وأيد هذا العمل ماليا من خلال منحة بحثية من الجمع بين المدرسة الهولندية القومي للبحوث، الحفز التي يسيطر عليها تصميم الكيميائية (NRSC-الحفز). واعترف الدكتور HY Steensma والدكتور GPH فان هيوسدين من جامعة ليدن على دعمهم مع التعبير المؤتلف من S. الخباز Nar1.

1. إعداد إعداد وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل العازلة التي تحتوي على 100 ملي تريس، 250 ملي مول كلوريد الصوديوم و 10٪ الجلسرين في درجة الحموضة 8.5. Deaerate المخزن المؤقت من قبل بيغ مع الأرجون. إدخال المخزن المؤقت إلى غرفة اللاهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم عازلة في جزأين. لجزء واحد (عازلة A) إضافة 1 ملم DL-dithiothreitol (DTT، M ص 154.25 جم / مول) و 1 ملي L-السيستين. الجزء الآخر (B العازلة) لا يحتوي على الحد من وكلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أكسدة واختزال الحلول. جعل 1 مل حلول من 2، 20، و 200 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم (FIC، M ص 329.26 جم / مول) وثنائي ثيونيت الصوديوم (SD، M ص 174.11 جم / مول) في اللاهوائي عازلة B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الوسيط على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 160 ميكرومتر لكل من الوسطاء الأكسدة التالية و 50 مم كلوريد الصوديوم للتخفيف B: N، N، N &#39;، N&#39; -tetramethyl-P-phenylendediamine (TMPD، M ص 237.17 جم / مول، E &#39;0 +0.276 V) ، 2،6-dichlorophenol الإندوفينول(DCIP، M ص 290.08 جم / مول، E &#39;0 +0.217 V)، phenazine ethosulphate (PES، M ص 334.4 غرام / مول، E&#39; 0 +0.055 V)، الميثيلين الأزرق (M ص 319.85 جم / مول، E &#39; 0 +0.011 V)، Resorufin (M ص 235.17 جم / مول، E &#39;0 -0.051 V)، Indigodisulphonate (M ص 466.35 جم / مول، E&#39; 0 -0.125 V)، 2-هيدروكسي-1،4-naphtaquinone ( M ص 174.15 جم / مول، E &#39;0 -0.145 V)، أنثراكوينون-2-سلفونات (M ص 328.28 جم / مول، E&#39; 0 -0.225 V)، Phenosafranin (M ص 322.8 غرام / مول، E &#39;0 -0.252 V)، Safranin O (M ص 350.84 جم / مول، E &#39;0 -0.280 V) والأحمر محايد (M ص 288.8 غرام / مول، E&#39; 0 -0.340 V)، البنزيل viologen (M ص 409.4 غرام / مول، E &#39;0 -0.350 V)، والميثيل viologen (M ص 257.16 جم / مول، E&#39; 0 -0.440 V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف زجاجة في رقائق الألومنيوم لحماية الوسيطالصورة من الضوء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ملغ / مل S. الخباز الموسومة بكتيريا Nar1 البروتين (181 ميكرومتر، M ص 55.2 كيلو دالتون) في المخزن ألف السريع S. الخباز Nar1 في E. القولونية كما بروتين الموسومة بكتيريا باستخدام pET24A التعبير النواقل. تنقية البروتين في غرفة اللاهوائية باستخدام وسائل الإعلام بكتيريا-tactin اللوني (IBA) وتنقية باستخدام نظام تنقية البروتين مثل AKTA تنقية (GE للرعاية الصحية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الإعداد الأكسدة المعايرة في غرفة اللاهوائية على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل القطب المرجعية حج / أجكل والقطب سلك البلاتين إلى السفينة المعايرة. ربط كل من الأقطاب الكهربائية إلى الفولتميتر التي يمكن قياس من بالسيارات حتى V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج شريط التحريك صغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع السفينة المعايرة فوق محرك مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء وعاء المعايرة مع B الاحتياطي، والحل مزيج الوسيط وحل البروتين لتصل إلى 2 مل، أي لتركيزات النهائية من البروتين 72 ميكرومتر و 38 ميكرومتر كلالوسيط. ملاحظة: اعتمادا على تركيز البروتين والوسيط المطلوبة تركيزات كميات من الحلول الثلاثة يجب تعديلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحرك المزيج لمدة 30 دقيقة والتبديل على الفولتميتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 نظيفة الكوارتز أنابيب زجاجية EPR. إدخال الأنابيب في غرفة اللاهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء صغير (حوالي 200 مل) ديوار النيتروجين السائل مع النيتروجين السائل. </li></ol> 2. تنفيذ الأكسدة والاختزال المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر حتى إمكانات الحل مستقرة. ملاحظة: وهذا يعني عمليا أن إمكانيات الانجرافات أقل من 1 بالسيارات في الدقيقة الواحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلاحظ انخفاض القدرة التي قدمها الفولتميتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم العينة الأولى من 200 ميكرولتر وحقن في أنبوب EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنبوب مع سدادة مطاطية وإزالة أنبوب من غرفة اللاهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد أنبوب في النيتروجين السائل على النحو التالي: تحذير! هذا الذي ينبغي القيام به ببطء، وإلا فإن أنبوب سوف كسر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا إدراج رالملكية الفكرية من الأنبوب في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار حتى يمكن سماع صوت الهسهسة. ملاحظة: هذا قد يستغرق فترة تصل إلى 