وأيد هذا العمل من قبل FONDAZIONE ISTITUTO ايطالي دي TECNOLOGIA. فإن الكتاب أود أن أنوه بيوتيك Miltenyi محدودة (بيرجيش جلادباخ، ألمانيا) لرعاية هذه المخطوطة، والدكتور باولو Petrucciani (قسم أمراض الدم والمناعة خدمة نقل، مستشفى وتي بونتيديرا، بيزا، إيطاليا) لتوفير المعاطف الشهباء الإنسان و البروفيسور ماسيمو Pasqualetti (قسم الأحياء - وحدة الخلوي وعلم الأحياء التنموي، جامعة بيزا، بيزا، إيطاليا) لإسكان مستعمرة الماوس.

بيان الأخلاق تم تجهيز العينات البشرية والحيوانية في أعقاب المبادئ التوجيهية من وزارة الصحة الإيطالية، والقانون 116/92 وتوجيه المجلس 86/609/EEC المجتمعات الأوروبية. 1. الثقافات الوحيدات الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة الإنسانية THP-1 في الخلايا T-75 التي تحتوي على قوارير متوسطة RPMI-1640 تستكمل مع مصل الإنسان 10٪، 50 U / البنسلين مل و 50 ملغ / مل الستربتوميسين، 0.05 ملي β-المركابتويثانول عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافات الانقسام عندما متموجة (كل 3-5 أيام). </li></ol> 2. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs) من بافي معاطف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في بروتوكول العزلة، وإعداد محلول الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.2، 2 مم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، و 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، مضيفا 5 مل BSA الأسهم إلى 95 مل الحل الشطف العازلة (1: 20 التخفيف). ديغا المخزن المؤقت وابقائه الباردة (2-8° C). هام: عدم ديغا المخزن المؤقت قد يؤدي إلى نتائج أقل من المستوى الأمثل بسبب الفقاعات قد منع عمود العزلة (انظر الخطوة 3.2). ملاحظة: تخثر سترات الدكستروز صيغة-A (ACD-A) أو الدكستروز الفوسفات سترات (CPD) يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك. على العكس، يمكن أن البروتينات الأخرى الزلال أو الأمصال من الأنواع الأخرى استبدال BSA. لا تستخدم مخازن تحتوي على الكالسيوم 2 + أو + 2 ملغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المعاطف الشهباء من المتبرعين الأصحاء (الذين تتراوح أعمارهم بين 20-60 سنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50 مل أنابيب المخروطية لكثافة التدرج الطرد المركزي. تحديد عدد الأنابيب اللازمة لمعالجة الدم (كل أنبوب يمكن معالجة 35 مل من الدم المخفف) وإضافة 15 مل من Ficoll-Paque إلى كل أنبوب فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 8 مل من الدم مع 24 مل من برنامج تلفزيوني / BSA / حل EDTA (1:4 تمييع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة بعناية محلول مخفف على رأس Ficoll-Paque (الكثافة = 1.077 جم / مل) في كل من أنابيب مخروطية 50 مل. لا يختلطانالدم وFicoll-Paque. هام: لتجنب اختلاط الدم وFicoll-Paque، عقد الأنبوب في زاوية 45 درجة وطبقة الخليط الدم ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. سوف الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) لا تزال في واجهة البلازما Ficoll-Paque، في حين المحببة والرواسب الكريات الحمراء بسبب ارتفاع الكثافة في الضغط الاسموزي من Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا الطور البيني (خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية، PBMCs) إلى 50 مل أنبوب جديدة مليئة PBS / جيش صرب البوسنة / EDTA وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بيليه مرتين مع برنامج تلفزيوني / BSA / EDTA لإزالة الصفائح الدموية. تدور في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا في كامل RPMI-1640 مع المصل البشري 10٪ والمضادات الحيوية أو الشروع في تنقية حيدات. </li></ol> 3. تنقية حيدات الابتدائية من PBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل حيدات من PBMCs بواسطة المغناطيسي الفصل باستخدام حبة هوملعموم الوحيدات العزلة عدة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمر الخلايا من خلال شبكة 30 ميكرون نايلون (الفلاتر preseparation، 30 ميكرومتر) لإزالة كتل الخلية ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلية resuspend في 30 ميكرولتر من العازلة PBS / EDTA / BSA في 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر FCR حجب الكاشف لكل 