إن التهجين في الموقع، ويش، يوفر دقة عالية ونتيجة خلفية منخفضة مقارنة بالطرق التقليدية. أيضا، لوحات U-الشرائح تحسين التركيز في البعد البؤري نفسه باستخدام أقل يمكن تطبيق ويش على أجنة الماوس، أجنة دروسوفيليا وغيرها من الأنسجة من الصعب التعامل معها. يمكن تطبيق مقايسة تشكيل أنبوب الخلايا الجذعية متمايزة الاندروجين الخلايا.
يجعل ويش من السهل فهم المعنى الوظيفي لتصحيح الطفرة. الشخص الذي سيثبت الإجراء هو يونغ وانغ، مساعد باحث من مختبري. العمل تحت المجهر، واستخدام نظام FemtoJet لحقن اثنين من نانوغرام من Morpholinos و 500 picograms من MRNA في الأجنة خلية واحدة.
ممارسة الحقن المجهري من مورفولينوس عدة مرات حتى يمكنك حقنه في الخلايا بنجاح والحفاظ على سلامة البيض. احتضان الزيغوت حتى يتم تدنيسها والوصول إلى حالة التنمية التي تتوافق مع التجربة المقصودة. كما هو موضح في الجدول الأول من المخطوطة.
بعد ذلك، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل 20 إلى 40 جنينًا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من الطازجة 4٪ محلول PFA في درجة حرارة الغرفة. بعد إصلاح وغسل وتجفيف الأجنة كما هو موضح في المخطوطة، ضع الأجنة في منخل مع شبكة نايلون في الأسفل.
هيدرات الأجنة عن طريق غسلها بالتسلسل في 75٪ 50٪ والميثانول 25٪ لمدة خمس دقائق لكل منهما. بعد غسل الأجنة مع PBST، إضافة 50 ميكرولترات من البروتينات K في الأنبوب مع الأجنة. بعد الهضم، وإزالة البروتينات K وغسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة.
إضافة 50 إلى 100 ميكرولترات من تحقيقات الهدف المختلط في كل أنبوب مع الأجنة. احتضان الأجنة بين عشية وضحاها في 40 درجة مئوية. بعد غسل الأجنة كما هو موضح في المخطوطة، استخدم 4٪ شبه شكلي لإصلاح الأجنة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ثم غسل الأجنة في محلول SSCT 2x ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة حل SSCT واستبدله بـ 50 ميكرولترات من Amp 1. ثم احتضان الأجنة في 40 درجة مئوية.
بعد 30 دقيقة، قم بغسل الأجنة في محلول SSCT 2 مرة ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة حل SSCT وأضف 50 ميكرولترات من Amp 2. بعد احتضان لمدة 15 دقيقة وغسل الجنين كما فعلت سابقا، إضافة 50 ميكرولترات من أمبير 3 والاستفادة من الأنبوب بلطف.
احتضان الأجنة في 40 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة يغسل الأجنة كما هو موضح سابقا. ثم إضافة 50 ميكرولترات من أمبير 4 قطرة والاستفادة بعناية الأنبوب.
ثم احتضان الأجنة في 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وغسلها ثلاث مرات مع SSCT. بعد إعداد الأجنة للتصوير كما هو موضح في المخطوطة، استخدم مجموعة الركيزة من الـ DAB peroxidase لتلطيخ العينة. إضافة 50 ميكرولترات كل من الكواشف اللون A, B و C إلى ملليلتر واحد من الماء المقطر.
وخلط جيدا للحصول على كامل الداب العمل السوائل. يُضاف السائل إلى العينة ويُغطّى لمدة عشر دقائق. بعد غسل العينات بدقة ، استخدم المجهر البصري لتصويرها.
للبدء في زراعة والسيطرة على hHT iPSCs، إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى ستة صحائف ثقافة الخلايا جيدا لتغطية الجزء السفلي من الآبار. احتضان لوحات لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، إزالة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المستخدمة حل من الآبار، وإضافة ملليلتر اثنين من mTeSR 1 المتوسطة في كل بئر.
ثم لوحة iPSCs حصادها من الممر الأخير في ما يقرب من واحد عشر مرات إلى الخلايا الست في البئر. بعد زراعة iPSCs لمدة أربعة أيام تقريبا، تبادل متوسطة ثقافة الخلية مع ملحق BEL المتوسطة. تنمو الخلايا لمدة ثلاثة أيام لتوليد خلايا ميودرما.
لتوسيع الخلايا البطانية الوعائية، استبدل الوسيط بوسيلة بيل التكميلية لمدة أربعة أيام. ثم تعامل مع الخلايا بنفس الوسط والثقافة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام أخرى. تنقية الخلايا البطانية الوعائية الناضجة باستخدام CD31 Dynabeads وفقا لتعليمات عدة.
ثم جمع الخلايا الإيجابية CD31 بواسطة عازلة elution. الحفاظ على وتوسيع الخلايا البطانية النقية في وسط EC-SFM التي تحتوي على VEGF165 وbFGF و FBS. لطبق الخلايا البطانية، تبدأ بإضافة 10 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر إلى لوحات الأوعية الدموية.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حصاد الخلايا البطانية وإعادة تعليقها في النمو البطانية المتوسطة 2 عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا. إضافة 50 ميكرولترات من هذا التعليق الخلية إلى مصفوفة مترسخة في كل بئر ومن ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية.
بعد ثلاث إلى خمس ساعات من الحضانة، استخدم مجهرًا عالي الدقة لتقييم تكوين الأنبوب البطانية. التقاط صور لما لا يقل عن عشرة مناطق لكل مجموعة. فحص طول الأنبوب الكلي ورقم الأنبوب ونقاط الفرع.
تم إجراء CISH و WISH لتحديد التعبير عن إندوغلين في 24 ساعة من الأجنة بعد الإخصاب. تم استخدام علامة البطانية النزفية وعلامة السلف البطانية لفحص تأثير إسكات endoglin. تشير الأسهم الحمراء إلى المناطق التي انخفض فيها التعبير عن هذه العلامات ، aplnrna وprpr1a بشكل ملحوظ.
تم إجراء مقايسة تشكيل الأنبوب البطاني على متحولة endoglin والتحكم في الخلايا البطانية المشتقة من iPSC. تم تقييم تكوين الأنبوب وتصويره بعد ثلاث ساعات. تم تحديد طول الأنبوب ورقم الأنبوب والتفرعات كمياً باستخدام برنامج ImageJ.
شكلت الخلايا البطانية المتحولة فروعًا أقل من الخلايا البطانية المتحكمة. والأفرع في الخلايا البطانية متحولة زيادة كبيرة بعد التحفيز مع عامل النمو البطانية الوعائية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتوليد iPS من الدم المحيطي.
وطريقة يوضح دور الغدد الصماء في تشكيل الأوعية الدموية في المختبر وفي الجسم الحي. مع العلم أن تصحيح الطفرة يمكن أن تحدث فرقا في تولد الأوعية، فمن الممكن زرع الخلايا مرة أخرى إلى المرضى للعلاج بالخلايا الجذعية المحتملة.
