وأيد هذا البحث في جزء من برنامج بحوث جماعية للمعهد الوطني للسرطان في المعاهد الوطنية للصحة، وNCI منح UA5CA152907.

1. مجموعة من وسائل الإعلام مكيفة لاختبار إمكانات عائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا الأولية أو خلد لفحصها لاحتمال عائية أو مكافحة عائية في وسائل الإعلام مصل الأم أو منخفضة وجمع وسائل الإعلام مكيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، استخدام وسائل الإعلام مشروطة فورا أو aliquoted وتخزينها في -80 درجة مئوية لعدة أشهر. استخدام nonconditioned الأصلي أو انخفاض مصل سائل الإعلام كعنصر تحكم السلبية، واستخدام وسائل الإعلام غير مكيفة كاملة النمو (10٪ FBS، أو التركيز المناسب) كعنصر تحكم إيجابية. بدلا من ذلك، لاختبار التحفيز والتشجيع المحتملة لتكوين الأوعية الدموية، ملحق الفحم جردت وسائل الإعلام التي تفتقر إلى عوامل النمو مع تركيزات معروفة من بروتينات معينة من الفائدة ومقارنة لوسائل الإعلام الحرة وحدها عامل النمو. </li></ol></li></ol> 2. إعداد الخلايا البطانية قبل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يومين قبل الفحص، مرور 3B-11 الخلايا في جديدة T-75 قارورة. عدد مرور خلايا ومهم. هذا الاختبار يعمل بشكل أفضل عندما الخلايا بين الممرات الثانية والسادسة. سوف الفحص لا تعمل بشكل جيد إذا تم استخدام الخلايا البطانية قبل الثانية أو بعد مرور العاشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم واحد قبل الفحص، مصل تجويع خلايا 3B-11 على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من الخلايا 3B-11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خفضت وسائل الاعلام المصل DMEM تستكمل مع 0.2٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البيروفات 1MM الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية. </li></ol></li></ol> 3. إعداد الكواشف لفحص مسبق ملاحظة: تركيزات BME تختلف اختلافا كبيرا تعتمد على الكثير. BME لا يعمل بشكل جيد إذا كان تركيز أقل من 10 ملغ / مل، لذلك يجب الاتصال بالشركة المصنعة BME قبل الشراء للتأكد مناقتناء الكثير تتركز بشكل كاف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض تذويب عامل النمو BME في الثلاجة. BME يتصلب عندما الحارة، لذلك يجب أن تبقى البارد قبل استخدامها. BME يمكن تخزينها تحت التبريد لبضعة أسابيع، أو aliquoted وتجميد في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويفضل تقليل عامل نمو BME على BME التقليدي. وعدم وجود العوامل عائية في BME يسهل مراقبة تأثير العوامل التي من وسائل الإعلام مكيفة تحتوي على تشكيل الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام ذوبان الجليد لفحصها. </li></ol> 4. إعداد الخلايا البطانية مباشرة قبل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3B-11 الخلايا في DPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب التصور مع مضان المجهري متحد البؤر أو قبل غسل 3B-11 الخلايا، إضافة calcein صباحا إلى الخلايا البطانية في وسائل الإعلام بتركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل. وضع calcein الخلايا المسمى في الظلام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل بدء الفحص. حل الأسهم calceinيتم تخفيف AM في DMSO وcalcein مرة واحدة في وسائل الإعلام تركيز النهائي من DMSO يجب أن لا تتجاوز 0.1٪. بعد 30-45 دقيقة يغسل calcein صباحا من الخلايا (الخطوة 4.1 أعلاه) ومواصلة التجربة يتبع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا بإضافة 1 مل التربسين-EDTA إلى T-75 قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد trypsinization كاملة، تحييد التربسين عن طريق إعادة التعليق الخلايا إلى الحجم النهائي من 10ML في DMEM، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، البيروفات 1MM الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الخلايا من خلال 100 ميكرون خلية مصفاة لإزالة كتل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا وResuspend الخلايا إلى تركيز النهائي من 7.5 × 10 6 خلية / مل في DMEM، و 10٪ FBS، 2 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. </li></ol> 5. أنبوب تشكيل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 24 لوحة جيدا و 1 مل النصائح في الثلاجة أو على الجليد لمدة 20-30 دقيقة قبل تحميل لوحة بحيث BME لا بريمترسيخ aturely. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 250 ميكرولتر من تقليل عامل نمو BME في كل بئر من 24 لوحة جيدا. تجنب خلق فقاعات من خلال عدم الاكتئاب ماصة إلى المحطة الأخيرة في حين الاستغناء. الحرص على أن يبقى ما يكفي BME في مركز البئر عندما أشكال الغضروف المفصلي. إذا كانت مصفوفة رقيقة جدا، وسوف تشكل الخلايا فقط أحادي الطبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 24 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة لترسيخ BME. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد وضعت BME، مزيج حوالي 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام مكيفة مع 10 ميكرولتر من معلق 3B-11 الخلايا (حوالي 75،000 الخلايا). