تم تقديم الدعم من خلال صناديق بدء التشغيل من قسم البيولوجيا الكيميائية والصيدلة في جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب. شكر وتقدير من أعضاء المختبر يعقوب الذين ساهموا في تقديم الفيديو: نيكولاس غراف.

جميع البروتوكولات هو موضح أدناه هي وفقا للIACUC ومجالس المراجعة المؤسسية IRB من جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب. 1. إعداد الثقافات الحصين العصبية في الأنسجة الثقافة هود ملاحظة: استخدام تقنية معقمة والكواشف في جميع أنحاء بروتوكول 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بولي-D-يسين (0.1 ملغ / مل في H 2 O) coverslips الزجاج المطلي باعتبارها الركيزة للثقافة العصبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 4-5 coverslips الزجاج جولة داخل كل 3.5 سم الأنسجة طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقعة 70 ميكرولتر بولي-D-يسين على كل ساترة 12 ملم. ملاحظة: للتصوير الحية، قاع كوب يمكن استخدام 3.5 سم، والأنسجة صحن الثقافة (بقعة 200 ميكرولتر بولي-D-يسين على جزءا لا يتجزأ من 14 ملم الزجاج ساترة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأطباق التي أعدت في الأنسجة الثقافة هود O / N. للحد من بولي-D يسين التبخر والحفاظ على الأسطح معقمة في نسيج الثقافة هود، وإغلاق النافذة وشاح وإيقاف اله منفاخ O / N. ملاحظة: لا تستخدم أضواء الأشعة فوق البنفسجية أثناء O / N الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، وغسل الأطباق 3x أخرى مع 2 مل من H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة مشاركة H 2 O غسل، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام إلى كل طبق 3.5 سم وترك الأطباق في الحاضنة حتى على استعداد لوحة الخلايا العصبية في الخطوة 1.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتعد الخلايا العصبية قرن آمون من يوم الجنينية 18-19 (E18-19) الفئران (معدلة من Goslin 22). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل الخلايا العصبية فصلها حديثا يوم مع زراعة 1-4 ميكروغرام من الحمض النووي بناء maxiprepped. ملاحظة: عادة 3 ميكروغرام من الحمض النووي يتم transfected في 1-2000000 الخلايا العصبية، مع بقاء 50٪ وكفاءة ترنسفكأيشن من 60٪ (على سبيل المثال بدءا من 2 مليون خلية عصبية: ((2 × 10 6 الخلايا العصبية × 0.5) 0.6) ويوفر تقريبا 1000000 الخلايا العصبية؛. 600،000 منها و transfected 1 كميات مختلفة من الحمض النووي يمكن بناء transfected عند استكشاف مشكلات المحتملة للالإفراط في التعبير، تليها توصيف المناسب لتوطين بناء وظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا العصبية transfected على بولي-D-يسين coverslips المغلفة في مناطق ذات كثافة النهائي من حوالي 200،000 الخلايا العصبية في 3.5 سم الطبق. ملاحظة: لزجاج قاع الطبق، لوحة 40،000-50،000 الخلايا العصبية في منطقة الزجاج 14 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائل الإعلام 4-24 ساعة بعد إعداد الثقافات العصبية، ثم السماح لتطوير الخلايا العصبية في الحاضنة حتى 14-17 يوما في المختبر (DIV) أو المرحلة المطلوبة. </li></ol> 2. الإلتقام الفحص تنبيه: ملاحظة على α-بنغاروتوكسين والنفايات توبوكورارين والمناولة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينصح التعامل مع جميع أعصاب الببتيد في إطار المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية المستوى 2 (BL-2) بروتوكولات البحوث. يجب أن ترتديه كل العتاد الوقاية الشخصية المناسبة. ولابد من إعادة مساحيق السم مجفف بالتجميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. السم شو النفاياتيتم التخلص من دينار في الامتثال للمبادئ التوجيهية الصحة البيئية والسلامة في مؤسسة الحاكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الركام الببتيد المحتملة التي قد شكلت أثناء التخزين، ينبغي طرد مأخوذة α-بنغاروتوكسين لفترة وجيزة قبل الاستخدام، وينبغي أن تستخدم طاف للتجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعلق α-بنغاروتوكسين (بغت) الأسهم إلى تركيز 1 ملغ / مل في H 2 O العقيمة وتخزينها في 10 ميكرولتر مأخوذة في -20 درجة مئوية. وتستخدم الأسهم بغت جانب Fluorescently في 3 ميكروغرام / مل. يستخدم توبوكورارين في تركيز النهائي من 150 ميكرومتر. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط مقاعد البدلاء أعلى كتلة سخان إلى 16 درجة مئوية في غرفة باردة مع رقيقة من الألومنيوم أو لوحة الفولاذ المقاوم للصدأ على القمة. بدلا من ذلك، إذا كان متوفرا، وهو أعلى جهاز التبريد / التدفئة مقاعد البدلاء يمكن استخدامها لكل خطوة تتطلب 16 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بارد خارج الخلية المالحة HEPES مخزنة (HBS تحتوي في ملي: 135 كلوريد الصوديوم، 4.7 بوكل، 10 HEPES، 11 الجلوكوز، 1.2 MgCl 2، و 2.5و CaCl 2، ودرجة الحموضة 7.4) إلى 16 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأطباق الخلايا العصبية لوحة الألومنيوم عند 16 درجة مئوية وباردة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام (الحفاظ على وسائل الإعلام ومكيفة الاحتياطي في الحاضنة لمدة الخطوة 2.8، الإلتقام نقاط زمنية مقايسة) واستبدالها مع 1 مل من 16 درجة مئوية HBS + توبوكورارين (150 ميكرومتر) لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة HBS + توبوكورارين إلى حاوية النفايات وصفت واستبدالها مع 1 مل من 16 درجة مئوية HBS + توبوكورارين (150 ميكرومتر) + α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 [3 ميكروغرام / مل]، يحتضنها في 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة HBS + + توبوكورارين α-بنغاروتوكسين اليكسا 594 المسمى إلى حاوية النفايات وغسل الأطباق 3x أخرى مع 2 مل من 16 درجة مئوية HBS (يغسل يمكن جمعها عبر التطلع في قارورة فراغ يحتوي على 50 مل من 50٪ التبييض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصوير حي السلاسل الزمنية التجارب التالية مستقبلات الإلتقام باستخدام الزجاج القاع 3.5 سم صحن الثقافة، تنفيذ الخطوات 2،1-2،6، ثم نقل إلى طبق مرحلة ساخنة(الجهاز بلتيير) على المجهر، وتبدأ التصوير مع متحد البؤر المجهر TIRF أو الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل T = coverslips 0 نقطة زمنية في طبق من RT بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة، مع استمرار coverslips أخرى إلى الخطوة 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوقت للحصول على نقاط أخرى، استبدل HBS مع تكييف معايرتها 37 ° C وسائل الإعلام (محفوظة في الخطوة 2.4) والعودة إلى الحاضنة لالإلتقام عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: اقترح نقاط إضافية من الوقت T = 15، 30، و 60. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقاط الوقت اللازم، واتخاذ الأطباق من الحاضنة، وغسل بسرعة مرتين مع 2 مل من DPBS RT (DPBS لا الكالسيوم والمغنيسيوم) ثم إصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 دقيقة التثبيت، وإزالة بارافورمالدهيد 4٪ / 4٪ سكروز إلى حاوية النفايات وغسل الأطباق مرتين مع 2 مل RT DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips في RT لمدة 10 دقيقة في حل المناعي كتلة (حل كتلة = 5٪ مصل الحصان، 0.5٪ BSA في DPBS) تحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 لpermeabilإيزي الخلايا العصبية والمناعية المضادة للتمكين GFP تجمع مستقبلات الخلايا و / أو وضع العلامات من البروتينات الأخرى ذات الاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كتلة + 0.2٪ تريتون X-100 واحتضان coverslips في حل المناعي كتلة دون تريتون X-100 لمدة 20-30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حضانات الأجسام المضادة الأولية من coverslips في كتلة لعدة ساعات في RT أو O / N عند 4 درجة مئوية. ملاحظة: حضانة coverslips مع الانتخابات التمهيدية في 4 درجات ثاني / N تنتج بشكل روتيني تحسين نتائج المناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3X مع DPBS (5 دقائق لكل خطوة الغسيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان coverslips مع الأجسام المضادة الثانوية في حل كتلة لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3X مع DPBS (5 دقائق لكل خطوة الغسيل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل coverslips، والتعامل مع كل ساترة فردي: إزالة السائل الزائد من مؤخرة ساترة مع الأنسجة المختبر، ثم قلب ساترة 4 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح تغطية الشرائح لتجف في RT لمدة 30 دقيقة ثم شارعخام في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة لأداء المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور وتحليل التجربة مع المجهري متحد البؤر (الأعمى إلى حالة تجريبية). 60X النفط NA 1.49 هدف الغمر مع الليزر التالية: غاز الأرجون 488 نانومتر، 561 الصمام الثنائي، الصمام الثنائي 640. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام نفس الإعدادات الحصول على الصور، والحصول على واحدة Z قسم الصور مع جسم الخلية العصبية وعدة عمليات شجيري في التركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد α-بنغاروتوكسين اليكسا إشارة مضان GFP والمناعية على طول 20 ميكرومتر من 3-4 التشعبات الداني في الخلايا العصبية، وذلك باستخدام نفس عتبة لتحليل جميع البيانات الإلتقام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات 10-12 الخلايا العصبية لكل نقطة زمنية، وتكرار التجربة مع العديد من الثقافات العصبية المستقلة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors.">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li><li>Bogdanov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+GABAA+receptors+are+directly+recruited+from+their+extrasynaptic+counterparts.">Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts.</a> EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).</li><li>Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mobility+of+functional+GABA(A)+receptors+at+inhibitory+synapses.">Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses.</a> Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).</li><li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Cell+Surface+GABAB+Receptors+Using+an+&#945;-Bungarotoxin+Tag.">Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an &#945;-Bungarotoxin Tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li><li>Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-like+protein+Plic-1+enhances+the+membrane+insertion+of+GABAA+receptors+by+increasing+their+stability+within+the+endoplasmic+reticulum.">The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum.</a> J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).</li><li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Tuning+of+Inhibitory+Neurotransmission+Based+on+GABAAR+Diffusion+Dynamics.">Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics.</a> Neuron. 62, 670-682 (2009).</li><li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+regulate+GABAA+receptor+lateral+mobility+and+clustering+at+inhibitory+synapses+through+serine+327+on+the+gamma2+subunit.">NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).</li><li>Katchalski-Katzir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+synthesis+of+peptides+that+bind+alpha-bungarotoxin+with+high+affinity+and+mimic+the+three-dimensional+structure+of+the+binding-site+of+acetylcholine+receptor.">Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor.</a> Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).</li><li>Scherf, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta+-hairpin+structure+in+a+13-mer+peptide+that+binds+alpha+-bungarotoxin+with+high+affinity+and+neutralizes+its+toxicity.">A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).</li><li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+cell+surface+GABAB+receptors+using+an+alpha-bungarotoxin+tag.">Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine+treatment+induces+subtype-specific+changes+in+GABAA+receptor+trafficking+and+decreases+synaptic+inhibition.">Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).</li><li>Anderson, M. J., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+staining+of+acetylcholine+receptors+in+vertebrate+skeletal+muscle.">Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle.</a> J. Physiol. 237, 385-400 (1974).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkage+and+visualization+of+acetylcholine+receptors+on+myotubes+with+biotinylated+alpha-bungarotoxin+and+fluorescent+avidin.">Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).</li><li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers.">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).</li><li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors.">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+receptor+membrane+trafficking+regulates+spine+maturity.">GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).</li><li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAB+receptor+internalisation+is+regulated+by+the+R2+subunit.">GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li><li>Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+phosphorylation+of+GABAA+receptors+regulates+receptor+insertion+and+tonic+current.">Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current.</a> EMBO. 31, 2937-2951 (2012).</li><li>Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+G-Protein+Coupling+in+an+mGluR6+Point+Mutant+Associated+with+Congenital+Stationary+Night+Blindness.">Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness.</a> Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).</li><li>Terunuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+activation+of+NMDA+receptors+promotes+dephosphorylation+and+alters+postendocytic+sorting+of+GABAB+receptors.">Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).</li><li>Goslin, K. G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Nerve+Cells.">Culturing Nerve Cells.</a> , (1998).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التقنيات الثابتة والحية BBS مقرها الموصوفة هنا يمكن استخدامها لتعقب مستقبلات غشاء البلازما أو غيرها الاتجار البروتين في خطوط الخلايا، الخلايا العصبية، والخلايا الأولية الأخرى. وقد استخدمت بنجاح هذه الطريقة لدراسة الإدراج غشاء وإزالة القنوات الأيونية يجند بوابات و?...

