المعروفة في BBB، والمشاركة طن مستقبلات بوساطة النقل أو transcytosis (RMT)، مثل ترانسفيرين (TF) مستقبلات (TFR)، ومستقبلات الأنسولين (IR)، أو أعضاء من مستقبلات LDL (LDLR) المتعلقة بالأسرة مستقبلات (LDLR، LRP1). تم العثور على هذه المستقبلات على الشعيرات الدموية في الدماغ ومعزولة في BBB في الجسم الحي 24،25. ملامح النسخي لهذه المستقبلات، ولا سيما تلك الأسرة LDLR، تم تحليل ومقارنة بين الخلايا البطانية الدماغ والخلايا البطانية الدماغ شارك في تربيتها مع الخلايا النجمية أو في الشعيرات الدموية في الدماغ مباشرة بعد استخراجها من الدماغ 26. Pardridge 24 فتح المجال مع الأجسام المضادة OX-26 ضد مستقبلات ترانسفيرين (TFR)، تليها أجسام مضادة ضد مستقبلات الانسولين والانسولين مستقبلات عامل النمو 27،28. مع هذه النواقل مقرها الأجسام المضادة، وقد وضعت تقنيات ArmaGen لBBB الجزيئية طروادة الحصان منصة تكنولوجيا لتوصيل الأدوية، بما في ذلك البروتينات، عبر BBB 29. الالأدب غنية في التعبير LRP1 بيانات تظهر في الخلايا البطانية الدماغ ودورها بوصفها قوية التقامي / زبال مستقبلات. اقترح تحليل لطخة غربية أن يتم التعبير عن LRP1 في الكسور المخصب في الشعيرات الدموية في الدماغ والمخ في الفئران الخلايا البطانية الشعرية 30. شركات مثل Angiochem الهدف LRP1 مع ناقلات الببتيد المستمدة من أبروتينين التي تعزز كفاءة تدفق المخدرات عبر BBB 31. ومع ذلك، وتشارك أيضا في LRP1 النقل النشط من Aβ وهروب رأس المال في / تصريح من الدماغ لحمة الدم 32. تنطوي هذه البيانات LRP1 في نقل ثنائي الاتجاه عبر BBB اعتمادا على بروابط لها. biOasis تطور التكنولوجيا تجاوز باستخدام melanotransferrin البروتين لنقل البيولوجية مثل الانزيمات الليزوزومية والأجسام المضادة عبر BBB-33 بينما VECT حورس تطور ناقلات الببتيد التي تستهدف LDLR 34. هناك بيانات تشير إلى أن الدوريات طويلة المدى وLDLR يمكن استخدامها لنقل فرقجزيئات erent مثل الانزيمات الليزوزومية 35،36 المجمعات أو جسيمات متناهية الصغر عبر BBB 37. لدينا مجال الاهتمام هو تسليم المخدرات الى الجهاز العصبي المركزي باستخدام جزيئات النواقل وvectorized-المرشحين المخدرات لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي. على وجه الخصوص، تسليم المخدرات عبر BBB لابد من النظر في سياق neuroinflammation، وهي العملية التي قد تختلف في مداها، ولكن ربما كان هذا هو مشترك بين جميع الآفات والأمراض الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التهاب الدماغ، والتصلب المتعدد، ومرض الزهايمر الخ Neuroinflammation ويرتبط مع التهاب BBB وربما مع تغييرات في وظائف الأعضاء ونفاذية BBB معتبرا أن paracellular والنقل العابر للخلايا يمكن تضخيمها في الحالات المرضية 38،39،40،41،42،43. على سبيل المثال، TNF-α، القرص، والسيتوكينات الأخرى تعدل الالتهاب، وأظهرت التجارب في المختبر مع نماذج BBB أنها يمكن أن يغير خصائص paracellular من اله البطانية أحادي الطبقة خلية 38،39،40 والتي TNF-α يؤدي أيضا إلى زيادة في النقل العابر للخلايا من LDL 41، 42 holotransferrin واللاكتوفيرين 43. كان هدفنا لتطوير وتميز على الوجه الأمثل، وتكرار للغاية مسانج الفئران BBB النموذج باستخدام المشترك الثقافات من الخلايا البطانية الدماغ الأولية والخلايا النجمية. كنا فئران ويستار القديمة 5 أسبوع وحديثي الولادة لإنتاج الخلايا البطانية الدماغ والإنتاج نجمية على التوالي. كان واحدا تحديا لوضع بروتوكول يسمح للإنتاج &quot;استنساخه الأسبوعية&quot; نماذج BBB. للوصول إلى هذا الهدف، تم تنفيذ كل خطوة من بروتوكول الإنتاج في أيام محددة من الأسبوع، بدءا من إنتاج microvessel المخ يوم الأربعاء من الأسبوع الأول. أجريت تشريح كل أسبوع تقريبا خلال السنوات ال 3 الماضية. لزيادة تحسين استنساخ الثقافات، تم إنشاء نظام لضمان الجودة. جميع reagenوالمشار إليه البحوث والمواد الكيميائية في قاعدة بيانات (تاريخ الدخول، الأوراق المالية، ومدة الصلاحية، وغيرها). وقد تميزت نموذج التالية عددا من المعايير، مثل المنظمة الخلايا البطانية والنقاء، طير، LY النفاذية، ردا على وكلاء الموالية للالتهابات، والتعبير النوعي والكمي للبروتينات TJ، وظائف من الناقلين هروب رأس المال مثل P-GP، ومستقبلات المشاركة في transcytosis عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية مثل معدل الخصوبة الاجمالي أو LDLR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​ينظم تحديدا تدفق الجزيئية والخلوية بين الدم والأنسجة العصبية. كان هدفنا لتطوير وتميز مسانج الفئران تكرار للغاية في نموذج المختبر من BBB باستخدام المشترك الثقافات من الفئران الخلايا البطانية الدماغ الأولية (المكتب الإقليمي) والخلايا النجمية لدراسة مستقبلات المشاركة في transcytosis عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية. تم عزل الخلايا النجمية عن طريق تشريح الميكانيكية التالية الهضم التربسين وجمدت في وقت لاحق شارك في الثقافة. تم عزل المكتب الإقليمي من القشور الفئران القديمة 5 أسابيع. تم تنظيف أدمغة السحايا والمادة البيضاء، وفصلها ميكانيكيا التالية الهضم الأنزيمية. بعد ذلك، تم طرد جناسة الأنسجة في ألبومين المصل البقري لفصل أجزاء السفينة من النسيج العصبي. خضع شظايا سفينة الهضم الأنزيمية الثانية إلى الخلايا البطانية خالية من المصفوفة خارج الخلية الخاصة بهم. تم جمعة المتبقية الخلايا تلويث مثل pericytesurther القضاء عليه من خلال طلاء شظايا في microvessel التي تحتوي على بوروميسين المتوسط. كانوا ثم passaged على مرشحات لاشتراكهما في الثقافة مع الخلايا النجمية نمت على الجزء السفلي من الآبار. أعرب المكتب الإقليمي مستويات عالية من مفرق ضيق (TJ) البروتينات مثل occludin، claudin-5 وZO-1 مع توطين نموذجية في حدود الخلية. وصلت إلى المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) من الدماغ الطبقات الوحيدة البطانية، مما يدل على ضيق TJS 300 أوم · 2 سم في المتوسط. كانت معاملات نفاذية البطانية (PE) لوسيفر الصفراء (لي) استنساخه للغاية بمتوسط ​​قدره 0.26 ± 0.11 × 10 -3 سم / دقيقة. أعرب الخلايا البطانية في الدماغ التي تنظم في الطبقات الوحيدة للهروب رأس المال نقل ف بروتين سكري (P-GP)، أظهر النقل الاستقطاب من رودامين 123، ويجند لP-GP، وأظهر النقل المحددة من ترانسفيرين-CY3 وDiILDL عبر أحادي الطبقة الخلية البطانية. في الختام، ونحن نقدم بروتوكول للإقامة في المختبرنموذج BBB التي هي تكرار للغاية نظرا لأساليب ضمان الجودة، والتي هي مناسبة للبحث في نقل BBB والمستقبلات.