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ببطء بقية الأنبوب بحيث يتم المغمورة الجزء عينة بالكامل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة صغيرة قسامة 1-2 ميكرولتر من محلول 2 مم SD إلى حل في السفينة المعايرة لخفض إمكانات الحل ل-0.6 V. ملاحظة: إذا كان أكثر من 10 ميكرولتر لابد من إضافتها، قم بالتبديل إلى حل ملي 20. كما أنه من الصعب جدا أن اتزان إلى قيمة محتملة محددة، يتم كتابة القيم الفعلية المسجلة على الفولتميتر أسفل وتستخدم لبناء منحنى المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم العينة كما هو موضح في الخطوة 2،3-2،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلاحظ انخفاض القدرة الفعلية التي قدمها الفولتميتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة للأكسدة حتى ازداد احتمال من قبل حوالي 50 بالسيارات. تبدأ بإضافة صغير قسامة 1-2 ميكرولتر من محلول 2 مم FIC. إذا كان أكثر من 10 ميكرولتر لابد من إضافتها، قم بالتبديل إلى حل ملي 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يدون حوث تم إضافة الكثير من الحلول و. ملاحظة: هذا أمر ضروري لتصحيح للتخفيف عينة خلال المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم العينة كما هو موضح في 2،3-2،5 الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلاحظ انخفاض القدرة الفعلية التي قدمها الفولتميتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.9 و 2.12 حتى مجموعة المحتملين من -0.6 V إلى +0.2 V وقد تم تغطية وشغل كل 10 أنابيب الثوري لكل منها 200 ميكرولتر. ملاحظة: كما يتم تقليل حجم الانسحاب مع كل المواقع من الأقطاب قد تحتاج إلى تعديل لديها اتصالات جيدة مع الحل دون تدخل من التحريك. قد يكون من الصعب قياس القدرة بعد الانسحاب من العينة الماضية، وبالتالي فإن إمكانية أن العينة قد تكون أقل دقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، وتخزين العينات EPR المجمدة في النيتروجين السائل حتى القياسات الثوري يمكن أن يحدث. </li></ol> 3. قياس المعايرة عينات عن طريق EPR التحليل الطيفي وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل EPR أطياف مختلفةعينات المعايرة على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة عالية فراغ لاجلاء ناظم البرد الكوارتز إلى &lt;10 -5 شريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على مياه التبريد من المغناطيس EPR. فتح تدفق الهواء الجاف من خلال تجويف EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على إمدادات الطاقة إلى المغناطيس والكمبيوتر من EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل برنامج تردد المعايرة. تعيين المعلمات قياس EPR. ربط ناظم البرد إلى الهليوم السائل ديوار. تبريد تجويف إلى 9-16 K. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال عينة EPR في تجويف. تسجيل الطيف EPR. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الأنواع المختلفة الثوري واستخدام أفضل الأطياف لقياس الإشارات. تحقيق EPR الكمي التي كتبها التكامل المزدوج للالأطياف والمقارنة مع طيف من النحاس الخارجي الحل القياسي 10 ملي كبريتات النحاس 10/04 ملم حمض الهيدروكلوريك / 2 M NaClO 4. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل منحنى المعايرة على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم إشارة السعة EPR في ز القيمة التي هي من سمات لالفقرةالأنواع المغناطيسية التي تهم ضد المحتملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير EPR على نطاق وإشارة إلى السعة يدور / حجم الجزيء باستخدام الكمي EPR من الخطوة 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح السعة إشارة من كل عينة لتخفيف الذي حدث بسبب اضافات من المؤكسدة أو الحد من وكيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح القدرة على احتمال منتصف الإشارة القطب حج / أجكل. ملاحظة: الإلكترود المرجعي حج / أجكل (مع المشبعة بوكل) لديها امكانات منتصف +0.194 V مقابل الكهربائي الهيدروجين القياسي (SHE) عند 25 درجة مئوية. ولذلك، إذا إمكانات على الفولتميتر يقرأ حوالي -0.6 V، فإن احتمال مع الإشارة إلى SHE هي -0.4 V. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب إشارة إلى المعادلة نرنست على النحو التالي: بالنسبة لأنواع لهو ممغطس في الدولة خفضت: <img alt="المعادلة 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> بالنسبة لأنواع لهو ممغطس في سالدولة xidized: <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> بالنسبة لأنواع لغير متوازي المغنطيسية في حالة وسطية: <img alt="المعادلة 3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> هذه المعادلات صالحة للتفاعلات الأكسدة والاختزال التي يتم فيها نقل إلكترون واحد، لذلك ن = 1. E = المحتملة في فولت E = م إمكانات منتصف الطريق في فولت F = ثابت فاراداي = 96480 C · مول -1 R = الغاز ثابت = 8.314 J · K -1 · مول -1 T = درجة الحرارة في كلفن </li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode.">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li><li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+(Hildenborough).">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

