وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للصحة منح 1K22AI097291-01 والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم من المعاهد الوطنية للصحة في إطار جائزة عدد UL1TR000433. علينا أيضا أن نعترف الأستاذ داريل ايرفين في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا والبروفيسور ماتياس ستيفان في مركز فريد هاتشينسون للسرطان لمساهمتهم في الأعمال الأولية على لقاح النانوية وOT-I / لوك الفئران المعدلة وراثيا.

تمت الموافقة على جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة الجامعة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA) في جامعة ميشيغان وتنفيذ وفقا للسياسات والمبادئ التوجيهية الموضوعة. 1. تحضير وتوصيف ICMVs شركة محملة بروتين مستضد ويؤجل الجزيئات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط نسبة 1: 1 المولي من 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DOPC) و1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (ص -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) في الكلوروفورم، والحفاظ على المبلغ الإجمالي للدهون في 1.26 ميكرومول لكل دفعة (أي 500 ميكروغرام من DOPC و 630 ميكروغرام من MPB) في قنينة زجاجية 20 مل (القطر = 28 ملم والارتفاع = 61 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المخدرات محبة للدهون، مثل monophosphoryl الدهون A (MPLA) أو الأصباغ محبة للدهون (على سبيل المثال، لم)، إلى حل الدهون في التركيز المطلوب. تماما إزالة المذيبات العضوية من خلال تطهير مع nitroge الجاف اضافيةن الغاز ووضع العينات تحت فراغ O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات الفيلم الدهون عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 10 ملي مكرر تريس البروبان (BTP، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على عقاقير للذوبان في الماء (على سبيل المثال، مستضدات البروتين). دوامة لمدة 10 ثانية كل 10 دقيقة لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحتويات من زجاج القارورة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وعينات من مكان في حمام الماء المثلج، ويصوتن بشكل مستمر لمدة 5 دقائق باستخدام كثافة 40٪ وضع على 125 W / 20 كيلو هرتز التحقيق طرف sonicator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 ميكرولتر من 150 ملي dithiothreitol (DTT) على كل دفعة (العمل تركيز 2.4 ملم)، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة باستخدام microcentrifuge لالطاولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من 200 ملي CaCl 2 وتخلط مع ماصة (العمل تركيز 33 ملم). احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح لليشابك من MPB التي تحتوي على طبقات الدهون مع DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة، وإزالة طاف، و resuspend في 200 ميكرولتر من ddiH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.7 وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بعد الثاني ddiH 2 O تغسل لإزالة CaCl 2، غير المتفاعل DTT، والمواد البضائع unencapsulated من طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ملغ / مل من 2 كيلو دالتون البولي ايثيلين جلايكول-ثيول (PEG-SH) في ddiH 2 O. resuspend كل عينة ICMV في 100 ميكرولتر من حل PEG-SH واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء عمليتين ddiH 2 O يغسل (الخطوة 1.7) و resuspend بيليه ICMV النهائي في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 ° C. قبل الاستخدام، وخلط تعليق ICMV، أو جسيمات قد تترسب في القاع بعد التخزين لفترات طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوصيف جزيئات، إزالة قسامة صغيرة (~ 10٪) من ICMVs من كل دفعة وتمييع بشكل فردي في إجمالي حجم 1 مل من ddiH 2 O. ضع عينة واحدة في Zetasizer حجم الخلية وقياس الجسيمات، مؤشر التشتت المتعدد، وإمكانات زيتا من العينات باستخدام DLS ونظام قياس المحتملة زيتا (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة). </li></ol> 2. فحص العقدة الليمفاوية تجفيف ICMVs الإسفار الموسومة مع متحد البؤر المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ICMVs محملة-fluorophore الموسومة مستضد وصبغة الفلورسنت محبة للدهون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الموسومة fluorophore البروتين، مثل ردة فعل ألبومين البيض مع فلور اليكسا 555 succinimidyl استر، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد ICMVs الموسومة ب fluorophore في وعاء الدهون، إضافة للدهون صبغة الفلورسنت، (على سبيل المثال، 1،1&#39;-Dioctadecyl-3،3،3 &quot;، 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine، (لم)) أثناء إعداد الفيلم الدهون (الخطوة 1.2) في 0.05٪ كمية الدهون المولي. لدهن ترطيب فيلم (الخطوة 1.3)، واستخدام العازلة التي تحتوي على fluorophore الموسومة مستضد، والتوليف ICMV الكامل على النحو المبين في الخطوات 1،4-1،11. