VECT-HORUSへの財政支援は、フォンユニークInterministériel（FUI / MEDULプロジェクト）から承認され、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR、TIMPAD、VECtoBrain、VEC2Brain、ADHOCとPREVENTAD共同プロジェクト）からとUMR7259の実験室ホルスVEC​​Tする。 UMR7259研究所もCNRSからエクスマルセイユ大学からの財政支援を認めるものです。

ラットアストロサイトの1。生産各調製のためのセックスのどちらかの10新生児のWistarラットを使用しています。 <ol><li>ハサミで頭部を切断したラットを犠牲にし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にすぐに転送します。小脳なしに頭蓋骨から脳を取り出して、冷たい解剖バッファーを含むペトリ皿にそれらをすぐに転送する：HBSSを1％ウシ血清アルブミン（エンドトキシン、BSAの低レベル）、100μg/ mlのペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシンを補充した。 </li><li> 2大脳半球を分離し、氷上で解剖バッファーで清潔なペトリ皿にそれらを転送するために、半分に脳を切った。視神経をカットし、実体顕微鏡下で髄膜を除去します。 </li><li>冷たい解剖バッファーの50ミリリットルで広く皮質の部分を洗ってください。 </li><li> 15ミリリットルファルコンチューブに3脳からの皮質の部分を配置し、ピペッティングにより解離し、クーデターダウンル回、10 mlの0.05％トリプシン6mlの中に青色チップを備えた使い捨てピペット - EDTA、37℃で5分間0.02％ </li><li> 24 10％FBSを添加したDMEM mlの以下の抗生物質、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの、グリア細胞培地（GCM）という名前のメディア、そして室温で5分間300×gで遠心分離器を追加します。 FBSバッチはアストロサイトcuturesの成長と生存のために選択され、検証された。 </li><li> 75cm 2の Tフラスコ（T75）に10ミリリットルのGCMとプレートの解離した細胞を含むペレットを再懸濁します。細胞の破片やDNAを除去するために、次の日に培地を変更します。週に2回培養液を交換してください。 </li><li>増殖の1週間後、そっとGCM中37℃で24時間の間に60 rpmでオービタルシェーカーでグリア細胞を振る。 T75は、37℃加湿雰囲気において、5％CO 2/95％空気のインキュベーター内に配置できない場合は、5mMのHEPESを含む培地を補う。 R 2回細胞を洗浄非付着性ミクログリア細胞を残したまま削除。 </li><li>播種から3週間後に、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を2回洗浄します。 、温かいトリプシン3mlの0.05％-EDTA 0.02％の追加、37℃でインキュベートし、細胞層が分散するまで待つ（通常は5分）。 8分間、120×gで15ミリリットルのFalcon遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、GCMを10mlを添加してトリプシン活性を阻害する。 </li><li> 90％FBS中で星状細胞ペレットを再懸濁し、10 - 10％のDMSO、液体窒素中で（2×10 6個のクライオバイアル当たり細胞）およびストアクリオバイアルにそれらを転送する。 </li></ol>ラット脳微小血管の2。分離我々の実験手順は、マルセイユの医学部の倫理委員会によって承認され、国家と欧州の規制（EU指令第609分の86）に適合している。すべての努力が動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減らすために行われた。 <ol><li>各製造方法および1 experimente用R、3 5週齢のWistar系ラットを使用しています。 </li><li>最初の週の月曜日には、両方の無菌培養水に1μgの/ 2程度（T75あたり10ミリリットル）で、IV型コラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングすることにより、2 T75フラスコを準備します。微小血管播種まで37℃で接着させる。 </li><li>最初の週の水曜日の朝、頸椎脱臼に続いて、その後、姿勢と呼吸の中断の損失を眠気を誘発するために、CO 2の増加フラックス下にラットを安楽死させる。 70％エタノールで頭をスプレーします。ハサミで頭をカットし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にそれらを転送します。 </li><li>氷上で冷却し、冷たい解剖緩衝液で満たされたペトリ皿にそれらを転送して、小脳および視神経ことなく頭蓋骨から脳を削除する（HBSSは1％のBSA、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの添加） 。 </li><li>用から2大脳半球と別々の脳を分離するために半分に脳をカットebrain。解剖用緩衝液で氷上でクリーンなペトリ皿に前脳を転送します。 </li><li>慎重にN°5の湾曲鉗子で実体顕微鏡下で前脳から髄膜を除去するために冷たい解剖バッファを持つ、新しいシャーレに半球のカップルを取る。その後、ミエリンの羽毛布団を削除して、皮質のシェルを得るために、脳の内部を清掃してください。これらのステップは、組織保存と細胞生存のために2つ以上の時間を取るべきではありません。 </li><li> 20ミクロンに続く異なるクリアランスの2杵のそれぞれとストローク上下に10、71ミクロンで7ミリリットルダウンスホモジナイザー冷解剖バッファーの6ミリリットルに3脳から皮質を解離する。 </li><li>室温で5分間千×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機の1ミリリットル中1皮質と同等のものを得るために、サスペンションを分割。上清を捨てる。 </li><li>コラゲナーゼ/ディスパーゼ（60μg/ mlのRの混合物を含む酵素溶液1mlを1皮質からサスペンションダイジェスト11; 0.3 U / ml）を、DNアーゼI型（35μg/ mlの - 20 K単位/ ml）およびゲンタマイシン（50μg/ ml）を37℃で30分間、シェーカーで</li><li> 1は、25％のBSA / HBSS 1X 10mlで1皮質から消化し、室温で15分間3600×gでの密度に依存する遠心分離による独立したミリリットル混ぜる。慎重にきれいな50ミリリットルファルコンチューブにアッパーディスク（ミエリンと脳実質）、上清を転送し、遠心分離を繰り返します。 4℃で脳の微小血管を含む得られたペレットを保つ</li><li>慎重にアッパーディスク、上清を捨てる。冷HBSS 1X 1mlで脳の微小血管を含む両方の得られたペレットを再懸濁し、きれいな50ミリリットルファルコンチューブに移す。 </li><li> 5分間1,000×gで、20冷HBSS 1X mlの遠心分離を加えることにより微小血管を洗ってください。上清を捨てる。 </li><li> SHで、37℃で1時間の間にステップ2.9で説明したように、さらに同じ酵素溶液1mlを1皮質から微小血管ダイジェストアーカー。 </li><li>その後、1チューブに3皮質のそれぞれから消化微小血管をミックスし、さらにチューブあたり1年半（1.5）皮質に相当から抽出された微小血管を得るために、2 50ミリリットルファルコンチューブに分離。室温で5分間1,000×gでの冷解剖バッファと遠心機の30ミリリットルを追加します。 </li><li> 20％のウシ乏血小板血漿由来血清、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、2 ng / mlの）、ヘパリン（100μg/ ml）を、ゲンタマイシン（50μg/ ml）を補充したDMEM/F12 10ml中の微小血管ペレットを再懸濁およびHEPES（2.5 mM）を、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンで補充した内皮細胞培地（ECM）と呼ば。 </li><li> 、インキュベーターから2コーティングされたT75フラスコを取り、コーティングの過剰を吸引し、1 T75フラスコ（T75フラスコあたり1.5皮質から抽出された微小血管）に各チューブから微小血管プレート。 </li></ol> RBEC Primoculturesの3。精製及び増殖<ol><li>精製：水曜日から金曜日まで、puromを追加ycin培地に4μg/ mlの時。木曜日にメディアを変更します。金曜日に、月曜日までの2μg/ mlで細胞を洗浄し、ピューロを追加します。 </li><li>増殖：第二週の月曜日に、細胞を洗浄し、培養物は第二週の水曜日に90％の集密度に達するまで培養培地にインスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを追加します。 </li></ol> 4分化： インビトロ BBBモデルの設定<ol><li>第二週の月曜日、両方の無菌培養水中の0.5μg/cm2上部コンパートメント内のミックス（500μLでIV型コラーゲンとフィブロネクチンのミックスでコーティングすることにより、フィルター（ポリエチレン、12井戸、孔サイズ1.0μm）を用意と下部コンパートメント内の無菌培養水の1.5ミリリットル）。 RBEC播種まで37℃で接着させる。 </li><li>二週目の月曜日には、5日間共培養の確立の前に、37℃、転送時クライオバイアルからアストロサイトを解凍10ミリリットルGCMと15ミリリットルファルコン中。室温で8分間120×gでサスペンションを遠心分離する。 </li><li> 12ウェルプレート中で1cm 2当たり30×10 3細胞の密度でプレートし、GCMにおける星状細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>第二週の水曜日は、ちょうどトリプシンでRBECの解離の前に、DMEM/F12培地で2回プレコーティングされたフィルターを洗浄。下部コンパートメント内の1.5ミリリットルと上の区画に0.5ミリリットル：ECMとチャンバーを事前に記入してください。 </li><li>二週目の水曜日には、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで二回RBECを洗う。正確に30秒の間にT75フラスコあたりの37℃でのEDTA 0.02％溶液 - 暖かいトリプシン4ミリリットルの0.05％を追加します。その後、トリプシン溶液3.5ミリリットルを削除して、顕微鏡下で観察します。細胞層は、マトリックスからデタッチし始めると、すべてのセルは、フローティングされるまで静かにT75フラスコの端をタップすることで彼らを助ける。 </li><li> T75フラスコあたりのECMの9ミリリットルを加え、15ミリリットルファルコンチューブに移す。非常に静かに細胞を解離黄色のチップを搭載した10ミリリットルピペットで4回上下にピペッティングして懸濁液（溶液中の気泡の発生を避けるため）。懸濁液中の細胞（約3×10 6 cells/T75）をカウントし、すぐに高濃度（160×10 3細胞/フィルターゆえ約18 filters/T75）（ 図8で予備コーティングし、プレフィルフィルターにプレート）。翌日（木曜日）、細胞破片を除去するための上部コンパートメントの二倍の媒体を変更してください。 </li><li>第二週の木曜日、共培養の確立前日、基礎コンパートメントから1月3日馴化培地を補充することができる分化培地（500nmにおけるヒドロコルチゾンとECM）の1.5ミリリットルでアストロサイトの培養液を交換してください前の共培養（内皮細胞とアストロサイトとの間の接触の3日間）の。 </li><li>二週目の金曜日は、分化の0日として定義されます。フィルタコンタから培養培地を交換分化培地でRBEC ining。アストロサイトを含むウェルにRBECフィルターを転送します。これらの条件下で、in vitroモデルは、分化し、3日以内に接合関連タンパク質を発現する。 </li><li>モデルは、第三週の月曜日と水曜日の間、3日以上の間、それらの最適な分化を維持する。 </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