كان رائدا في استخدام جانب fluorescently α-بنغاروتوكسين لدراسة توطين مستقبلات وديناميكية في الدراسات من مستقبلات النيكوتين أستيل 13-15، الهدف الذاتية السم ل. في وقت لاحق، وقد استخدم إدماج الحد الأدنى من الببتيد ملزمة بغت (BBS) لدراسة الاتجار في كل من القنوات الأيونية يجند بوابات مثير والمثبطة والبروتين G مستقبلات جانب 2،10،16-21. يوفر هذا الأسلوب يستند BBS-المزايا لمناهج أخرى تستخدم للدراسات الاتجار مثل أساليب biotinylation السطح، ووضع العلامات الأجسام المضادة الخلايا الحية مع الأجسام المضادة لالحواتم خارج الخلية، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP). خلال سطح الخلية يتم تعديل تساهميا biotinylation الأمينات الحرة، مع القدرة على التأثير في النشاط الخلوي. وكثيرا ما تعرقلت الدراسات القائمة على الضد من قبل المجموعات المستضد السطحي أو السد، والتي يمكن أن تغير الأحداث الاتجار. ويرجع ذلك إلى الخطوة تبيض لFRAP قtudies، مصدر قلق كبير وإتلاف بنية الخلية الأساسية. ميزة إضافية هي أن BBS الموسومة يمكن أيضا أن تستخدم ليبني منهجيات البيوكيميائية مع الاتجار بنغاروتوكسين لتقويم يقترن مستقبلات البيوتين. هذه التقنية قابلة للتطبيق بسهولة لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. للاستخدام في الخلايا التي تعبر عن أستيل النيكوتينيك (nAChR) المستقبلات، يجب استخدام مضاد توبوكورارين nAChR في جميع أنحاء البروتوكول كما هو مبين. سوف يؤدون وضع العلامات بغت سطح البسيطة (أي ما يعادل نقطة T = 0 وقت لبروتوكول الإلتقام) على خلايا untransfected في غياب توبوكورارين تقديم أدلة على nAChR الذاتية. أحد الاعتبارات الهامة لاستخدام هذا الأسلوب هو الإدراج المناسبة من BBS بحيث كان موجودا في مكان خارج الخلية عندما يتم تسليم البروتين من الفائدة لغشاء البلازما. على سبيل المثال، المجالات N-محطة مفارز GABAAR يقيمون في التجويف الحويصلي خلال الجتارficking وتصبح خارج الخلية بعد الإدراج مستقبلات في غشاء البلازما، مما يتيح وضع العلامات المحددة لمستقبلات سطح الخلية وتقييم إزالتها من سطح الخلية الأحداث التقامي. لقد أظهرنا سابقا أن إضافة GFP، MYC، أو BBS الحواتم إلى هذا المجال من مفارز GABAAR صامت وظيفيا. يجب أن يتم تنفيذ الضوابط القياسية لضمان أن يتم التعبير عن بروتين الموسومة عند مستويات مماثلة لبناء معلم، وأنه المترجمة بشكل مناسب، وأنه لا يؤثر على وظيفة مستقبلات. وهذا توصيف البنى transfected مساعدة أيضا في المخاوف من overexpression استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:811px;" width="809">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:227px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:196px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">P3 Primary Cell 4D kit&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Lonza</td>
			<td style="width:196px;">V4XP-3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:227px;">&#945;-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td style="width:201px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:196px;">B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:227px;">&#945;-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td style="width:201px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:196px;">B13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:227px;">&#945;-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td style="width:201px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:196px;">B13423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">(+)-Tubocurarine chloride</td>
			<td style="width:201px;">Tocris</td>
			<td style="width:196px;">2820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">mounting medium&#160;</td>
			<td>DAKO</td>
			<td style="width:196px;">cS703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS no calcium,magnesium&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:196px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">poly-D-lysine&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:196px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">gephyrin antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147 011</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">VIAAT/VGAT antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 002</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:227px;">anti GFP</td>
			<td style="width:201px;">Life Technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:227px;">glass bottom tissue culture dish</td>
			<td style="width:201px;">MatTek Corporation</td>
			<td colspan="2">P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:227px;">coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm</td>
			<td style="width:201px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:196px;">640-0702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using an &#945;-bungarotoxin binding site tag to study gaba a receptor membrane localization and trafficking