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الادارة تحت الجلد من الجسيمات النانوية في قاعدة الذيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس باستخدام المرذاذ تدفق تسيطر مجهزة غرفة الاستقراء شtilizing 3٪ الأيزوفلورين و 1.5 لتر / دقيقة من تدفق الأكسجين وفقا لIACUC المعتمدة بروتوكول الحيوان. وبمجرد أن الفأر هو فاقد الوعي، قم بالخطوات التالية بسرعة قبل التخدير الخفوت للسماح بالوصول الأمثل لموقع الحقن وقدر من الراحة للحيوان. بدلا من ذلك، استخدم مخروط الأنف السليم المناسب للحفاظ على التخدير. إذا تم تخدير الفئران لفترة أطول من 5 دقائق، وتطبيق التشحيم العين ضروري لتقليل تهيج بعد العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش قاعدة الذيل مع 70٪ من الإيثانول لتطهير وترطيب الجزء الفراء الشعر الرطب لفضح قطعة صغيرة من الجلد واضحة، والتي يمكن استخدامها لتصور إبرة تحت الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجسيمات حقن تعليق يحتوي على المبلغ المطلوب من مستضد ومساعد لكل 100 ميكرولتر من جرعة التطعيم في برنامج تلفزيوني (على سبيل المثال، تم استخدام 10 ميكروغرام OVA و 0.3 ميكروغرام MPLA لكل 100 ميكرولتر من جرعة الحقن في الماضي 6،9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفت الباحث الجسيمات تعليقالزراعة العضوية المحاقن مع إبرة G 27-29 وادخال الإبرة في قاعدة الذيل (~ 5 ملم من منبت الشعر) مع شطبة تواجه صعودا وحقن 50 ميكرولتر من تعليق الجسيمات 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر بضع ثوان للضغط لتحقيق التعادل لمنع الإفراط في عودة تدفق وسحب الإبرة. تكرار الحقن على الجانب الآخر من قاعدة الذيل لاستهداف كل من استنزاف LNS الأربية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الليمفاوية cryosections عقدة والفحص المجهري مع متحد البؤر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفأر مع CO 2 الاختناق، تليها استرواح الصدر التي يسببها وفقا لوافق على IACUC بروتوكول الحيوان. استخراج LNS الأربية وفقا لبروتوكول موضح في بيدويا 23 وتغسل الدم عن طريق وضع الأنسجة في 1 مل من 4 ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيعاب PBS من الأنسجة مع الأنسجة ووضع الأنسجة في cryomolds الأنسجة (10 × 10 × 5 مم 3) معبأة سلفا إلى الأعلى مع أكتوبر تجميد المتوسطة 24. المفاجئة تجميد تيسرفع دعوى قضائية ضد كتلة في النيتروجين السائل لمدة 30 ثانية. بدلا من ذلك، وضع كتلة الأنسجة على الجليد الجاف لمدة 30 دقيقة. تخزين الأنسجة المجمدة في الفريزر -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أقسام الأنسجة 5-10 ميكرون سميكة في ناظم البرد وضعت في -20 ° C 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، نفذ الوسم المناعي، وفحص الأنسجة مع المجهر متحد البؤر كما هو موضح سابقا 24. </li></ol></li></ol> 3. رصد توسيع مستضد معين، luciferase المراسل في التعبير عن CD8 + T الخلايا بعد الجسيمات النانوية التطعيم مع الجامعة التصوير الحيوانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل OVA 257-264 -specific، CD8 + T الخلايا، معربا عن luciferase المراسل من OT-I / لوك الفئران المعدلة وراثيا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس المعدلة وراثيا OT-I / لوك مع CO 2 الخنق وإحداث استرواح الصدر وفقا لIACUC الموافقة على بروتوكول الحيوان. حصاد الطحال بطريقة معقمة عن طريق الوصول إلى التجويف البريتوني وفصل أنسجة من البنكرياس 23 بعناية، ومكان في 5 مل من 4 ° C PBS + 2٪ FBS لنقلها إلى غطاء نسيج الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطحال على 70 ميكرومتر النايلون مصفاة أكثر من 50 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي (تصل إلى 3 الطحال في كل مرة). باستخدام المكبس من حقنة 3 مل، طحن الخلايا من خلال مصفاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الغطاس ومصفاة مع PBS + 2٪ FBS وتجاهل. جلب الحجم الإجمالي إلى 