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة البيوتين كوكتيل في 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر من العازلة في 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من بلي مكافحة البيوتين في 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في 2-8 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend تصل إلى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة PBS / EDTA / BSA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> separ المغناطيسيأوجه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفقا لذلك إلى عدد الخلايا الكلي، واختيار العمود MACS المناسبة وMACS فاصل (انظر العمود MACS رقة البيانات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عمود في المجال المغناطيسي للفاصل MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العمود قبل الشطف مع كمية مناسبة من PBS / EDTA / BSA العازلة (الأعمدة MS: 500 ميكرولتر؛ الأعمدة LS: 3 مل). ملاحظة: الأعمدة هي &quot;وقف تدفق&quot; و لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنطبق على تعليق خلية العمود. جمع التدفق من خلال الخلايا التي تحتوي على أونلبلد، تمثل جزء الوحيدات المخصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود 3X مع برنامج تلفزيوني / EDTA / BSA العازلة (500 ميكرولتر لMS و 3 مل لLS في غسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر، تمثل خلايا الوحيدات المخصب، وإضافة إلى التدفق من خلال من القسم 3.2.4. ملاحظة: غسل العمود بإضافة PBS / EDTA / BSA مأخوذة العازلة فقط عندما يكون الخزان عمود فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) إزالة عمود منفاصل ووضعه على أنبوب جمع مناسبة. ماصة العازلة على العمود (الأعمدة MS: 1 مل؛ الأعمدة LS: 5 مل). طرد فورا من الخلايا nonmonocyte المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة تنقية حيدات في استكمال RPMI-1640 مع المصل البشري 10٪ والمضادات الحيوية. </li></ol></li></ol> 4. تنقية الدم وحيدات الابتدائية من الجامعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية الدم من وحيدات كله كله باستخدام عدة الوحيدات الدم العزلة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. </li></ol> 5. جسيمات متناهية الصغر التطبع في الكريات البيض في الدم وتنقية وحيدات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 5 × 10 5 خلية / مل (1 مل ​​/ جيد) من PBMCs المعزولة أو وحيدات إيجابية CD14 تنقيته في لوحة 12 جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر حل الأوراق المالية وresuspend في المتوسط ​​كاملة إلى تركيز العمل من 100 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من nanop العملالمادة التعليق (100 نانومتر) للعينات المعالجة للتوصل إلى جسيمات متناهية الصغر تركيز النهائي من 1 نانومتر. إضافة نفس الحجم من متوسطة كاملة لضوابط غير المعالجة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة استيعاب جمع العينات في أنبوب البولي بروبلين 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق منهم في 6،000 XG في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل من العازلة تشغيل 3 دقائق في 6،000 XG في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من العازلة على التوالي. الخلايا هي الآن جاهزة للقراءة من قبل التدفق الخلوي. </li></ol> 6. عزل الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية (انظر Bertero وآخرون. 7) 7. Replating والمختلطة الدبقية متموجة خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل T-75 قارورة مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (ث / س كا 2 + / + 2 ملغ)، ثم إضافة 10 مل من Versene واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5-7 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة طاف صعودا وهبوطا عدة مرات من أجل فصل الخلايا من سطح T-75 وتذوبالمجاميع الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق الخلية في أنبوب البولي بروبلين 15 مل. جمع كمية صغيرة من التعليق الخلوية لحساب الخلايا مع عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 XG في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه في تركيز النهائي من 5 × 10 5 خلية / مل في مستنبت الدبقية كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 0.5 مل / جيد في 24 لوحة جيدا، والسماح للخلايا تسوية لمدة 2-4 ساعة قبل العلاج جسيمات متناهية الصغر. </li></ol> 8. جسيمات متناهية الصغر التطبع في الخلايا الدبقية الصغيرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت كاملة الدبقية (لضوابط غير المعالجة) أو 500 ميكرولتر من جسيمات متناهية الصغر التعليق 2X رودامين-شافي 2 في مستنبت كاملة الدبقية (للعينات المعالجة) إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة للسماح للخلايا المفرزة من الخلايا التمسك nonrapid-في نقاط زمنية المختار وجمعها في 2 مل أنابيب البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولترمن Versene إلى كل بئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم فصل جزء الخلية المتبقية وجمع كل عينة مع الخلايا المناظرة nonadhering من الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينات لمدة 3 دقائق في 300 XG في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من AutoMACS تشغيل العازلة. </li></ol> 9. تلطيخ مع CD11b-VioBlue <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من VioBlue-CD11b البشرية / الماوس الضد إلى 100 ميكرولتر من تعليق خلية (نسبة 1:11) في إدارة العازلة واحتضان 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من العازلة تشغيل وخلط تعليق خلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي كل عينة لمدة 3 دقائق في 300 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف و resuspend بيليه في 100-150 ميكرولتر من العازلة على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة العينات إلى عداد الكريات (تخزين العينات في 4 درجات مئوية بين الخطوات الماضيين). هام: قبل تحليل العينات، والمضي قدما في الحصول على تعويض من الإشارات المتداخلة طأطياف ن الانبعاثات الملحوظة بين fluorochromes مختلفة (النانوية تألقي مترافق أو الأجسام المضادة). </li></ol> 10. الانسكاب الطيفية أكثر من التعويض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;إعدادات أداة&quot; مربع (موجودة في جميع البرامج الصك). ملاحظة: في حالة استخدام أداة مختلفة عن تلك التي ذكرت في المواد الجدول، يرجى الرجوع إلى دليل محدد أداة لاكتساب التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينة غير المعالجة (بدون النانوية) في سرعة منخفضة فلويديك (إذا سمحت الصك). خلال الاستحواذ، وضبط يدويا إلى الأمام والجانب نثر (FSC وSSC، على التوالي) من خلال تنظيم قنوات الجهد. ملاحظة: تعديل وSSC FSC جداول محور من أجل رؤية السكان خلية كاملة في المؤامرة أفضل. أداة تحديد قالب لكل نوع من الخلايا في المصالح يمكن أن تنشأ وحفظها واستخدامها لعمليات استحواذ في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح محددة&quot;المنطقة&quot; التبويب في البرنامج. رسم منطقة كبيرة المناسب (&quot;البوابة&quot;) حول السكان المطلوب. ملاحظة: تدخيل النانوية يؤدي الى تحول SSC من الخلايا. إذا يقتصر بشكل وثيق جدا البوابة حول السكان خلية من الفائدة، فإن البيانات التي حصل عليها وربما يغيب جزء من الخلايا ليتم الكشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عينتين غير ملوثين، واحدة للاستخدام كما عينة فارغة واحدة للحصول على تعويض ضد تلطيخ PI (اختياري)، وعينة واحدة واحدة ملطخة تألقي المناسبة لكل قناة مضان في الحصول على تعويض. ملاحظة: استخدام مختلف 1.5 مل أنبوب عينة لكل الأجسام المضادة تألقي مترافق لاستخدامها في وضع العلامات التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح علامة التبويب &quot;التعويض&quot; في &quot;إعدادات أداة&quot; مربع. زيادة أو إنقاص عامل التعويض خلال الاستحواذ حتى كثافة مضان في القناة الجانبية هو تقريبا نفس لنقاط البيع تألقيومكنته السكان سلبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على عينات المعالجة جسيمات متناهية الصغر بعد أن تم تعديل التعويض. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+nanomaterials+and+biological+systems:+Implications+to+personalized+nanomedicine.">Interactions of nanomaterials and biological systems: Implications to personalized nanomedicine.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 1363-1384 (2012).