私たちは、RBECの精製および培養後、さらに特徴的なBBB特性を用いたin vitro BBBモデルを生成するために、初代ラットアストロサイトとの共培養のセットアップ、脳の微小血管の分離と、めっきのための週刊再生可能なプロトコルの実装について説明します。 首尾体外 BBB培養で標準化を確立するプロセスの複数の連続的なステップで最適な条件を必要とする。モデルは、（A） のin vitro BBBモデルの「聖杯」のままで、最低傍細胞透過性を得るために最適化され、（b）の流出およびRMTメカニズムを検証した。 RBECの生産、精製及び増殖 RBEC栽培の最大の課題は、異なる文化間の再現性を達成することである。プロトコルの標準化は、DISのための高品質なツールが必要ですセクション、高品質の試薬および試薬の有効期限に関して。実験者は、皮質表面からの髄膜および大血管の迅速な除去のために実体顕微鏡下で顕微解剖の熟練される必要がある。脳を単離して、機械的に分離されると、大きな課題の一つは、新たに単離した脳の微小血管の最適な酵素消化である。使用される酵素の種類と品質が重要です。バッチ間の低い変動性を有する高濃度のコラゲナーゼ·タイプIとIIとディスパーゼの組み合わせを使用した。また、重要な酵素消化の持続時間および酵素濃度/消化の組織重量/体積の比である。脳の微小血管の生産の最高の収率は30分、1時間、それぞれ、両方の消化中に60μg/ mlので混合ディスパーゼ/コラゲナーゼの1ミリリットル中に1脳から皮質に相当して得られた。 また、重要な細胞を汚染の排除であるS（アストロサイト、主に周皮細胞）。これらの細胞は、内皮細胞よりも速い速度で増殖し、良好な傍細胞拘束性と均一な細胞単層の確立を防止し、後者でタイトジャンクショ​​ンを確立していない。非内皮細胞が除去されている間、脳内皮細胞が微小血管に見出される他の細胞型と比較して、排出ポンプ、特にP-gpのはるかに高いレベルで発現することを考慮すると、それらは、P-gpのリガンド薬物のそれ以外の毒性濃度をより良く耐える。最初の二日間、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンでの処理は、良好な内皮細胞の純度を得るために2μg/ mlの少なくとも2日間続いた。この選択には、細静脈、前毛細血管動脈以上の微小血管からのものと比較毛細血管内皮細胞を支持し、より緊密な単層につながることができます。また、貧しい人血漿由来ウシ血清の使用は、内皮細胞47,48の純粋培養を得ることが不可欠です。プラズマデアived血清は、平滑筋細胞および周皮細胞のために、従って、線維芽細胞に対して分裂促進性である血小板由来増殖因子（PDGF）を欠く。 我々は、マウス由来のIV型コラーゲンの混合物を有するプラスチックとフィルタの治療及びヒトフィブロネクチンは、ラットの尾から伝統的に推奨されるコラーゲンタイプIと比較して、増殖収量の2倍の増加で、重要な利点をもたらすことを観察した。細胞増殖のための重要な手がかりは、インテグリンおよび増殖因子（bFGF）の活性化などの細胞外マトリックス49によって提供される。培地の緩衝液濃度及びpHは、傍細胞気密50に積極的に影響を与えることが記載されており、我々は、少なくとも5mMのHEPES緩衝液を添加して培養物との間の良好な再現性が観察された。 挿入フィルター上の共培養設立：RBECの分化 脳内皮細胞は、BたらEENを精製し、6日間増殖し、これらはフィルター上に播種することができる。高密度細胞播種は完璧な単層を得るために重要である。 12ウェルプレートフィルター当たり160x10 3細胞の播種密度で播種後のコンフルエントな単層を24時間を得るために必要かつ十分であった。しかしながら、その環境からの一次脳毛細血管内皮細胞の単離は、それが一次細胞、および特に脳毛細血管内皮細胞は、強く、環境によって調節および誘導因子はによって産生されることが知られているように、BBB のin vitroモデルの構築におけるパラドックスである異なる周囲の細胞型。脳毛細血管内皮細胞は、単独で急速に脱分化を培養し、いくつかの特定の脳内皮マーカーを失う。このように、一次内皮細胞は、低継代（P1）で使用されるべきであり、再接続された、少なくとも部分的に、星状細胞により馴化星状細胞47,51又は媒体との共培養によるそれらの環境と。これが成立脳内皮細胞とアストロサイトのようなアストロサイト分化のための真の双方向の誘導に関与している。アストロサイトとのRBECを培養するinterendothelial TJ 52,23の強い誘導につながった。再誘導の分子機構はほとんどわかっていない、と研究は、最適な内皮細胞分化53,54を促進することができアストロサイトから分泌される特定の変調因子を特定するためにいくつかの研究室で進行中である。白血病抑制因子（LIF）を含む、脳内皮細胞によって分泌される因子は、アストロサイト分化55,56を誘導することが示されている。共培養の確立の前に、星状細胞を分化グルココルチコイド受容体アゴニストヒドロコルチゾンを含む培地と共培養馴化培地に曝露した。ヒドロコルチゾンは、脳内皮細胞の気密性 ​​を向上させることが知られており、特にラットおよびマウス57 58,59内皮細胞からBBBモデルにおいて使用される。エアコンMEDIウム3日後、内皮細胞/アストロサイトの共培養系の下部区画から回収し、後の使用のために凍結される。共培養条件培地の使用は、2日以上のための最適な傍細胞透過性と文化の間も改善再現性の3日前の内皮細胞分化の時間を減少させた。 全体的に、我々が説明するプロトコルは、0.26±0.11×10 -3センチ最高の一次電池ベースのBBBモデル22と同様/分の300オーム以上の再現性TEER·cm 2であり、平均傍細胞透過係数PE（LY）が得られる12。我々は微小血管酵素消化の提案された変調に本原稿に記載するプロトコルは、ラットの脊髄60から、およびマウス脳から内皮細胞に拡張することができる。 分子·機能解析 加えてTJ誘導のために、星状細胞はまた、脳内皮細胞における61 P-gpのような排出トランスポーターの発現に寄与する。我々は、実際にBBBモデルにおける排出トランスポーターP-gpの発現を示し、我々は、生化学的アプローチを用いて、P-gp排出ポンプ局在化、および機能的アッセイを用いてP-gpの活性の極性を示す。 GLT-1の発現は、微小血管の基底膜画分に検出されたが、培養されたRBECでは検出されなかった。私たちは、GLT-1がダウンウエスタンブロット分析によって検出可能なin vivo条件下 、結果的にはないと比較して、当社のRBEC培養でレギュレートされたと仮定した。過剰なグルタミン酸が神経毒性であり、 生体内で、GLT-1は、先端区画（血液循環）に基礎コンパートメント（実質）からのグルタミン酸流出を担当しています。星状細胞培養物においては、GLT-1発現は非常に低いままであり、媒体62,63にグルタミン酸を添加することによって誘導される。 またをconfこのようなLRP1、LDLRとのTfRなどの頂端膜に流入輸送体の発現をIRM。のTfRとLDLRの機能は、以前に体外 BBBモデル64 のウシで示すように、単層の反管腔側に腔側からTF-Cy3およびDiLDLの結合実験および輸送に実証された。興味深いことに、星状細胞からの脂質の要件が65,66は、さらに、インビトロで含む、星状細胞および脳内皮細胞との間の生理学的なクロストークを確認する脳毛細血管内皮細胞上のLDLRの発現を増加させることが示されている。我々は、蛍光色素で搬送を例示するために選択したようなCy3及びDIIを使用する蛍光分光分析は、ほとんどの実験室で提供され、 体外BBBモデルで検証するために有用であることを証明できることを考えるととして。しかしながら、蛍光の定量化は、放射能よりもはるかに感度が低いと有意なデータを得るための実験の数の増加を必要とする。