سلسلة من 13 وسطاء الأكسدة تسمح توازن الأكسدة والاختزال في الحل في مجموعة من -0.45 إلى +0.3 V مقابل SHE (الجدول 1 والشكل 3). حسنا فوق وتحت هذه الإمكانات كافة وسطاء إما تخفيض تماما أو أكسدة تماما، وبالتالي لا يوجد موازنة إضافية مع المراكز الأكسدة الفعالة من البروتين يمك...

ومن الملفت للنظر أن العمليات الكيميائية الأساسية إدامة الحياة على هذا الكوكب، التمثيل الضوئي، وتثبيت النيتروجين والتنفس، ويحفزه مجمعات البروتين كبيرة تحتوي على مجموعة واسعة من العوامل المساعدة الأكسدة العضوية وغير العضوية. وتشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 30٪ من جميع البروتينات تحتوي على واحد أو أكثر من العوامل المساعدة المعادن. 1،2 تحديد وتوصيف يمكن تأسيس العوامل المساعدة الأكسدة باستخدام الكيمياء الكهربائية المباشر (على سبيل المثال، والبروتين فيلم القياس الفولطي) أو معايرات الأكسدة والاختزال. تقنيات متكاملان في طبيعتها وإمكانية تطبيقها. القياس الفولطي يقدم تقرير سريع من إمكانات نقطة المنتصف وحركية نقل الإلكترون من العوامل المساعدة التي يمكن أن تتفاعل مع سطح القطب. 3،4 عادة هذا يعمل بشكل جيد للبروتينات نقل الإلكترون، مثل السيتوكروم ج أو فيريدوكسين. ويعمل بعض الأحيان لبروتينات أكثر تعقيدا التي تم يجمد إلى سطح القطب. معرفة تفصيلية للطبيعة العوامل المساعدة في البروتين يجب أن تكون متاحة، وسوف voltammogram لا تعطي أي معلومات مباشرة عن هوية العامل المساعد. معايرات الأكسدة والاختزال هي أكثر شاقة لتنفيذ وتتطلب كميات ملغ من البروتين. ومع ذلك، وأنها توفر معلومات عن إمكانات نقطة المنتصف وهوية العامل المساعد. وعلاوة على ذلك 5 في المعايرة واحدة يمكن رصد العوامل المساعدة متعددة في البروتين. مبدأ المعايرة الأكسدة هو أن البروتين النشط الأكسدة أو إنزيم يتم تخفيض كيميائيا أو أكسدة. من أجل التأكد من أن تتفاعل مع العوامل المساعدة تستخدم وسطاء اختزال أو أكسدة الأكسدة. تتفاعل هذه سطاء الأكسدة أيضا مع القطب بحيث يمكن قياس إمكانيات الحل. الوسطاء بمثابة منطقة عازلة الأكسدة ويوازن بين العوامل المساعدة في البروتين والقطب. بعد الإستعداد كيميائيا القدرة على القيمة المطلوبة، يتم رسم العينة وتجميدها في النيتروجين السائل لAW بسرعةأيت مزيد من التحليل مع التقنيات الطيفية. التحليل الطيفي EPR مفيد بشكل خاص في هذا الصدد لأنها يمكن أن تستخدم لقياس كميا مراكز المعادن ممغطس أو المتطرفين العضوية. المعايرة الأكسدة يمكن أن يؤديها في اتجاهين: من الأقل إلى الأعلى أو من الأعلى إلى إمكانية نقطة المنتصف منخفضة. والخيار يتوقف على استقرار العوامل المساعدة قيد الدراسة. في كثير من الأحيان أنه من الحكمة أن تبدأ في قدرة منخفضة وإضافة إلى أكسدة بالتدريج زيادة إمكانات. وهذا ما يسمى المعايرة المؤكسدة ويوصف هنا. نحن هنا تظهر المعايرة الأكسدة من الكتلة الحديد والكبريت التي تحتوي على البروتين Nar1 من خميرة الخباز. ويشارك هذا البروتين، من المحتمل كما بروتين سقالة، في عصاري خلوي الحديد والكبريت السكروز مجموعة الآلات (CIA مسار). 6،7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