</li><li>Radad, K., Al-Shraim, M., Moldzio, R., Rausch, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+benefits+and+hazards+of+engineered+nanoparticles.">Recent advances in benefits and hazards of engineered nanoparticles.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 34, 661-672 (2012).</li><li>Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+engineered+nanomaterials.">Immunological properties of engineered nanomaterials.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 469-478 (2007).</li><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation.">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 762-774 (2011).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materials+engineering+for+immunomodulation.">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462, 449-460 (2009).</li><li>Bertero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalisation+regulates+polyamidoamine+dendrimer+toxicity+on+blood-brain+barrier+cells+and+the+modulation+of+key+inflammatory+receptors+on+microglia.">Surface functionalisation regulates polyamidoamine dendrimer toxicity on blood-brain barrier cells and the modulation of key inflammatory receptors on microglia.</a> Nanotoxicology. 8, 158-168 (2013).</li><li>Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+of+engineered+nanoparticles+with+in+vitro+toxicity+assays.">Interference of engineered nanoparticles with in vitro toxicity assays.</a> Arch. Toxicol. 86, 1123-1136 (2012).</li><li>Malvindi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+nanoparticles+biocompatibility+and+their+potential+for+gene+delivery+and+silencing.">SiO2 nanoparticles biocompatibility and their potential for gene delivery and silencing.</a> Nanoscale. 4, 486-495 (2012).</li><li>Bardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiO2+NPs:+Promising+Candidates+for+Drug+and+Gene+Delivery.">SiO2 NPs: Promising Candidates for Drug and Gene Delivery.</a> Drug Deliv. Lett. 1, 9-12 (2011).</li><li>Bardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biocompatibility+of+amino+functionalized+CdSe/ZnS+quantum-dot-Doped+SiO2+nanoparticles+with+primary+neural+cells+and+their+gene+carrying+performance.">The biocompatibility of amino functionalized CdSe/ZnS quantum-dot-Doped SiO2 nanoparticles with primary neural cells and their gene carrying performance.</a> Biomaterials. 31, 6555-6566 (2010).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+andgreen+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion andgreen fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li></ol>

يعلن الكتاب أن Miltenyi التكنولوجيا الحيوية GmbH المزيد رعت تقديم هذه المخطوطة. HIQ نانو شركة ( <a href="http://www.hiq-nano.com/index.html">http://www.hiq-nano.com/index.html</a> ) هي تكنولوجيا النانو تدور خارج الشركة نشأت من IIT.

يقدم بروتوكول التجريبية نقطة حاسمة جدا أن تؤخذ بعين الاعتبار. من المهم حقا للعمل في 4 درجات مئوية (على الجليد)، وربما في الظلام خلال جميع الخطوات تلطيخ، بسبب ارتفاع درجات الحرارة والأضواء قد تؤثر سلبا على العائد تلطيخ. يمكن أن الجسيمات النانوية و sonicated معلق أفضل فقط قبل الاستخدام. وتدفق تحليل الخلوي الصحيح يتطلب معايرة الصحيح في قنوات مختلفة. يجب أن يتم تنفيذ المعايرة الصك قبل كل دورة تجريبية. إلى جانب القضايا الفنية مع الأجهزة، ويمكن أن يكون هناك أيضا مشاكل مع وضع العلامات الأجسام المضادة. وهو إلزامي لاستخدام الأجسام المضادة في التركيز المناسب. إذا كان تركيز عالية جدا أو منخفضة جدا، يمكن أن شدة إشارة ديساتيسفيينج تكون العاقبة. مساوئ هذا القلق تقنية الحاجة للعمل مع عينات monodisperse، وعدم القدرة على توطينموقع مصدر الإشارة (أي مقصورات الخلوية المختلفة). وهناك أيضا بعض القيود في اختيار fluorochromes لاستخدامها في تركيبة: الطول الموجي للإثارة ونطاقات الانبعاثات يجب فصل بما فيه الكفاية للسماح للقياس على