فمن الواضح بشكل متزايد أن مستقبلات الناقل العصبي، بما في ذلك ionotropic GABA A مستقبلات (GABAAR)، المعرض الاتجار ديناميكية للغاية والتنقل سطح الخلية 1-7. لدراسة مستقبلات الخلايا السطحية وتوطين الإلتقام، والتقنية الموصوفة هنا يجمع بين استخدام الفلورسنت α-بنغاروتوكسين مع الخلايا معربا عن بنيات تحتوي على بنغاروتوكسين-α (بغت) موقع ملزم (BBS). يستند BBS (WRYYESSLEPYPD) على الوحيدات α عضلة مستقبلات النيكوتين أستيل كولين، الذي يربط بغت مع تقارب عالية 8،9. إدراج موقع BBS يسمح توطين السطحية وقياسات الإدراج مستقبلات أو إزالة مع تطبيق الفلورسنت الخارجية بغت، كما هو موضح سابقا في تتبع GABAA وmetabotropic GABAB مستقبلات 2،10. بالإضافة إلى موقع BBS، ونحن إدراج حساسة للدرجة الحموضة GFP (pHGFP 11) بين الأحماض الأمينية 4 و 5 من الوحيدات GABAAR ناضجة من قبل معيار ماستراتيجيات البيولوجيا والاستنساخ olecular PCR (انظر الشكل 1) 12. وBBS هو 3 &#39;لمراسل GFP حساسة للدرجة الحموضة، مفصولة 13-ألانين حمض أميني / البرولين رابط. لتهريبهم الدراسات وصفها في هذا المنشور التي تستند على عينات ثابتة، يخدم pHGFP كمراسلة من إجمالي الموسومة GABAAR مستويات البروتين الوحيدات، مما يتيح تطبيع بغت المسمى مستقبلات السكان لمجموع السكان مستقبلات. هذا يقلل من خلية إلى أخرى بغت تلطيخ تقلب إشارة الناتجة عن التعبير الأساس أعلى أو أقل من مفارز GABAAR الموسومة. وعلاوة على ذلك العلامة pHGFP يتيح سهولة تحديد الخلايا بناء إعراب عن تجارب التصوير الحي أو ثابتة.

