这项工作是由财政从荷兰国家研究学院结合，催化化学设计（NRSC-催化）控制的研究资助。 HY Steensma博士和GPH面包车赫斯登博士莱顿大学都承认他们与S的重组表达支持酵母 Nar1。

1.准备设置和解决方案<ol><li>制备含有100mM的Tris，250mM的NaCl和10％甘油在pH 8.5缓冲溶液。通过用氩气冲洗脱气缓冲。引入缓冲器成厌氧室中。 </li><li>划分的缓冲器中的两个部分。一个部分（缓冲液A）中添加1mM的DL-二硫苏糖醇（DTT，M R154.25克/摩尔）和1mM L-半胱氨酸。其它部分（缓冲液B）不包含还原剂。 </li><li>制备氧化剂和还原剂溶液。使1毫升溶液2，20，和200毫铁氰化钾（FIC，M R329.26克/摩尔）和连二亚硫酸钠（SD，M R174.11克/摩尔）在厌氧缓冲器B. </li><li>准备调停结构如下： <ol><li>添加160μM的每种以下的氧化还原介体和50mM的NaCl的缓冲B：N，N，N&#39;，N“ -四甲基-对- phenylendediamine（TMPD，M R237.17克/摩尔，E&#39;0 0.276 V）的，2,6-二氯酚靛酚（DCIP，M R290.08克/摩尔，E&#39;0 0.217 V），吩嗪ethosulphate（PES，M R334.4克/摩尔，E&#39;0 0.055 V），亚甲蓝（Mr为319.85克/摩尔，E&#39; 0 0.011 V）中，试卤灵（Mr为235.17克/摩尔，E&#39;0 -0.051 V）中，Indigodisulphonate（Mr为466.35克/摩尔，E&#39;0 -0.125 V），2-羟基-1,4- naphtaquinone（ Mr为174.15克/摩尔，E&#39;0 -0.145 V），蒽醌-2-磺酸（Mr为328.28克/摩尔，E&#39;0 -0.225 V），Phenosafranin（Mr为322.8克/摩尔，E&#39;0 -0.252 V），番红O（Mr为350.84克/摩尔，E&#39;0 -0.280 V），中性红（Mr为288.8克/摩尔，E&#39;0 -0.340 V），苯紫精（Mr为409.4克/摩尔，E “0 -0.350 V）和甲基紫精（M R257.16克/摩尔，E&#39;0 -0.440 V）。 </li><li>包裹在铝箔的瓶子，以保护介期从光​​。 </li></ol></li><li>制备10毫克/毫升S。酵母链球菌标记Nar1蛋白（181微米，M R 55.2 kDa的）的缓冲A.快车S.酵母 Nar1在E.大肠杆菌作为链球菌标记蛋白使用杨pET24a表达载体中。采用链球菌-tactin层析介质（IBA）纯化该蛋白质在厌氧室中和纯化使用蛋白纯化系统如AKTA净化器（GE Healthcare）上。 </li><li>准备氧化还原滴定设置在厌氧室如下： <ol><li>连接一个Ag / AgCl参考电极和铂丝电极的滴定容器中。两个电极连接到可从毫伏测量多达五伏特计</li><li>插入一个小的搅拌棒。 </li><li>放置磁性搅拌器上方滴定容器中。 </li><li>填用缓冲液B，介体混合溶液和蛋白质溶液至高达2毫升， 即以最终浓度72μM的蛋白质和38μM每个滴定管调解员。注意：取决于蛋白质浓度和所需的介体浓度下，三种溶液的量应调整​​。 </li><li>搅拌30分钟，接通电压表。 </li></ol></li><li>准备10清洁石英玻璃EPR管。引入管在厌氧室中。 </li><li>填写小（ 大约 200ml）中与液氮液氮杜瓦。 </li></ol> 2.进行氧化还原滴定<ol><li>等到溶液的电位是稳定的。注意：在实践中，这意味着潜在的漂移小于每分钟1毫伏。 </li><li>记下的电压表给出的潜力。 </li><li>绘制的200微升第一个样品，注入的EPR管。 </li><li>盖上管用橡胶塞，并从厌氧室中取出试管。 </li><li>冻结管在液氮如下：小心！这必须慢慢地进行，否则该管将打破。 <ol><li>首先插入吨IP的管中的液氮。 </li><li>等到嘶嘶声可以听到。注意：这可能需要长达10秒。 </li><li>慢慢插入管的其余部分，使得样品部分被完全淹没。 </li></ol></li><li>加一个小的等分试样1-2微升2mM的SD溶液在滴定容器中的溶液，以降低该溶液的电位-0.6V。 注意：如果超过10微升已被添加，切换至20mM的溶液。因为它是非常困难的泊至一个特定的潜在价值，记录在电压表的实际值被记录下来，并用来构造滴定曲线。 </li><li>按照步骤2.3-2.5描述抽取样本。 </li><li>记下的电压表给出的实际潜力。 </li><li>添加氧化剂，直到潜在的增加了大约 50毫伏。开始加入小等分试样1-2微升2mM的FIC溶液。如果超过10微升已被添加，切换至20mM的溶液。 </li><li>记下豪瓦特得多的解决方案已被添加。注意：这是必要的，以校正在滴定过程中样品稀释。 </li><li>在步骤2.3-2.5描述抽取样本。 </li><li>记下的电压表给出的实际潜力。 </li><li>重复步骤2.9和2.12，直到潜在的范围从-0.6 V至0.2 V已覆盖全部10 EPR管200微升充满每一个。 注意：与每个撤出体积减小电极的定位可需要调整与未经搅拌的干扰的溶液有良好的接触。它可能是难以测量的最后一个样本的撤出，因此该样品的电势可以是较不准确后的潜力。 </li><li>任选地，储存冷冻EPR样品在液氮中直至EPR测量可以发生。 </li></ol> 3.测量滴定样品采用EPR谱和数据分析<ol><li>不同的记录EPR谱滴定样品如下： <ol><li>使用高真空泵撤离石英低温恒温器，以&lt;10 -5杆。 </li><li>接通EPR磁体的水冷却。开的干燥空气通过EPR腔的流动。 </li><li>接通电源，以在磁铁和EPR的计算机。 </li><li>运行频率校准程序。设置EPR测定参数。低温恒温器连接到液氦杜瓦。冷却腔，以9-16 K. </li><li>引入腔中的EPR样品。记录的EPR谱。 </li></ol></li><li>识别不同的EPR种类和使用的最佳光谱来量化的信号。实现的EPR定量由光谱和比较的外铜标准溶液光谱的双重积分的10mM 硫酸铜 / 10mm以上的HCl / 2M的的NaClO 4 8 </li><li>使滴定曲线如下： <ol><li>绘制的EPR信号幅度在g-值是特征为第磁种对潜在的利益。 </li><li>通过使用EPR定量来自步骤3.2改变的EPR信号幅度比例为自旋/分子尺度。 </li><li>校正每个样品为已发生因氧化或还原剂的添加，该稀释的信号振幅。 </li><li>校正为Ag / AgCl参考电极的中点电位的电位。 注意：Ag / AgCl参考电极（用饱和的KCl）具有0.194 V相对于标准氢电极（SHE），在25℃的中间电位。因此，如果在电压表的电位读出大约 -0.6 V时，参照SHE电位为-0.4 V. </li></ol></li><li>该信号适合于能斯特方程如下： 对于一个物种，是顺磁性的还原态： <img alt="式（1）" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq1.jpg" width="200" /> 对于一个物种，是顺在oxidized状态： <img alt="公式2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq2.jpg" width="200" /> 对于一个物种，是顺处于中间状态： <img alt="公式3" fo:content-width="2.2in" src="/files/ftp_upload/51611/51611eq3.jpg" width="220" /> 这些方程是有效的，其中一个电子转移的氧化还原反应，因此n = 1。 E =潜力伏 ËM =在伏中点电位 F =法拉第常数= 96,480·C·摩尔-1 R =气体常数= 8.314·J·K -1·摩尔-1 T =温度在开尔文</li></ol>