النحو المناسب. إذا أطياف الأجسام المضادة المستخدمة تداخل، لا بد من التعويض الصحيح. التدفق الخلوي هو وسيلة قوية لتحليل الخلية في وجود أو عدم وجود الجسيمات النانوية. يسمح هذا الأسلوب دراسة multiparametric لخلية، عددا كبيرا من الأحداث فحصها، سرعة تحليل (أكثر من 1،000 خلية / ثانية)، واستنساخ القراءات الإحصائية. يمكن معالجة العينات دون أن تفقد بقاء الخلية. باستخدام جزيئات fluorescently المسمى فمن الممكن للتأهل وقياس استيعاب مجموعات سكانية فرعية في الخلية، والتي يتم تحديدها من قبل علامات محددة تعرض على غشاء الخلية. يمكن تغيير المعلمات الخلية في وجود ق<html> النانوية pecific. اعتمادا على الهدف من البحث، وهذه الاختلافات يمكن أن تستخدم لتحديد ظاهرة معينة، مثل نثر الجانب من الخلايا التي يزيد نسبيا مع زيادة معدل استيعاب جسيمات متناهية الصغر. التعديلات الناجمة عن جسيمات متناهية الصغر من سطح الخلية ويمكن أيضا تمثل الحد من هذه التقنية. لهذا السبب، يجب أن تؤخذ مستقبلات غشاء الخلية دوران دائما في الاعتبار وربما يعرف مقدما لتوصيف السكان الخلية الاهتمام على وجه التحديد. العاهات المدقع التناضح غشاء جسيمات متناهية الصغر في عينات زائد يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية. سمية المواد متناهية الصغر التي تعتمد على الجرعة وينبغي اختبار تجريبيا لكل السكان الخلية. يجب استبعاد الخلايا الميتة واضحة المعالم من الكمي مضان. على سبيل المثال، Annexin V / PI تلطيخ هي واحدة من العديد من الأساليب المستخدمة عادة للكشف عن خلايا نخرية وأفكارك على حد سواء. &quot;&gt; الخلايا الأولية، معربا عن GFP هي أيضا أداة قوية لتحديد جزء من السكان خلية معينة وجمع البيانات دون prelabeling. الجمع مع جزيئات الفلورسنت التكميلية يسمح الكمي سريع جدا ودقيق للتفاعل الخلايا جسيمات متناهية الصغر. ويعتقد المخدرات أو الجينات التسليم ل أن تتحسن في المستقبل من تطبيق النانوية قادرة على اطلاق سراح حمولة المخدرات محددة في الأنسجة المحددة. توظيف النانوية جهري كما محددة ناقلات التسليم و / أو المناعي للالصيدلة يتطلب معرفة البيئة البيولوجية (أي من خلال التدفق الخلوي) لدراسة التفاعلات الخلية جسيمات متناهية الصغر.

المواد متناهية الصغر هندسيا والملهم في الوقت الحاضر اهتمام علماء الحياة عن التطبيقات المحتملة لالطب الحيوي 1. هناك طائفة واسعة من المواد العضوية وغير العضوية يمكن أن تستخدم لإنتاج النانو ذات أشكال مختلفة، والميزات المادية الكيميائية. بين هذه الهياكل، تظاهر النانوية المهندسة من الشكل الكروي إمكانات كبيرة للطب التشخيص ومتعدية 2. هي التي تحرك الأساسية وتصميم السطح قبل تطبيق ممكن، وأنه ينطوي على دراسة عميقة من استجابات الخلايا المستهدفة التالية جسيمات متناهية الصغر الاتصال والتفاعل. سوف النانوية التي يعتقد على أن تدار بشكل متعمد لمواضيع الإنسان تأتي في اتصال مباشر مع عدة أنواع من الخلايا المناعية. مسؤوليتهم للحفاظ على سلامة الجسم يجعلها موضوعا حيويا للتحقيق في لطب النانوي 3. الجزء الخلوية في الجهاز المناعي الفطري تتمثل أساسا عن طريق البلعمة؛ الأكلcytes. فيما بينها، ونسب الوحيدات / بلعم الخلايا المشتقة، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة نظام العصبي المركزي، ولعب دورا رئيسيا في الدفاع المناعي 4،5. وهم قادرون على تحريك ردود وقائية في غضون ساعات قليلة بعد أن واجهت مع جهات أجنبية. علاوة على ذلك، خلايا الوحيدات تنسيق وإرشاد الاستجابة المناعية التكيفية من خلال الإفراج عن السيتوكينات. تحدث كل هذه الأحداث حتى في وجود مواد هندسيا، التي ينظر إليها إلى حد كبير &quot;السوى&quot; من قبل النظام المناعي 6. من بين الأساليب المستخدمة في علم المناعة تاريخيا لتحليل الخلايا، والتدفق الخلوي تمثل واحدة من أقوى الأدوات. علاوة على ذلك، توفر تقنيات لتحديد أو تنقية جزء من السكان مناعية معينة (غالبا ما تستغل الاستبعاد أو وجود بروتين واحد غشاء واحد) يسمح التحقيق الدقيق للآثار جسيمات متناهية الصغر معينة على أن م الابتدائي خاصةنوع ليرة لبنانية 7. ومع ذلك، قد الخلايا تقديم التعديلات الفسيولوجية والمورفولوجية بعد التعرض للجزيئات. كذلك، قد النانوية تتداخل مع المعلمات البصرية محددة، مثل امتصاص أو انبعاث الضوء عند أطوال موجية محددة، والتأثير على النتائج المتحصل عليها 8. لذلك، ينبغي اعتبار حدود الاستخدام والتكيف في نهاية الأمر المقايسات