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مستوى الصوت وسائل الإعلام مكيفة وعدد الخلايا البطانية مطلي اعتمادا على نوع من الخلايا المستخدمة، واختبار التخفيفات المسلسل من وسائل الإعلام مكيفة لإثبات النشاط. إذا الخلايا مقارنة نمت في ظل ظروف مختلفة، وتطبيع حجم وسائل الإعلام مكيفة لعدد الخلايا التي استخدمت لشرط وسائل الإعلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب فيلل يبدأ بتشكيل خلال 2-4 ساعة. اعتمادا على تركيز عامل عائية في وسائل الإعلام مكيفة، قد تحدث تشكيل أنبوب الذروة بين 3 و 12 ساعة وتوقيت الفحص سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل. إذا كان يعمل مع الخلايا البطانية الأولية بدلا من خلايا خلدت، تشكيل أنبوب الأولي قد يتأخر لعدة ساعات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وغالبا ما تبدأ أنابيب في التدهور خلال 18 ساعة وخلايا البطانية سيخضع لموت الخلايا المبرمج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت الذروة تشكيل الأنبوب، وسائل الإعلام نضح بعناية من البئر لتجنب تعطيل شبكة أنبوب على BME. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر مع 1 مل DPBS، ثم نضح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور فوري، إضافة 1 مل DPBS الطازجة إلى كل شبكة أنبوب جيدا والصورة باستخدام مجهر مقلوب تعلق على كاميرا رقمية، أو مضان / مجهر متحد البؤر إذا تم صبغ الخلايا مع calcein AM كما في 4.1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإصلاح شبكة أنابيب لتصور لاحق، وإضافة 4٪ بارافورمالدهيد على كليستنشق جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة امتصاص العرق، ويغسل مرتين مع DPBS، ثم يضاف من 1mL DPBS الطازجة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجهريا صورة قبل التثبيت كما القليلة أنابيب قد كسر خلال هذا الإجراء. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. الكمي لشبكة أنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد شبكة أنبوب في عدة طرق مختلفة اعتمادا على تفضيل المحقق، والعديد من برامج الكمبيوتر لديها القدرة على قياس المعلمات التالية: عدد الأنابيب. عدد الحلقات / تنسجم؛ عدد من المواقع فرع / العقد. طول الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برنامج كمبيوتر تمثيلي مثل صورة J مع المساعد الأوعية الدموية محلل (16) لتقدير حجم شبكات الأنبوب. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438, 932-936 (1038).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li><li>Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+therapeutic+aspects+of+angiogenesis.">Basic and therapeutic aspects of angiogenesis.</a> Cell. 146, 873-887 (2011).</li><li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development.">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438, 937-945 (2005).</li><li>Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+pro-+and+anti-angiogenic+factors+as+targets+of+clinical+intervention.">A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention.</a> Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).</li><li>Ausprunk, D. H., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+and+proliferation+of+endothelial+cells+in+preformed+and+newly+formed+blood+vessels+during+tumor+angiogenesis.">Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis.</a> Microvascular research. 14, 53-65 (1977).</li><li>Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumour+vasculature:+insights+from+physiological+angiogenesis.">Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis.</a> Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).</li><li>Chung, A. S., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+pathological+angiogenesis.">Developmental and pathological angiogenesis.</a> Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis.">Tumor angiogenesis.</a> The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis:+therapeutic+implications.">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).</li><li>Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+laminin+and+basement+membrane+in+the+morphological+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures.">Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.</a> The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+state+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature protocols. 5, 628-635 (2010).</li><li>Walter-Yohrling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+endothelial+cell+lines+as+models+of+tumor+endothelial+cells.">Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).</li><li>Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> Journal of immunology. , 144-521 (1950).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ+contribution:+Angiogenesis+Analyzer.">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تشارك الأوعية الدموية في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية. دراسة الآليات التي تشارك في تكوين الأوعية الدموية يتطلب استخدام المقايسات أن ألخص أهم الخطوات في الأوعية الدموية. والبطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ويقدم العديد من المزايا أكثر من فحوصات أخرى. فمن السهل أ...