<ol>
	<li>Lippard, S. J., Berg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Bioinorganic Chemistry. , (1994).</li><li>Bertini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioinorganic Chemistry. , 611 (1994).</li><li>Leger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+Electrokinetics:+Using+Protein+Film+Voltammetry+To+Investigate+Redox+Enzymes+and+Their+Mechanisms.">Enzyme Electrokinetics: Using Protein Film Voltammetry To Investigate Redox Enzymes and Their Mechanisms.</a> Biochemistry. 42, 8653-8662 (2003).</li><li>Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Electron+Transfer+of+Redox+Proteins+at+the+Bare+Glassy+Carbon+Electrode.">Direct Electron Transfer of Redox Proteins at the Bare Glassy Carbon Electrode.</a> Eur. J. Biochem. 182, 523-530 (1989).</li><li>Pierik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+Properties+of+the+Iron-Sulfur+Clusters+in+Activated+Fe-Hydrogenase+from+Desulfovibrio+vulgaris+(Hildenborough).">Redox Properties of the Iron-Sulfur Clusters in Activated Fe-Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough).</a> Eur. J. Biochem. 209, 63-72 (1992).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J., Netz, D. J., Muhlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hydrogenase-like+Nar1p+is+Essential+for+Maturation+of+Cytosolic+and+Nuclear+Iron-Sulphur+Proteins.">The Hydrogenase-like Nar1p is Essential for Maturation of Cytosolic and Nuclear Iron-Sulphur Proteins.</a> EMBO J. 23, 2105-2115 (2004).</li><li>Sharma, A. K., Pallesen, L. J., Spang, R. J., Walden, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+Iron-Sulfur+Cluster+Assembly+(CIA)+System:+Factors,+Mechanism,+and+Relevance+to+Cellular+Iron+Regulation.">Cytosolic Iron-Sulfur Cluster Assembly (CIA) System: Factors, Mechanism, and Relevance to Cellular Iron Regulation.</a> J. Biol. Chem. 285, 26745-26751 (2010).</li><li>Aasa, R., V&#228;nng&#229;rd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPR+Signal+Intensity+and+Powder+Shapes.">EPR Signal Intensity and Powder Shapes.</a> A Reexamination. J. Magn. Reson. 19, 308-315 (1975).</li><li>Balk, J., Pierik, A. J. A., Netz, ., J, D., M&#252;hlenhoff, U., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nar1p,+a+conserved+eukaryotic+protein+with+similarity+to+Fe-only+hydrogenases,+functions+in+cytosolic+iron-sulphur+protein+biogenesis.">Nar1p, a conserved eukaryotic protein with similarity to Fe-only hydrogenases, functions in cytosolic iron-sulphur protein biogenesis.</a> Biochem. Soc. Trans. 33, 86-89 (2005).</li><li>Hennessy, D. J., Reid, G. R., Smith, F. E., Thompson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferene+-+a+new+spectrophotometric+reagent+for+iron.">Ferene - a new spectrophotometric reagent for iron.</a> Can. J. Chem. 62, 721-724 (1984).</li><li>Flint, D. H., Emptage, M. H., Guest, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarase+A+from+Escherichia+coli:+purification+and+characterization+as+an+iron-sulfur+cluster+containing+enzyme.">Fumarase A from Escherichia coli: purification and characterization as an iron-sulfur cluster containing enzyme.</a> Biochemistry. 31, 10331-10337 (1992).</li><li>Hagedoorn, P. L., Driessen, M. C., Mvd Bosch, ., Landa, I., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperthermophilic+Redox+Chemistry:+a+Re-evaluation.">Hyperthermophilic Redox Chemistry: a Re-evaluation.</a> FEBS Lett. 440, 311-314 (1998).</li><li>Tadesse, M. A., D'Annibale, A., Galli, C., Gentili, P., Sergi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+the+relative+contributions+of+redox+and+steric+issues+to+laccase+specificity+towards+putative+substrates.">An assessment of the relative contributions of redox and steric issues to laccase specificity towards putative substrates.</a> Organic &amp; biomolecular chemistry. 6, 868-878 (2008).</li></ol>