المناعية الكلاسيكية لدراسة المواد الجديدة. هذا العمل يتناول الكشف عن التفاعلات جسيمات متناهية الصغر مع الخلايا المناعية الأولية من قبل التدفق الخلوي. لمعالجة هذه المسألة، و 50 نانومتر FITC-شافي كانوا يعملون 2 النانوية على أنها نموذج المواد متناهية الصغر لوصف الأسلوب. يمكن أن تنتج جسيمات السيليكا بطريقة دقيقة جدا في مقياس النانو متري. الحجم والشكل، والسطح الخصائص، مثل تهمة أو للا مائية، يمكن ضبطها بدقة لزيادة توافق مع الحياة الخاصة بهم 9. العديد من الميزات من شافي 2 النانوية تسمح لهم أن تستخدمنموذج لتسليم المخدرات الجسيمات 10. وعلاوة على ذلك، والأصباغ الفلورية أو نقاط الكم يمكن شرك أو مرتبطة هذه الجسيمات تقديم المفيد نانو أدوات لأغراض التصوير 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="753">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">HBSS</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14170-088</td>
			<td style="width:256px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI-1640 (ATCC Modified)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, High Glucose, phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, Liquid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum (lot n&#176; 1131917)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin 2.5%</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Pooled Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Versene</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td>15040-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse I</td>
			<td style="width:107px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD11b-VioBlue human &#38; mouse</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACS BSA Stock Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Rinsing Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Running buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">autoMACS Running Buffer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Human Pan monocyte isolation kit&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood Column Kit</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Whole Blood CD14 MicroBeads, human</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">LS Column</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MidiMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Red Blood Cell Lysis Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pre-Separation Filters 30 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Analyzer flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">MACSQuant Calibration Beads</td>
			<td style="width:107px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque Premium</td>
			<td style="width:107px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">GEH17544202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:272px;">FITC-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:272px;">Rhodamine-SiO2 nanoparticles (50nm, +45mV)</td>
			<td style="width:107px;">HiQ-Nano Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">12-well plate Falcon</td>
			<td style="width:107px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">353043</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of fluorescent nanoparticle interactions with primary immune cell subpopulations by flow cytometry