الأوعية الدموية، وتطوير أوعية دموية جديدة من السفن الموجودة مسبقا، أمر حيوي لمجموعة متنوعة من العمليات بما في ذلك نمو الجهاز، التطور الجنيني، والتئام الجروح 1-3. وضعت حديثا الأوعية الدموية، واصطف بواسطة الخلايا البطانية، والأكسجين العرض والمواد المغذية إلى الأنسجة، وتعزيز المراقبة المناعة من الخلايا المكونة للدم وإزالة النفايات 2،4. الأوعية الدموية هي ذات أهمية رئيسية أثناء التطور الجنيني والجنين. ومع ذلك، لا تزال هذه العملية نائمة في البالغين إلا في أوقات التئام الجروح ونمو الهيكل العظمي، والحمل أو أثناء الدورة الشهرية 1-3. على مدى العقدين الماضيين، بدأت الآليات الجزيئية الرئيسية التي تنظم الأوعية الدموية في الظهور. الأوعية الدموية هو حدث ينظم بإحكام، متوازنة من إشارات المؤيد والأوعية بما integrins، كيموكينات، angiopoietins، وكلاء الاستشعار الأوكسجين، جزيئات صلي ومثبطات الذاتية 5. مرة واحدة proangإشارات iogenic مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF)، وعامل نمو البشرة (EGF) تنشيط الخلايا البطانية مستقبلات الخلايا البطانية تطلق البروتياز للحط من الغشاء القاعدي. الخلايا البطانية ثم تتكاثر وتهاجر، وتشكيل براعم بمعدل عدة مليمترات في اليوم الواحد 6،7. ويرتبط الأوعية الدموية مع مختلف الحالات المرضية بما فيها السرطان، والصدفية، واعتلال الشبكية السكري، والتهاب المفاصل، والربو، واضطرابات المناعة الذاتية والأمراض المعدية، وتصلب الشرايين 8-10. نظرا لأهمية الأوعية الدموية في أمراض مختلفة، فهم الجينات والمسارات التي تنظم هذه العملية أمر بالغ الأهمية لتصميم علاجات أفضل. مقايسة تشكيل أنبوب هو طريقة سريعة والكمي لتحديد الجينات أو مسارات المشاركة في الأوعية الدموية. وصف لأول مرة في عام 1988،المبادئ التي تقوم عليها هذا الاختبار هي أن الخلايا البطانية تحتفظ القدرة على الانقسام وتهاجر بسرعة استجابة لإشارات عائية 11-13. علاوة على ذلك، وبفعل الخلايا البطانية للتمييز وتشكيل الهياكل أنبوب يشبه عندما مثقف على مصفوفة من استخراج الغشاء القاعدي (BME). هذه الأنابيب تحتوي على تجويف تحيط بها الخلايا البطانية ترتبط معا من خلال المجمعات صلي. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع معظم أنابيب تشكيل في هذا الاختبار في غضون 2-6 ساعة تبعا لكمية ونوع المثيرات عائية. عدة أنواع من الخلايا البطانية يمكن استخدامها لهذا الاختبار بما في ذلك الخلايا الأولية وخطوط الخلايا خلد 14،15. كان خط الخلية المستخدمة لهذا المقال الماوس 3B-11، ولكن نفس منهجية يمكن تطبيقها مع خطوط أخرى مثل الخلايا البطانية SVEC4-10 (الماوس) أو الخلايا البطانية الأولية مثل HUVEC (الإنسان) الخلايا. تبعا الذي يستخدم خط الخلية وما إذا كانت البطانية متتحول LLS أو غير تحولت، سوف تحتاج الأمثل التي ستجرى لتحديد الوقت المثالي اللازمة لتشكيل أنبوب المناسب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:339px;">Item</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Manufacturer</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">Catalog #</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="114" rowspan="2" style="height:114px;width:339px;">Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Corning</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">3524</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="190" rowspan="2" style="height:190px;width:339px;">BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">BD Biosciences</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">354230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="76" rowspan="2" style="height:76px;width:339px;">Gibco 0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="74">
			<td height="95" rowspan="2" style="height:95px;width:339px;">Gibco L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">25030-081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco Pen Strep</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">15140-122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DMEM (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Gibco DPBS (1X)</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="57" rowspan="2" style="height:57px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;">Atlas Biologicals</td>
			<td rowspan="2" style="width:124px;">F-0500-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Calcein AM</td>
			<td style="width:189px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">C3100MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMSO</td>
			<td style="width:189px;">ATCC</td>
			<td style="width:124px;">4-X</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis

الأوعية الدموية هي عملية حيوية للتنمية الأنسجة الطبيعية والتئام الجروح، ولكن يرتبط أيضا مع مجموعة متنوعة من الحالات المرضية. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن قياس الأوعية الدموية في المختبر بطريقة سليمة وقابلة للقياس الكمي سريعة. يتم خلط الخلايا البطانية الأولية أو خلدت مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على مصفوفة الغشاء القاعدي. وتشكل الخلايا البطانية الشعرية مثل الهياكل استجابة لإشارات عائية وجدت في وسائل الإعلام مشروطة. يحدث تشكيل أنبوب بسرعة مع الخلايا البطانية التي تبدأ لمواءمة أنفسهم في حدود 1 ساعة والأنابيب التي تحتوي على التجويف تبدأ في الظهور في غضون 2 ساعة. أنابيب يمكن تصور باستخدام المجهر المقلوب على النقيض المرحلة، أو الخلايا يمكن علاجها calcein AM مسبق للفحص والأنابيب من خلال تصور أو مضان المجهري متحد البؤر. عدد المواقع فرع / العقد، وأعمدة / تنسجم، أو عدد أو طول أنابيب شكلت يمكن قياسها كميا بسهولة كمقياس للفي vitrس الأوعية الدموية. وباختصار، يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الجينات والمسالك التي تشارك في تعزيز أو تثبيط الأوعية الدموية بطريقة سريعة واستنساخه، والكمية.

تم المصنفة الماوس 3B-11 الخلايا البطانية على طدت عامل انخفاض النمو BME - في هذا الاختبار، تم استخدام المنتج Matrigel - ويتبع مع مرور الوقت. كما هو مبين في الشكل 1، والعوامل المولدة للأوعية التي يفرزها إما الماوس أو الكيراتينية الليفية قادرة على إحداث تشكيل أنبوب مع م?...

Watch this Scientific Journal Video about Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis at JoVE.com

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

مقايسة تشكيل أنبوب هو، طريقة للقياس لقياس سريع في المختبر الأوعية الدموية. يتم الجمع بين الخلايا البطانية مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على استخراج الغشاء القاعدي. يحدث تشكيل أنبوب خلال ساعات والأنابيب التي شكلت حديثا كميا بسهولة.

البطانية أنبوب تشكيل خلية الفحص ل<em&gt; في المختبر</em&gt; دراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

endothelial-cell-tube-formation-assay-for-vitro-study

Research

JoVE Journal

Biology

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

59.0K Views.  American University.  مقايسة تشكيل أنبوب هو، طريقة للقياس لقياس سريع في المختبر الأوعية الدموية. يتم الجمع بين الخلايا البطانية مع وسائل الإعلام مشروطة ومطلي على استخراج الغشاء القاعدي. يحدث تشكيل أنبوب خلال ساعات والأنابيب التي شكلت حديثا كميا بسهولة. 

Video: Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

اختبار الحساسية البصرية للسرعة واتجاه الحركة في السحالي

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

كريستوفر هيوز : حدث في نموذج المختبر لدراسة الأوعية الدموية (مقابلة)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

الفحص الأمثل الفايبرين الخرزة جل لدراسة الأوعية الدموية

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

الكميات من البطانية الإلتصاق الخليوي<em&gt; في المختبر</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

والأحيائي بسيط لتقييم العوامل الأوعية الدموية غشائي النمو

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.