توصيف لبناء BBS الموسومة يتضمن الضوابط المهمة مثل تحديد ما إذا كان البروتين أعرب تجمع بشكل صحيح (ولا سيما مع مستقبلات تتألف من وحدات فرعية متعددة)، ويتاجر إلى سطح الخلية ويموضع بشكل مناسب. وتتكون نقاط الاشتباك العصبي GABA A المثبطة للمستقبلات سطح الكتل التي colocalize مع البر...

Watch this Scientific Journal Video about Using an Î±-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking at JoVE.com

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

نحن هنا شرح استخدام الفلورسنت اليكسا صبغ جانب لα-بنغاروتوكسين لقياس GABA A مستقبلات سطح توطين والإلتقام في الخلايا العصبية قرن آمون. من خلال استخدام التركيبات التي تحمل علامة خارج الخلية القصير الذي يربط α-بنغاروتوكسين، لا يمكن أن يتحقق تحليل البلازما غشاء البروتين الاتجار التقامي.

باستخدام α-بنغاروتوكسين تجليد الوسم الموقع لدراسة مستقبلات GABA A غشاء توطين والاتجار

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

using-an-bungarotoxin-binding-site-tag-to-study-gaba-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

15.7K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine.  نحن هنا شرح استخدام الفلورسنت اليكسا صبغ جانب لα-بنغاروتوكسين لقياس GABA A مستقبلات سطح توطين والإلتقام في الخلايا العصبية قرن آمون. من خلال استخدام التركيبات التي تحمل علامة خارج الخلية القصير الذي يربط α-بنغاروتوكسين، لا يمكن أن يتحقق تحل?...