وهبوا النانوية المهندسة مع خصائص واعدة جدا لأغراض علاجية وتشخيصية. يصف هذا العمل وسيلة سريعة وموثوق بها من تحليل التدفق الخلوي لدراسة التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع الخلايا المناعية. الخلايا المناعية الأولية يمكن تنقية بسهولة من الأنسجة البشرية أو الماوس عن طريق الأجسام المضادة التي تتوسط العزلة المغناطيسي. في المقام الأول، والسكان مختلفة من الخلايا تعمل في عداد الكريات تدفق يمكن تمييزها من الضوء إلى الأمام ومتناثرة (FSC)، والذي يتناسب مع حجم الخلية، وضوء متناثرة الجانب (SSC)، ذات الصلة إلى الخلية التعقيد الداخلي. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد مستقبلات محددة سطح الخلية تسمح بتحديد عدة مجموعات سكانية فرعية داخل نفس العينة. في كثير من الأحيان، كل هذه الميزات تختلف عندما عزز الخلايا عن طريق مؤثرات الخارجية التي تتغير حالتها الفسيولوجية والمورفولوجية. هنا، 50 نانومتر FITC-شافي تستخدم 2 النانوية كنموذج لتحديد اله استيعاب المواد ذات البنية النانومترية في الخلايا المناعية في الدم البشري. مضان الخلية وزيادة خفيفة متفرقة الجانبية بعد الحضانة مع النانوية سمح لنا لتحديد الوقت والاعتماد تركيز التفاعل بين الخلايا جسيمات متناهية الصغر. وعلاوة على ذلك، ويمكن تمديد هذا البروتوكول للتحقيق رودامين-شافي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة 2 جسيمات متناهية الصغر الأولية، والخلايا المناعية العصبي المركزي نظام المقيمين، معزولة عن فئرانا معدلة وراثيا التي تعبر عن وجه التحديد بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في نسب الوحيدات / البلاعم. أخيرا، التدفق الخلوي وتأكدت البيانات المتعلقة جسيمات متناهية الصغر الداخلي في الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

التدفق الخلوي هو أداة مفيدة لتحديد وتوصيف الخلايا المختلفة، وذلك هو الأسلوب المفضل لتحديد الخلايا المناعية محددة، مثل وحيدات، المحببة، والخلايا T والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا الجذعية (DCS)، والمجموعات السكانية الفرعية الأخرى من الكريات البيض. في محاولة لتوصيف أفضل سلوك خلايا الدم البيضاء استجابة لالنانوية، أجرينا فحوصات الداخلي مع الكريات البيض الأولية المعزولة من الدم من المتبرعين الأصحاء (الشكلان 1 و 2) ومع خط خلية الوحيدات الإنسان (THP-1 الخلايا، الشكل 3) . كما ورد في الشكل 1A، تم التعرف على المجموعات السكانية الفرعية الرئيسية الثلاثة الكريات البيض في الدم بشكل واضح إلى الأمام ونثر الجانبية بعد PBMCs العزلة. علاوة على ذلك، بعد FITC-شافي 2 العلاج، والخلايا الليمفاوية (الرمادي)، وحيدات (الازرق) والمحببة (أحمر) لديها ن مختلفةمعدل استيعاب anoparticle كما يتضح من الأخضر كثافة مضان (الشكل 1B). بروتوكول يسمح صفها تنقية CD14 حيدات الإيجابية الأولية من PBMCs. تقارير الشكل 2A تدفق الخلوي مؤامرة نقطة من CD14 + حيدات في وجود FITC-شافي 2. ويبين الشكل 2B-FITC شافي 2 تدخيل كميا في نفس الخلايا وأعرب في وغاريتمي الرسم البياني الحجم. أجريت تجارب مماثلة على استيعاب THP-1 حيدات تعامل مع زيادة تركيزات FITC-شافي 2 النانوية. واستخدمت الخلايا غير المعالجة عن السيطرة السلبية. ويبين الشكل 3A زيادة تعتمد على الجرعة في نثر جنب مع الأمام دون تغيير في نثر THP-1 خط الخلية. في الشكل 3B، جنبا إلى جنب مع رسوم بيانية للSSC وFSC في كل FITC-2 شافي تركيز جسيمات متناهية الصغر اختبار، يعني كثافة مضان (Mويرد FI) الكمي. وتشير هذه البيانات إلى أن العلاج مع FITC-شافي 2 النانوية يؤدي الى استيعاب تعتمد على الجرعة في وحيدات التي أبرزها تعزيز تحبب الخلايا (الجانب نثر) ومضان (قناة خضراء). للحصول على مزيد من الإيضاحات بشأن نوع من التفاعل بين الخلايا المناعية والنانوية، تم عزل الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية والخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا المناعة العصبي المركزي نظام المقيمين، وتنقيته. استخدام نموذج الفأر وراثيا معربا عن الخلايا الدبقية الصغيرة الخضراء الفلورسنت يسمح التصور من الآليات العصبية التهابات مختلفة. الماوس المعدلة وراثيا B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J المستخدمة في هذا العمل يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة CX3CR1 المروج 12. بعد 7 أيام في المختبر (DIV)، ويظهر مضان المجهري ثقافة الدبقية الابتدائي مختلطة مع عدد كبير من الخلايا النجمية (GFP الخلايا الملتصقة السلبية<html> ق) وبعض الخلايا الخضراء (GFP إيجابية، الشكل 5A). في هذا نموذج الفأر، ثلاثة مجموعات سكانية فرعية الدبقية يمكن تمييزها من قبل التدفق الخلوي مع واحد تلطيخ CD11b الضد: أول CD11b - GFP - (الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الأخرى)، ومجموعة متميزة الثاني من دبقية CD11b + GFP + الخلايا، و الثالث CD11b + GFP - حيوانية (الشكل 4A). هذين مجموعات سكانية فرعية الأخير على حد سواء قادرة على استيعاب