10 مل / الطحال في أنبوب 50 مل، أخذ عينة صغيرة من تعليق خلية العد مع عدادة الكريات، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المغناطيسية مجموعة مختارة السلبية المتاحة تجاريا، عزل السكان خلية CD8 + T باتباع إرشادات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الخلايا مع PBS، عد عدد الخلايا CD8 + T معزولة. لتقييم نقاء من الخلايا CD8 + T معزولة، واحتضان ~ 20،000-30،000 الخلايا في 20 ميكرولتر من الماوس CD16 / 32 الأضداد (0.025 ملغ / مل) لمدة 10 دقيقة، ثم إضافة 20 ميكرولتر من αCD8-APC الأجسام المضادة (0.005 ملغ / مل) واحتضان لمدة 30 دقيقة. المؤسسة العامةrform جميع حضانات في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني + 1٪ ث / ت BSA. أداء تدفق تحليل cytometric 25. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بالتبني من خلايا CD8 + T معزولة والتصور التطعيم آخر توسعها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء نقل بالتبني من خلايا معزولة OT-I / لوك CD8 + T إلى السذاجة C57BL / 6 الفئران عن طريق إدارة 10/01 × 10 5 الخلايا في حجم 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عبر الذيل الوريد الوريد حقن 22 (يوم -1). وبالنظر إلى أن الفراء والجلد الأسود بقع في C57BL / 6 الفئران قد تتداخل مع إشارة للإضاءة الحيوية، البيضاء حلق C57BL / 6 الفئران هي مثالية لهذه الدراسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يوم واحد (يوم 0)، إدارة اللقاح كما هو موضح سابقا (القسم 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة 150 ملغ من وسيفيرين لكل كيلوغرام من وزن جسم الفأر البريتونى في حجم 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. بعد 10 دقيقة، تخدير الفئران مع isoflurane (كما في الخطوة 2.2.1) وتصور الخلايا OT-I / لوك CD8 + T من خلال الحصول على إشارة تلألؤ بيولوجي لمدة 5-10 دقيقة ثإيث نظام تصوير كل الحيوانات (IVIS، تشير إلى ويلسون 26 للتعليمات مفصلة). كرر حسب الضرورة للدراسات طولية. </li></ol></li></ol> 4. خلايا الببتيد-MHC تلطيخ tetramer من PBMCs لتحليل مستضد محددة CD8 + T ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا الإجراء بروتوكول التالية باستخدام إما C57BL / 6 الفئران نقل adoptively مع الخلايا OT-I / لوك CD8 + T أو C57BL / 6 الفئران دون نقل بالتبني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة الوقت المطلوب بعد التطعيم، وجمع ما يقرب من 100 ميكرولتر من الدم (4-6 قطرات) من الفئران عبر تقنية نزيف تحت الفك السفلي 27 في أنبوب المغلفة مع K 2 EDTA وعكس عدة مرات لمنع التخثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب microcentrifuge، إضافة 1 مل من تحلل العازلة، واحتضان لمدة 2-3 دقيقة من أجل إزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). عينات الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1500 x ج وإزالة طاف. إذا كان بيليه يزالppears الحمراء (تشير إزالة غير كاملة من كرات الدم الحمراء)، كرر الخطوة تحلل مع حضانة قصيرة (&lt;1 دقيقة) من تحلل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PBMCs المتبقية مع 1 مل من العازلة FACS (PBS + 1٪ ث / ت BSA) وأجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف و resuspend العينة في 20 ميكرولتر من الماوس CD16 / 32 الأضداد (0.025 ملغ / مل) لمنع الأجسام المضادة غير محددة وFCR بوساطة ملزمة. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا من أنابيب microcentrifuge في 4 مل أنابيب FACS أسفل الجولة. إضافة 20 ميكرولتر من H-2K ب حل OVA Tetramer-SIINFEKL-PE وفقا لمواصفات الشركة الصانعة لكل عينة واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الكوكتيل الأضداد (على سبيل المثال، αCD8-APC، αCD44-FITC، وαCD62L-PECy7 الأجسام المضادة (0.005، 0.005، و 0.002 ملغ / مل تركيز على التوالي)). إضافة 20 ميكرولتر من كل عينة تجريبية، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد. إعداد الضوابط fluorophore واحدة بواسطة labeling الخلايا مع بعضها tetramer الموسومة fluorophore أو الأجسام المضادة في تركيز المشار إليها أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 2 مرات مع العازلة FACS و resuspend بيليه النهائي في FACS العازلة التي تحتوي على 2 ميكروغرام / مل من دابي. الخلايا هي الآن جاهزة للتحليل التدفق الخلوي (التفاصيل والأمثلة يمكن العثور عليها في Scheffold 25). </li></ol>

