سيساعد اختبار التشابك الكيميائي باستخدام BS3 كرابط متشابك في تحديد مستوى سطح خلية مستقبلات الناقل العصبي ، وهو محدد حاسم لفعالية الانتقال العصبي. هذا الفحص مفيد بشكل خاص للتقييم الخاص بمنطقة الدماغ لديناميكيات المستقبلات استجابة لمختلف المؤثرات العقلية أو طرائق الإجهاد النفسي في النماذج الحيوانية. للبدء ، قم بإزالة الدماغ بسرعة من جمجمة الفأر C57BL / 6J الرحيم.
اغمره في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني بارد لمدة 10 إلى 15 ثانية. ضع الدماغ المبرد في مصفوفة الدماغ على الجليد المواجه للجانب البطني لأعلى. لقطع الدماغ التاجي ، أدخل شفرة الحلاقة الأولى عبر الحدود بين المصباح الشمي والسويقة الشمية.
باستخدام ثلاث إلى أربع شفرات حلاقة إضافية ، قم بقطع الجزء الأمامي من الدماغ بشكل متسلسل على فترات ملليمتر واحد. امسك شفرات الحلاقة المدرجة معا لرفع الشرائح الإكليلية عن مصفوفة الدماغ ، مع ترك الجزء الخلفي خلفها. باستخدام الملقط ، افصل شفرات الحلاقة عن بعضها البعض وضعها على سطح مستو ومبرد مع توجيه شريحة الدماغ لأعلى.
لأخذ عينة من قشرة الفص الجبهي، اختر الشريحتين الثانية والثالثة خلف الشريحة الأولى التي تحتوي على السويقة الشمية. باستخدام لكمة الأنسجة أو ملقط ، قم بإزالة المنطقة المطلوبة. ضع المنديل على شفرة الحلاقة المبردة وقسمها بالتساوي إلى قطعتين.
استخدم الطرف الرفيع للملقط لفرم كل منديل إلى قطع على شفرة الحلاقة بحركات رأسية متعددة. قم برفع الأنبوب المسمى مسبقا الذي يحتوي على سائل نخاعي اصطناعي مع 30 ميكرولتر من محلول BS3 أو محلول السيارة E.ثم انقل الأنسجة المفرومة على الفور إلى الأنبوب المطلوب. لأخذ عينات من الحصين ، قم بإزالة الجزء الخلفي من الدماغ من المصفوفة وضعه على ورق ترشيح مبلل على سطح مستو مبرد مع توجيه الجانب الظهري لأعلى.
باستخدام مسبار منحني وملقط يقترب من الجانب الظهري ، قم بتشريح الحصين من نصفي الكرة الأرضية ، ثم قم بفرم الأنسجة ونقلها إلى أنابيب مسننة مناسبة كما هو موضح سابقا. لتفاعل التشابك ، اقلب الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة والمحلول لكسر قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة. احتضان العينات على دوار الأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة وتسجيل وقت بدء حضانة BS3 لكل أنبوب.
ثم إخماد التفاعل مع 78 ميكرولتر من الجلايسين المولي. احتضان أكثر لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية مع دوران ثابت وتسجيل وقت البدء والانتهاء للتبريد. في تحليل اللطخة الغربية بعد التشابك BS3 ، أظهر البروتين غير المتشابك الكمية الإجمالية للوحدة الفرعية alpha5 لمستقبلات GABA-A عند حوالي 55 كيلو دالتون.
ومع ذلك ، أظهر البروتين المتشابك BS3 وحدة فرعية alpha5 مرتبطة بالغشاء الداخلي لمستقبلات GABA-A تهاجر عند حوالي 55 كيلو دالطن ، جنبا إلى جنب مع أنواع البروتين ذات الوزن الجزيئي الأعلى التي تمثل مجمعات البروتين المتشابكة تساهميا مع الوحدة الفرعية alpha5 لمستقبلات GABA-A. علاوة على ذلك ، لوحظ انخفاض كبير وتدريجي في الوحدة الفرعية alpha5 السطحية لمستويات مستقبلات GABA-A في قشرة الفص الجبهي في ثلاثة أسابيع وخمسة أسابيع من UCMS مقارنة بالفئران الخالية من الإجهاد. من المعروف أن المستقبلات تنتقل بين سطح غشاء البلازما والغشاء الداخلي في درجة الحرارة المحيطة.
لذا فإن إجراء تشريح الأنسجة عند درجة حرارة منخفضة أمر مهم. من خلال استخدام مقايسة التشابك ، تم الكشف عن أن الإجهاد النفسي والاجتماعي يمكن أن يعدل بشكل كبير المستويات السطحية لمستقبلات GABA التي تعمل جزئيا كأساس جزيئي للقلق أو السلوك أو العجز المعرفي.