理想的には、TFおよびLDLは通常、このような結合/取り込み及び輸送実験のための（ヨウ素125）の放射性標識である。 また、CCL2リリースとBBBの開放によって明らかにされるように提案されたプロトコルを用いて得られた分化した内皮細胞単層は、TNF-αによって誘導される炎症に反応することを示している。 CCL2（MCP-1）およびその受容体CCR2が、多発性硬化症などのCNS ​​病理に関与している、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）67、CNS外傷68とは、神経炎症条件下69,70の下でCNSへの白血球遊走メディエーターとして知られている。 BBBの開口部がCCL2濃度が上（頂端）と下位（基礎）の区画の両方の間で平衡化することができるため、テストのプロトコルでは、我々のCCL2偏分泌に結論付けることはできません。その結果、我々は明らかに、24時間（ 図5A）で、頂端区画内にRBECによって生成CCL2の量を過小評価しています。 一般概要とin vitroモデル BBBの制限：人間の比較に対するインビトロおよびげっ歯類に対するI Nビボ in vitroでのBBB通路に有効であることが証明され、多くの有望な中枢神経系薬は、多くの場合、ヒト以外の種から単離された細胞に基づいて体外 BBBモデルで預け予測可能性の欠如のために臨床試験に失敗しました。それはタンパク質ネットワーク、シグナル伝達、トランスポーターと受容体の機構的な側面を研究することになると我々の知る限り、 生体外 BBBモデルは、おそらくより予測となる。 in vitroで研究するためにあらゆるメカニズム、経路またはターゲットは、同じ動物種との相補的な環境合図（他の細胞型、化学物質、蛋白質）によるその調節のために特徴づけられ、 その場での研究にするために結合する必要がある、および可能な場合は、下記の誘発の制限、注意して、ヒトから分離された微小血管内皮細胞を用いた。 in vitroでのBBBモデルは、ボディの規制から分離自律システムとして見られることがありますが、まだ主要なin vivoでの特性や環境の合図による規制の可能性に恵まれている。内皮細胞単層は、神経グリア血管部（NGVU）の重要な構成要素の数を欠き、血液及び身体調節から単離されているので、インビトロ BBBモデルには「理想的な」は、まだ71,72,73提案されていない。周皮細胞のニューロン17,18又は74,16又はプラスチックコーティングまたは内皮に基づいて、最も一般的で、「最も簡単な製「 インビトロ BBBモデルにおける細胞増殖に用いられる培地および血清に用いられる細胞外マトリックスの種々の成分の欠如アストロサイトに分化した細胞は、タンパク質の発現を調節することができるiのN in vivo の状況75との比較。これらのモデルは、 生体内で表示された多くのトランスポーターを発現し、すべてではなくてもよい。いくつかの場合において、トランスポートパラメータは、第離された微小血管（ インビボ状況に最も近い）で確認した後、細胞培養系76,61において研究。 分子生物学的研究が可能となった同じ種から単離された微小血管と低通過内皮細胞培養における遺伝子およびタンパク質の発現特性評価、異なる種の間で、最も頻繁にそのようなげっ歯類（マウスおよびラット）またはin牛や豚からの小動物から人間77,78,75,15との比較。 in vivoおよびin vitroの脳の微小血管内皮細胞におけるトランスクリプトームの間の比較は、示差的に発現され、最も頻繁にインビトロで有意にダウンレギュレートされた多数の遺伝子転写物を示した。などのTfRやPRなどの流入輸送体をコードする転写小胞輸送に関与oteinsは主に細胞内のエンドサイトーシスおよび小胞輸送の一般的な減少を示唆して、培養された脳内皮細胞において下方制御されています。純度（ピューロマイシン処理）及びヒドロコルチゾンを用いた治療の面で培養操作は、より「 インビボ様」遺伝子発現プロファイル77を復元するのに役立ち得る。トランスクリプトームの研究はまた、さらに体外 BBBモデル75 内の齧歯類に基づいて、ヒトにおける薬剤の取り込みに予測を複雑にし、種間の重要な相違点を明らかにした。ヒト内皮細胞とアストロサイトの共培養を含むインビトロ BBBモデルは、15に記載されている。関連するが、それらは、死後のヒト組織への調節のアクセスを必要と異質性は、年齢、疾患、およびおそらく医学的に依存してヒト脳内皮細胞の品質/特性の中にあるように、これらのモデルは、定期的に実施するのがより困難であるtreatmenドナーのT。努力はよりよい生理的、解剖学的およびin vivoでの BBBの機能特性を再現新しいin vitroモデルを開発するために行われなければならない。 3セル型を含む共培養物は、非常に限定的であり、日常的に実施が困難で表示される。現在までに、最も複雑な生体外 BBBモデルは、アストロサイトと血管様組織を含み、血流75,79,80,81,82を模倣媒体の流れを含んでダイナミックなin vitroモデル（DIV-BBB）です83,84,85。脳の内皮細胞は流れにさらされると、生成された剪断応力は、例えば、細胞分裂、分化、移動およびアポトーシス80内皮細胞生理学に関与する別の遺伝子の発現を調節する細胞表面でmechanotransducersを活性化する。 インビボ、せん断応力血流によって生成されるの確立を許可する細胞接触、で有糸分裂停止を担当してい血管80内の内皮細胞単層。正常なヒト脳微小血管内皮細胞のゲノムおよびプロテオーム解析は、BBB内皮生理学84のせん断応力の影響を示した。せん断応力は、CYP450によって媒介75,86、酸化は75酵素および細胞生存、内皮細胞接着度が高く、排出ポンプの誘導およびトランス75、グルコース代謝の調節のより良好な分極に関与する発現を増加させることによって、傍細胞透過性の調節オクルディンとZO-1 87,75,80、結果的に高いTEERのような細胞間の接合部の要素をコードする遺伝子の約1,500 - 2,000Ω·cm 2で、 生体内で知られているに最も近い79,80パラメータ バイオテクノロジー及び製薬産業、医薬品のルーチンのスクリーニング、あるいはハイスループットスクリーニング（HTS）および動物実験を削減する努力において、主導セットアップするのに日常的により難しいままで脳内皮細胞の初代培養物の交換に使用される異なる細胞株の開発。ほとんどの場合、脳内皮細胞の初代培養物は、プラスミドDNAのトランスフェクションにより、またはレトロウイルスベクターを用いて感染88,89,75のいずれかによって、不死化遺伝子（SV40又はポリオーマウイルスラージT抗原またはアデノウイルスE1A）で形質導入した。 88,75などRBE4、GP8/3.9、GPNT、RBEC1、TR-BBBSまたはrBCEC4ラット細胞株などの脳由来の内皮細胞株が開発されてきたいくつかの、b.End3マウス細胞株90,75、PBMEC/C1 - 2ブタ細胞株87,75、およびhCMEC/D3ヒト細胞株89,75。他のモデルは、マディン·ダービーイヌ腎臓（MDCK）またはたCaco2細胞株12,75などの非脳由来の細胞に基づいている。異なるヒト脳血管内皮細胞株の中で、hCMEC/D3は広く引用されていますDと2005 91,92年の設立以来、BBBのモデルとして改良された。初代培養細胞株に存在利点と制限などである。彼らは、初代培養よりも扱いやすい延長寿命を持って、十分に特徴付けされており、大規模な実験間の再現性を可能にします。しかしながら、細胞株は、組織特異的機能を失う環境規制を失い、 インビボ75、89中の細胞とは全く異なる分子表現型を獲得することができる。具体的には、単層の細胞株から現在減少し圧迫感、低TEERおよびshowポータープロファイル変動75,89を生成しました。このように、一次細胞での動物実験や研究は、多くの場合、その複雑さにもかかわらず、好ましい。