قدمت بيركن إلمر تكلفة الإنتاج المتكبدة خلال نشر هذا المقال.

يصف بروتوكول المنصوص عليها في هذه المادة توليف وتوصيف نظام جديد جسيمات متناهية الصغر القائم على دهون، ووصف ICMVs، ويوفر عملية التحقق من صحة فعالية تركيبات لقاح القائم على جسيمات متناهية الصغر للحث على CD8 + T استجابات الخلايا مستضد معين. اكتمال ICMV التوليف في كل حالة الما?...

تطوير لقاح التقليدية وقد استخدمت أساسا للنهج العملي من التجربة والخطأ. ومع ذلك، مع التطورات الأخيرة في مجموعة واسعة من المواد الحيوية واكتشاف المحددات الجزيئية لتنشيط جهاز المناعة، أصبح من الممكن الآن لتصميم بعقلانية تركيبات اللقاح مع العظة الفيزيائية الحيوية والكيمياء الحيوية المستمدة من مسببات الأمراض 1،2. على وجه الخصوص، وقد تم فحص مختلف منصات توصيل الدواء الجسيمية الناقلين لقاح لأنها يمكن أن يشترك محملة مستضدات الوحيدات وكلاء مناعة وحماية مكونات لقاح من التدهور، وتعزيز تعاونهم التسليم لمستضد الخلايا تقديم (ناقلات الجنود المدرعة) المقيمين في الليمفاوية العقد (LNS)، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من التحفيز المناعي وتفعيل 3-5. في هذا التقرير، وصفنا تركيب نظام جسيمات متناهية الصغر &quot;محاكية الممرض&quot;، ووصف-interbilayer crosslinked الحويصلات عديد الصفاحات (ICMVs)، والتي تم في السابق أثبتت بمثابة المنهاج لقاح فعالم للالاستنباط من قوة الخلايا اللمفاوية التائية السامة (CTL) والاستجابات المناعية الخلطية في كل النظامية والمخاطية المقصورات الأنسجة 6-9. على وجه الخصوص، والتطعيم مع ICMVs حققت عززت بشكل كبير من مستويات مفتش مصل ضد مستضد الملاريا، مقارنة مع التطعيم مع المواد المساعدة التقليدية (على سبيل المثال، الشب وMontanide) 7 وأيضا أثارت ردود CTL قوية ضد الخلايا السرطانية ونماذج التحدي الفيروسية في الفئران 9. هنا، وذلك باستخدام ICMVs كنظام جسيمات متناهية الصغر لقاح النموذج، وصفنا طرق لتوصيف من لقاح النانو الصيغ، بما في ذلك حجم الجسيمات والقياسات زيتا المحتملة وتتبع الاتجار الجسيمات إلى LNS استنزاف (dLNs) باستخدام التصوير متحد البؤر الأنسجة cryosectioned 7. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم وسيلة تستند التصوير كله والحيوان تحليل توسيع الردود CTL في الفئران بعد نقل بالتبني مستضد محددة CD8 + T الخلايا، معربا عن luciferase المراسل 9،10. وأخيرا، فإننا ديالكاتب تلطيخ tetramer الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) لتقدير الطولي للاستجابات الخلايا T المحلية في تحصين الفئران مع النانوية 6،9. ICMVs هي صياغة جسيمات متناهية الصغر القائم على الدهون توليفها من قبل الانصهار رقابة من الجسيمات الشحمية بسيطة في الهياكل عديد الصفاحات، والتي يتم بعد ذلك ثابتة كيميائيا من قبل جماعات رئيس فوسفورية-functionalized maleimide عبر ربط داخل طبقات الدهون مع ثنائي الثيول crosslinkers 6. مرة واحدة وقد تم تجميع ICMVs، وهو جزء صغير من الجسيمات النانوية يمكن أن تستخدم لتحديد حجم الجسيمات وزيتا المحتملة (أي تهمة سطح جزيئات) مع (DLS) نظام تشتت الضوء الحيوي ومحلل المحتملة زيتا. DLS يقيس التغيرات في تشتت الضوء في تعليق الجسيمات، مما يتيح تحديد معامل الانتشار وحجم الهيدروديناميكية الجسيمات 11. تحقيق ثابت حجم الجسيمات من دفعة لدفعة التوليف أمر بالغ الأهميةمنذ حجم الجسيمات هي واحدة من العوامل الرئيسية التي تؤثر تصريف الليمفاوي من جزيئات اللقاح لdLNs وامتصاص الخلوية لاحق من ناقلات الجنود المدرعة 12،13. بالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على