Video: Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

باستخدام MazeSuite والوظيفية الأدنى مطياف الأشعة تحت الحمراء لدراسة التعلم في الملاحة المكانية

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

التصوير pHluorin الموسومة الإدراج مستقبلات غشاء البلازما إلى الخلايا العصبية في الابتدائية الماوس مثقف

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent neuropsychiatric disorder that stems from the biophysical and cellular actions of nicotine on nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) throughout the central nervous system. Understanding the various nAChR subtypes that exist in brain areas relevant to nicotine addiction is a major priority.
Experiments that employ electrophysiology techniques such as whole-cell patch clamp or two-electrode voltage clamp recordings are useful for pharmacological characterization of nAChRs of interest. Cells expressing nAChRs, such as mammalian tissue culture cells or Xenopus laevis oocytes, are physically isolated and are therefore easily studied using the tools of modern pharmacology. Much progress has been made using these techniques, particularly when the target receptor was already known and ectopic expression was easily achieved. Often, however, it is necessary to study nAChRs in their native environment: in neurons within brain slices acutely harvested from laboratory mice or rats. For example, mice expressing "hypersensitive" nAChR subunits such as &alpha;4 L9&prime;A mice 1 and &alpha;6 L9&prime;S mice 2, allow for unambiguous identification of neurons based on their functional expression of a specific nAChR subunit. Although whole-cell patch clamp recordings from neurons in brain slices is routinely done by the skilled electrophysiologist, it is challenging to locally apply drugs such as acetylcholine or nicotine to the recorded cell within a brain slice. Dilution of drugs into the superfusate (bath application) is not rapidly reversible, and U-tube systems are not easily adapted to work with brain slices.
In this paper, we describe a method for rapidly applying nAChR-activating drugs to neurons recorded in adult mouse brain slices. Standard whole-cell recordings are made from neurons in slices, and a second micropipette filled with a drug of interest is maneuvered into position near the recorded cell. An injection of pressurized air or inert nitrogen into the drug-filled pipette causes a small amount of drug solution to be ejected from the pipette onto the recorded cell. Using this method, nAChR-mediated currents are able to be resolved with millisecond accuracy. Drug application times can easily be varied, and the drug-filled pipette can be retracted and replaced with a new pipette, allowing for concentration-response curves to be created for a single neuron. Although described in the context of nAChR neurobiology, this technique should be useful for studying many types of ligand-gated ion channels or receptors in neurons from brain slices.

In this paper, we describe a useful method to study ligand-gated ion channel function in neurons of acutely isolated brain slices. This method involves the use of a drug-filled micropipette for local application of drugs to neurons recorded using standard patch clamp techniques.

تطبيق أدوية المحلية لدراسة وظيفة مستقبلات أستيل النيكوتينيك في شرائح مخ الفأر

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

توطين الجينات مستقبلات أودورانت في هوائيات الجراد بواسطة الحمض النووي الريبي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral tissues. The hypothalamus in the central nervous system (CNS) is the control center for energy and insulin signal response regulation. Chronic inflammation in peripheral tissues and imbalances of certain chemokines (such as CCL5, TNF&#945;, and IL-6) contribute to diabetes and obesity. However, the functional mechanism(s) connecting chemokines and hypothalamic insulin signal regulation still remain unclear.
In vitro primary neuron culture models are convenient and simple models which can be used to investigate insulin signal regulation in hypothalamic neurons. In this study, we introduced exogeneous GLUT4 protein conjugated with GFP (GFP-GLUT4) into primary hypothalamic neurons to track GLUT4 membrane translocation upon insulin stimulation. Time-lapse images of GFP-GLUT4 protein trafficking were recorded by deconvolution microscopy, which allowed users to generate high-speed, high-resolution images without damaging the neurons significantly while conducting the experiment. The contribution of CCR5 in insulin regulated GLUT4 translocation was observed in CCR5 deficient hypothalamic neurons, which were isolated and cultured from CCR5 knockout mice. Our results demonstrated that the GLUT4 membrane translocation efficiency was reduced in CCR5 deficient hypothalamic neurons after insulin stimulation.

This protocol describes a technique for observation of real-time Green Fluorescence Protein (GFP) tagged Glucose Transporter 4 (GLUT4) protein trafficking upon insulin stimulation and characterization of the biological role of CCR5 in the insulin&#8211;GLUT4 signaling pathway with Deconvolution Microscopy.

صور حية من GLUT4 البروتين الاتجار بالماوس الخلايا العصبية طائي الأولية باستخدام الفحص المجهري Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

وثمة نهج بديل لدراسة الأحداث الرئيسية في نيوروديجينيريشن باستخدام شرائح المخ الفئران السابقين فيفو

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...