中枢神経系（CNS）障害を治療するために開発された多くの薬物は、治療上適切な濃度で脳実質に到達することができない。 BBBは、病原体から、プラズマ組成の変動による脳の神経組織を保護し、脳1内外にイオンが、ペプチド、タンパク質、さらには細胞の非特異的フラックスを制限することにより、脳実質の恒常性を維持する。 BBB特性は、特殊なクラスの脳微小血管内皮細胞や、神経細胞、グリア細胞（より正確にはアストロサイトのエンドフィート）、などの神経グリア血管ユニット（NGVU）の隣接する要素間の密接な近接性やクロストークによって誘導され、維持されるおよび周皮細胞は、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロテオグリカン2,3を中心に構成されて基底膜に鞘で覆わ。毛細血管レベルでの内皮の32％、重要なを果たしている - 周皮細胞は、約22をカバー内皮細胞増殖、血管新生および炎症プロセスの調節において役割。内皮細胞は、毛細血管の内表面を覆う連続シートを形成する。それらは、頂端領域で帯状構造を形成し、それが細胞極性に寄与するのTJ、相互に接続されている。星状細胞は、BBB特性を調節し、例えば、TGF-β、GDNF、bFGFおよびIL-6などの重要な調節因子の供給源である。不完全な機能を備えたGFAP欠損したアストロサイトは、BBBの特性4を規制することができません。ニューロンは直接BBBの形成に構造的に関係するだけでなく、タンパク質発現およびBBB機能5の重要な側面を規制されていません。 さらにBBBの構造、生理学、病理学を研究するために、BBBのin vitroモデルは、研究ツールとして開発されました。脳内皮細胞ベースのインビトロ BBBモデルにおいて実現するために、種々の種から抽出されている8,9ブタウシ6,7、、ラット10,11,12、また、マウス13とヒトの14,15から低継代初代培養上。これらのモデルは、in vivoでの BBBを模倣することが知られている場合に特にラットまたはマウスおよび/ ​​または周皮16,12からグリア細胞及び/又は神経前駆細胞由来のアストロサイト17および/ ​​またはニューロン18と共培養した。それらは、インビトロ / インビボ実験と比較および/ ​​またはトランスジェニックモデル19から製造脳内皮細胞の研究において可能にするので、「ラボにおける「モデルはしばしば齧歯類から製造される。 新たにインビトロ BBBモデルにおいて開発もインビボ試験15,20,21,3,6,22,11,23の前に潜在的なCNS薬剤候補の脳への取り込みを予測するのに役立つように設計されている。 インビトロ BBBモデルは、通常、比較するために使用されているCNSへのI）は、公知の浸透またはlと：を有する薬剤の輸送BBBなし中枢効果全体のOW透過性、及びii）同じ種の動物モデルで測定された、同じ薬の見かけPeの。容易にBBBを通過する薬物は、主に親油性であり、脂質媒介自由拡散（カフェイン、カルバマゼピンなど）によって脳内皮細胞膜を横切る。ジゴキシン、ベラパミルまたはシクロスポリンAのような負に運ば薬は積極的なP-gpのような脳内皮排出トランスポーターによって押し出される。しかしながら、新たに開発された治療用分子の多くは、そのような組換えタンパク質、siRNAまたはモノクローナル抗体などの生物薬剤である。特定のトランスポーターのI）が存在しない、と傍細胞経路を受けるの高分子量分子を防ぐ内皮細胞のII）しっかりと充填層：それらのほとんどが起因してBBBを通過しないでください。これらの制限により、「トロイの木馬」戦略は、ベクトル、BBBでの既知の受容体に対する（抗体、ペプチド）、関係Iを使用して実装されていますN受容体は、トランスポートまたはトランスサイトーシス（RMT）、トランスフェリンなど（TF）受容体（のTfR）、インスリン受容体（IR）、またはLDL受容体のメンバー（LDLR）関連受容体ファミリー（LDLR、LRP1）を媒介した。このような受容体は、 生体内で 24,25 で孤立した脳毛細血管に及び、BBBで発見されている。これらの受容体の転写プロファイルは、特に、LDLRファミリーのものは、分析し、共培養直接脳26からのそれらの抽出後の星状細胞または脳毛細血管内の脳内皮細胞および脳内皮細胞間で比較した。 Pardridge 24は、インスリン受容体およびインスリン増殖因子受容体27,28に対する抗体、続いて、トランスフェリン受容体（TfRの）に対してOX-26抗体を用いてフィールドを開いた。これらの抗体ベースのベクターを用いて、ArmaGenテクノロジーズは、BBB 29を越え、タンパク質を含む、薬物を送達するために、BBBの分子トロイの木馬プラットフォーム技術を開発しました。ザ·文献はLRP1脳血管内皮細胞での発現と強力なエンドサイトーシス/スカベンジャー受容体としての役割を示すデータが豊富である。ウェスタンブロット分析は、LRP1が脳毛細血管に富む画分に、ラットの脳毛細血管内皮細胞30において発現されることを示唆した。このようなBBB 31を越え、効率的な薬物の流入を促進アプロチニン由来のペプチドベクターを用いたAngiochem目標LRP1などの企業。しかし、LRP1もAβおよび血液32に脳実質からの流出/クリアランスの能動輸送に関与している。このようなデータは、そのリガンドによってはBBBを通過双方向輸送にLRP1を伴う。 biOasisはVECT-HORUSがLDLR 34を対象とするペプチドベクトルを開発していますが、このようなBBB 33全体のリソソーム酵素や抗体などの生物製剤の輸送のためにタンパク質メラノを使っトランセンド技術を開発しています。データは、LRPおよびLDLRの差分を輸送するために使用できることがあるが示唆されているこのようなBBB 37全体のリソソーム酵素35,36またはナノ粒子複合体としてのerent分子。 我々の関心のある分野は、ベクター分子およびCNS疾患の治療のためのベクトル化された薬剤候補を用いて、CNSへの薬物送達である。具体的には、BBBを横切る薬物送達は、神経炎症、その範囲が変化してもよいプロセスのコンテキスト内で考慮されなければならないが、これは、脳炎、多発性硬化症、アルツハイマー病などの神経炎症を含む、おそらくすべてのCNS病変および疾患に共通であるBBBの炎症と、潜在的にBBBの生理学および透過性の変化は、傍細胞及び経細胞輸送は、病的状態の38,39,40,41,42,43で増幅することができることを考慮に関連付けられている。例えば、TNF-α、TWEAK、および他のサイトカインは、炎症を調節し、 インビトロ BBBモデルを用いた実験は、それらが目の傍細胞特性を変化させることができることを示しているE内皮細胞単層38,39,40と、そのTNF-αはまた、LDL 41の経細胞輸送の増加、ホロトランスフェリン42ラクトフェリン43につながる。 我々の目的は、開発し、特性化することでした最適化され、再現性の高いラット同系BBBモデルは、一次脳内皮細胞とアストロサイトの共培養を使用した。私たちは、それぞれ脳内皮細胞の生産とアストロサイト制作のための5週齢および新生児ウィスターラットを使用していました。 1つの課題は、「毎週再現可能な「BBBモデルの生成を可能にするプロトコルを確立することであった。この目的を達するために、生産プロトコルのすべてのステップは、最初の週の水曜日に脳の微小血管の生産から開始し、週の固定日に実施された。解剖は、過去3年の間にほぼ毎週行った。さらに、培養の再現性を向上させるために、品質保証システムを確立した。すべてreagenTSと化学物質データベース（入国日、株式、有効期限など）で参照されました。 モデルは、内皮細胞の組織化および純度などの多くの基準は、次の特徴づけられた、TEER、LY透過性、炎症誘発性剤、TJタンパク質の定性的および定量的な発現、例えば、P-gpのような排出トランスポーターの機能性、および受容体に応答しなどのTfRまたはLDLR内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与。