إمكانات زيتا من خلال قياس سرعة الجسيمات عند تطبيق تيار كهربائي، والذي يسمح بتحديد التنقل الكهربي من الجسيمات والجسيمات سطح تهمة 11. ضمان القيم المحتملة زيتا ثابت من الجزيئات المهم منذ تهمة سطح جزيئات يحدد الاستقرار الغروية، التي لديها تأثير مباشر على تشتت الجسيمات أثناء التخزين وبعد المجراة الإدارة 14،15. من أجل تتبع توطين الجسيمات لdLNs، ICMVs يمكن المسمى مع fluorophores المطلوب بما في ذلك الأصباغ محبة للدهون ومولدات المضادات الموسومة تساهميا. بعد التطعيم، والفئران يمكن أن يتم التخلص عند نقاط زمنية مختلفة، dLNs مقطوعة، cryosectioned، وتحليلها مع المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب يسمح التصور من دري اللمفاوينينغ كل من ناقلات اللقاح جسيمات متناهية الصغر والمستضد إلى dLNs. بالإضافة إلى ذلك يمكن أن تكون ملطخة أقسام الأنسجة مع fluorescently المسمى الأجسام المضادة واستخدامها للحصول على مزيد من المعلومات، مثل أنواع من الخلايا المرتبطة مستضد وتشكيل مراكز جرثومي كما بينا سابقا 7. مرة واحدة هو الأمثل لتجميع الجسيمات وأكد الاتجار إلى dLNs، فمن المهم للتحقق من صحة الاستنباط من التوسع في الجسم الحي CTL. من أجل تحليل الاستنباط من CD8 + T الخلايا مستضد معين ردا على التطعيم جسيمات متناهية الصغر، ونحن قد تستخدم مستضد نموذج، ألبومين البيض (OVA)، مع OVA 257-264 الببتيد (SIINFEKL) سائد مناعيا CD8 + T الخلايا حاتمة، والذي يسمح التحاليل المناعية مفصلة من استجابات الخلايا T مستضد معين الاولي 16،17 تطوير لقاح. على وجه الخصوص، لاستجواب ديناميات التوسع والهجرة من CD8 + T الخلايا مستضد معين، ونحن قد ولدتالمزدوج المعدلة وراثيا نموذج الفأر من خلال عبور يراعة luciferase المراسل، معربا عن الفئران المعدلة وراثيا (لوك) مع OT-I الفئران المعدلة وراثيا التي تمتلك خلايا CD8 + T مع T-مستقبلات الخلايا (TCR) محدد لSIINFEKL (بالتعاون مع H-2K ب). من هذه الفئران OT-I / لوك، معربا عن luciferase المراسل، خلايا OT-I CD8 + T يمكن أن تكون معزولة وعلى استعداد لنقل بالتبني في ساذجة C57BL / 6 الفئران. مرة واحدة المصنف، والتحصين الناجح مع النانوية التي تحتوي على OVA يؤدي إلى توسيع الخلايا T نقل، والتي يمكن تتبعها من خلال رصد إشارة تلألؤ بيولوجي مع كامل 9،10 نظام التصوير الحيوانية. وقد استخدمت هذه التقنية التصوير كامل الجسم غير الغازية مع غيرها من المضادات الفيروسية أو ورم في الماضي 18-20، العمليات التي ينطوي عليها توسيع الخلايا التائية في الأنسجة اللمفاوية وتوزيعها على الأنسجة الطرفية بطريقة طولية يكشف. مكملة لتحليل adoptively CD8 + T الخلايا مستضد معين نقلها، endogenoاستجابات الخلايا لنا T وظيفة يمكن أن يتم فحص التطعيم مع مجمع الببتيد رئيسي التوافق النسيجي (MHC) tetramer فحص 21، الذي مجمع tetramer الببتيد MHC، التي تتألف من أربعة الموسومة fluorophore MHC من الدرجة I جزيئات محملة الحواتم الببتيد، يعمل لربط TCR والتسمية CD8 + T الخلايا بطريقة مستضد معين. وtetramer مقايسة الببتيد MHC لا يمكن أن يؤديها إما في الدراسات التشريح النهائية لتحديد CD8 + T الخلايا مستضد معين في اللمفاوية والأنسجة الطرفية أو في الدراسات الطولية مع الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) تم الحصول عليها من توجه الدم التسلسلي. بعد تلطيخ الخلايا الليمفاوية مع الببتيد MHC tetramer، تحليل التدفق الخلوي يتم تنفيذ للتحليلات مفصلة عن النمط الظاهري من CTLs أو الكمي من وتيرتها بين خلايا CD8 + T.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