Watch this Scientific Journal Video about Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport at JoVE.com

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

كان الهدف من هذه الدراسة للتحقق من صحة استنساخ لنموذج BBB في المختبر تنطوي على الفئران مسانج شارك في ثقافة من الخلايا البطانية والخلايا النجمية. أحادي الطبقة الخلية البطانية قدم عالية ومنخفضة النفاذية طير LY. التعبير عن البروتينات TJ محددة، تم تقييم الاستجابات الوظيفية للالتهاب وظائف النقل والمستقبلات.

وضع ما يصل إلى<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الفئران حاجز الدم في الدماغ (BBB): التركيز على BBB عدم النفاذ والنقل مستقبلات بوساطة

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.2K Views.  VECT-HORUS SAS.  كان الهدف من هذه الدراسة للتحقق من صحة استنساخ لنموذج BBB في المختبر تنطوي على الفئران مسانج شارك في ثقافة من الخلايا البطانية والخلايا النجمية. أحادي الطبقة الخلية البطانية قدم عالية ومنخفضة النفاذية طير LY. التعبير عن البروتينات TJ محد...

Video: Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

التصوير بالرنين المغناطيسي موجهة تعطيل حاجز الدم في الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة عبر الجمجمة في نموذج الفئران

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

للسماح المستهدفة نموذج الفئران من تعطيل حاجز الدم في الدماغ التداوي عائي عصبي

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه<em&gt; في المختبر</em&gt; صدمة إصابات الدماغ نموذج من حاجز الدم في الدماغ

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

الأوكسجين الجلوكوز الحرمان وعودة التأكسج باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; الإسكيمية-ضخه من الإصابات نموذج لدراسة الدم في الدماغ الحاجز الجنسي لدى الرجال

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

بالون إصابة الفئران السباتي نموذج لاختبار التداوي إعادة عرض لمكافحة الأوعية الدموية

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

الإجراءات في يحفز الزرق<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج الفأر وجبل لالجامع إعداد الشبكية

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

فحص نقل الخلايا البطانية كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الشبكي الداخلي

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...