النانوية مع زيادة الكفاءة طفيف من GFP + السكان (الذي يمثل الخلايا الدبقية الصغيرة غير ناضجة دوريات نسخ من CX3CR1 المروج)، كما يتضح من تحليل التدفق الخلوي (الشكل 4B). تدخيل حدث يمكن التحقق مزيدا من الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام نفس تركيز النهائي من رودامين-شافي 2 النانوية كما هو مبين في الشكل 5B. = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig1.jpg" /> الشكل 1. FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر الداخلي في الكريات البيض في الدم المعزولة. A) إلى الأمام الممثل نثر (FSC) مقابل نثر الجانب (SSC) التدفق الخلوي مؤامرة نقطة من Ficoll-Paque الكريات البيض في الدم المعزولة. B) الأخضر مضان تراكب الرسم البياني مؤامرة من الكريات البيض في الدم الثلاثة الرئيسية مجموعات سكانية فرعية خلية في وجود من 1 نانومتر FITC-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 1 ساعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig2.jpg" /> <stronز&gt; الشكل 2. FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر الداخلي في CD14 + حيدات المنقى. A) إلى الأمام الممثل نثر (FSC) مقابل نثر الجانب (SSC) التدفق الخلوي مؤامرة نقطة من تنقية حيدات إيجابية CD14. B) مضان أخضر الرسم البياني مؤامرة من الفئات السكانية الوحيدات تنقيته في وجود 1nM FITC-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 1 ساعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig3.jpg" /> الرقم 3. آثار FITC-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر على استيعاب THP-1 الخلايا. A) إلى الأمام الممثل نثر (FSC) مقابل الجانب scatterinز (SSC) التدفق الخلوي مؤامرة نقطة من THP-1 خط خلية الوحيدات، وبعد ساعة من التعرض 1-FITC شافي 2 النانوية زيادة التركيز. B) التي تعتمد على تركيز الاختلاف من نثر الجانب (SSC)، ونثر الأمام (FSC) والأخضر مضان في وجود FITC-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 1 ساعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig4.jpg" /> الشكل 4. رودامين-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر في استيعاب الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية معزولة عن B6.129P-CX3CR1 الفئران tm1Litt / J. أ) البروتين الفلوري الأخضر (GFP) مقابل تدفق CD11b-VioBlue الخلوي مؤامرة نقطة من العلاقات العامةالدبقية مختلطة imary معزولة عن B6.129P-CX3CR1 الفئران tm1Litt / J. وترد السكان في الجزء العلوي الأيمن والأرباع اليمنى السفلى، على التوالي B) مؤامرة مضان الأحمر تراكب الرسم البياني المجموعات السكانية الفرعية الخلايا الدبقية الصغيرة في وجود من 1 نانومتر رودامين-شافي 2 النانوية (+45 بالسيارات) لمدة 30 - CD11b + + GFP وCD11b + GFP. دقيقة (الرسم البياني الحمراء) مقابل التحكم (الرسم البياني الرمادي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51345/51345fig5.jpg" /> الرقم 5. التصور من GFP +-الخلايا الدبقية الصغيرة. (A) الإسفار المجهري في 7 DIV و (ب) متحد البؤر المجهريمن رودامين-شافي 2 جسيمات متناهية الصغر الداخلي (الأسهم الحمراء) في GFP +-الخلايا الدبقية الصغيرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51345/51345fig5highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry at JoVE.com

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

تحليل التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية بواسطة التدفق الخلوي.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

detection-fluorescent-nanoparticle-interactions-with-primary-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.4K Views.  Istituto Italiano di Tecnologia.  تحليل التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية بواسطة التدفق الخلوي. 

Video: Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

غير الجراحية التقطير داخل الرغامى من الفئران مع تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية والرئة التي تصريف التدفق الخلوي

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

التمييز من سبع مجموعات فرعية الخلايا المناعية قبل يومين-fluorochrome التدفق الخلوي

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...