مراقبة الكترون ممغطس الرنين (EPR) معايرات الأكسدة والاختزال هي وسيلة قوية لتحديد إمكانية منتصف العوامل المساعدة في البروتينات والتعرف وتحديد العوامل المساعدة في حالة الأكسدة كشف الخاصة بهم. تقنية مكملة لالكيمياء الكهربائية المباشر (القياس الفولطي) النهج، لأنها لا تقدم معلومات عن معدلات نقل الإلكترون، ولكن لا تحديد هويتهم والأكسدة حالة العوامل المساعدة في البروتين قيد الدراسة. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع إلى أي البروتين تحتوي على ممغطس الإلكترون الرنين (EPR) العامل المساعد للكشف. والمعايرة النموذجية تتطلب 2 مل البروتين مع تركيز العامل المساعد في مجموعة من 1-100 ميكرومتر. ومعاير البروتين مع اختزال الكيميائية (ثنائي ثيونيت الصوديوم) أو أكسدة (فروسيانيد البوتاسيوم) من أجل اتزان العينة في إمكانات معينة. يتم توصيل سلك البلاتين وإشارة القطب حج / أجكل إلى فولتمتر لقياس إمكانات الحل البروتين. ويتم استخدام مجموعة من 13 سطاء الأكسدة المختلفة لكي تتوازن بين العوامل المساعدة الأكسدة من البروتين والأقطاب. يتم رسمها العينات في الإمكانيات المختلفة والأطياف الكترون ممغطس الرنين، مميزة لالعوامل المساعدة الأكسدة المختلفة في البروتين، ويتم قياسها. ويتم تحليل مؤامرة من شدة إشارة مقابل إمكانية العينة باستخدام معادلة نرنست من أجل تحديد إمكانية منتصف العامل المساعد.

وأسفرت المعايرة الأكسدة من الكتلة الحديد والكبريت التي تحتوي على البروتين Nar1 من خميرة الخباز في تحديد العوامل المساعدة ثلاثة مختلفة: Nar1: أ [3Fe-4S] العنقودية، و[4Fe-4S] العنقودية ومركزا الحديد وحيدات النوى (الشكل 1) . وتتميز إشارات الثوري التي كتبها g-قيمهم: ل[3Fe...

Watch this Scientific Journal Video about EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1 at JoVE.com

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR رصدت الأكسدة والاختزال المعايرة من العوامل المساعدة لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

epr-monitored-redox-titration-cofactors-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K Views.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

Video: EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

تشريح السكيراء الجعوية زقاق

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

حفز Phosphoproteomics الكمية في الأحماض الدهنية السكيراء الجعوية</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

التعبير وتنقية عبر الغشاء التليف الكيسي بروتين منظم المواصلة في خميرة الخباز

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

تنقية التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم البروتين المعبر عنه في<em&gt; خميرة الخباز</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

قياس مرنا تسوس الأسعار<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; استخدام<em&gt; rpb1-1</em&gt; سلالات

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.