<table><tbody><tr><td>BSA fraction V low endotoxin</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>Collagen type IV mouse (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>356233</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 month</td></tr><tr><td>Fibronectin humain plasma (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>356008</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 month</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors, straight (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, straight (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, tip width 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001</td><td>-20 &amp;deg;C / 3 months</td></tr><tr><td>DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100 mg</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>Gentamicin (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>bFGF (10 &amp;micro;g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>-20 &amp;deg;C / 6 months</td></tr><tr><td>Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10 mg</td><td>-20 &amp;deg;C / 6 months</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porosity: 1 &amp;micro;m&lt;br/&gt; Surface: 1.1 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1 g</td><td>-20 &amp;deg;C / 1 year</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD31 / PECAM&amp;nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clone V9, (58 &amp;micro;g/ml)&amp;nbsp;</td><td>1/50 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/200 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/200 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Occludine&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/200 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, dilithium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>TNF-alpha human</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td>-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Rat MCP-1 ELISA Kit</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &amp;deg;C / -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mouse anti-P-glycoprotein</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - fixation PFA 4%&lt;br/&gt; 1/200 (western blot)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1,000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cyclosporine A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/5 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-LDLR</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>AF2255 (200 &amp;micro;g/ml)</td><td>1/50 - fixation PFA 4%</td></tr><tr><td>Rat transferrin-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