ويوضح الخطوات المتبعة في تركيب ICMVs في الشكل 1 6. باختصار، هو رطب فيلم الدهون التي تحتوي على أية عقاقير محبة للدهون أو الأصباغ الفلورية في وجود المخدرات ماء. الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مثل الكالسيوم 2+، تضاف لدفع مزيج من الجسيمات الشحمية أنيوني إلى ا...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

التصوير كله والحيوان وتدفق Cytometric تقنيات CD8 + T الردود خلية التحليل من Antigen محددة بعد الجسيمات النانوية التطعيم

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Views.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Video: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

في فيفو الفحص للكشف عن وظيفة محددة مستضد تي خلية عن استخدام نموذج التطعيم

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

محسن انترفيرون-غاما السبت المقايسة لاستجابات الخلية تي التدبير في نموذج خنزير غينيا بعد التطعيم

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

الكمي المتزامن ل CD8 لمكافحة ناقلات الأمراض والتحوير-الخاصة بمكافحة+ تي الخلايا عن طريق MHC أنا تيترامير تلطيخ بعد التطعيم مع ناقل فيروسي

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

عزل الماوس الكلى المقيم CD8+ الخلايا T لتحليل تدفق cytometry

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

فحص قياس الخلايا التدفقي القائم على الحمض النووي/Ki67 لتحليل دورة الخلية لخلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في الفئران الملقحة

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...