血液脳関門（BBB）は、特に、血液と神経組織との間の分子および細胞フラックスを調節する。私たちの目的は、内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与する受容体を研究するため、一次ラット脳内皮細胞（RBEC）とアストロサイトの共培養を用いて、BBBのin vitroモデルで再現性の高いラット同系を開発し、特徴づけることでした。アストロサイトは、トリプシン消化後、機械的切開によって単離し、それ以降の共培養のために凍結した。 RBECは、5週齢のラット皮質から単離した。脳を髄膜と白質の洗浄、及び機械的に酵素消化後に解離させた。その後、組織ホモジネートは、神経組織から血管フラグメントを分離するためにウシ血清アルブミン中で遠心分離した。血管フラグメントは、それらの細胞外マトリックスからの内皮細胞を解放する第2の酵素消化を受けた。このような周皮細胞のような残りの混入細胞はFだったurtherピューロ含有培地中での微小血管フラグメントをめっきすることによって解消。次いで、それらをウェルの底上に成長させたアストロサイトとの共培養のためのフィルター上に継代した。 RBECは、セル境界での典型的な現地化などオクルディン、クローディン5およびZO-1のようなタイトジャンクショ​​ン（TJ）タンパク質を高レベルで発現した。脳内皮単層の経内皮電気抵抗（TEER）のTJの気密性 ​​が平均·cm 2で300オームに達したことを示す。ルシファーイエロー（LY）のための内皮透過係数（PE）は0.26±0.11×10 -3センチメートル/分の平均と高度に再現性があった。単層で編成脳内皮細胞は、流出輸送体P-糖タンパク質（P-gpの）を発現ローダミン123、P-gpのためのリガンドの偏光輸送を示し、内皮細胞単層を横切ってトランスフェリン-Cy3およびDiILDLの特定のトランスポートを示した。結論として、我々 は、in vitroを設定するためのプロトコルを提供により品質保証の方法に非常に再現性があり、それがBBBトランスポーターと受容体の研究に適してBBBモデル。

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.3K ビュー.  VECT-HORUS SAS. 本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。 

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In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

生物工学

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

免疫・感染学

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

神経科学

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

医学

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting from these stimuli can greatly modulate drug delivery to the brain and, by extension, cause considerable challenges in the treatment of central nervous system (CNS) diseases. Many BBB changes that affect pharmacotherapy, involve proteins that are localized and expressed at the level of endothelial cells. Indeed, such knowledge on BBB physiology in health and disease has sparked considerable interest in the study of these membrane proteins. From a basic science research standpoint, this implies a requirement for a simple but robust and reproducible method for isolation of microvessels from brain tissue harvested from experimental animals. In order to prepare membrane samples from freshly isolated microvessels, it is essential that sample preparations be enriched in endothelial cells but limited in the presence of other cell types of the neurovascular unit (i.e., astrocytes, microglia, neurons, pericytes). An added benefit is the ability to prepare samples from individual animals in order to capture the true variability of protein expression in an experimental population. In this manuscript, details regarding a method that is utilized for isolation of rat brain microvessels and preparation of membrane samples are provided. Microvessel enrichment, from samples derived, is achieved by using four centrifugation steps where dextran is included in the sample buffer. This protocol can easily be adapted by other laboratories for their own specific applications. Samples generated from this protocol have been shown to yield robust experimental data from protein analysis experiments that can greatly aid the understanding of BBB responses to physiological, pathophysiological, and pharmacological stimuli.

Here, a method for isolation of rat brain microvessels and for the preparation of membrane samples is described. This protocol has the clear advantage of producing enriched microvessel samples with acceptable protein yield from individual animals. Samples can then be used for robust protein analyses at the brain microvascular endothelium.

新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

免疫蛍光染色による血液脳関門モデルの解析

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

著者スポットライト:ヒト組織研究のための組織チップ技術の使用の促進 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

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要約

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Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

アン

使用してリンパ球血管外漏出の分析

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイスモデル

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

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Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

アン

使用してリンパ球血管外漏出の分析

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

新鮮単離ラット脳微小循環から膜のサンプルを準備するシンプルで再現性のある方法

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイス モデル

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

病原体や医薬品との相互作用、脳によって障壁の交差を勉強する人間の血-脳インターフェイスモデル