作者什么都没有透露。

该系列13的氧化还原介体允许从-0.45至+ 0.3V的SHE相比（ 表1和图3）的氧化还原平衡中，在范围内的溶液。井的上方和下方，这些电位所有介体或者完全降低或完全被氧化，因而没有进一步平衡与​​蛋白质的氧化还原活性中心可以发生。这是一个重要的概念，如在文献中有时氧化还原滴定与只有两个或三个介质进行的，只允许一个窄的范围内被测量11。这种氧化还?...

令人吃惊的是最基本的化学过程，在这个星球上，光合作用，固氮和呼吸维持生命，是由含有多种有机和无机氧化还原辅助因子大蛋白复合物催化。据估计，所有蛋白质的约30％包含一种或多种金属辅因子。1,2-识别和表征所述氧化还原辅助因子可以使用直接电化学（ 例如 ，蛋白质膜伏安）或氧化还原滴定来确定。这两种技术都在他们的先进性和适用性的互补性。伏安法提供快速测定中点电位和辅因子的电子转移动力学，可以与电极表面反应的3,4通常这可以很好地用于电子转移蛋白，如细 ​​胞色素C或铁氧还蛋白。它有时适用于已固定于电极表面更复杂的蛋白质。的详细知识在蛋白辅因子的性质必须是可用的，因为伏安不会给对辅因子的身份的任何直接信息。氧化还原滴定更费力执行，并要求毫克的量的蛋白质。然而，它们提供的中点电位和辅因子的身份的信息。5此外，在一个单一的滴定中的蛋白质的多个辅因子可以被监视。 氧化还原滴定的原则是，氧化还原活性蛋白质或酶进行化学还原或氧化。为了确保该辅因子与还原剂或氧化剂的氧化还原介体被用于反应。这些氧化还原媒介剂也发生反应的电极，以使溶液的电位可以被测量。该介质充当氧化还原缓冲液中的蛋白质和电极的辅因子之间平衡。后化学已达平衡的电位到期望值，样品被吸入，并迅速在液氮中冷冻，以AWAIT进一步分析光谱技术。因为它可用于定量测定顺磁性金属中心，或有机基团EPR谱是在这方面是特别有用的。 氧化还原滴定可以在两个方向进行：从低到高或由高向低中点电位。该选择取决于所研究的辅助因子的稳定性。往往是明智的，开始在低电位，并添加氧化剂，以逐步增加的潜力。这就是所谓的氧化滴定并在这里被描述。这里，我们表明含蛋白质Nar1来自酿酒酵母的铁-硫簇的氧化还原滴定。这种蛋白参与，有可能作为支架蛋白，在细胞内铁硫簇生物合成机械（CIA途径）。6,7

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference electrode (Ag/AgCl)</td>
			<td style="width:101px;">Radiometer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chemicals</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EPR spectrometer</td>
			<td style="width:101px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethyl-p-phenylendediamine (TMPD) &#183;(HCl)2</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">637-01-4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2,6-dichlorophenol indophenol (DCIP), sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">620-45-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenazine ethosulfate (PES)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">10510-77-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">122965-43-9</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resorufin, sodium salt</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">34994-50-8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Indigodisulfonate (indigo carmine)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">860-22-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-hydroxy-1,4-naphtaquinone</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">83-72-7</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:216px;">Anthraquinone-2-sulfonate Na+ H2O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">153277-35-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenosafranin</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">81-93-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Safranin O</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">477-73-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral red</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">553-24-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Benzyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1102-19-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methyl viologen</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">1910-42-5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epr monitored redox titration of the cofactors of saccharomyces cerevisiae nar1

电子顺磁共振（EPR）监测氧化还原滴定是一个功能强大的方法来确定的辅助因子的中点电位中的蛋白质，并确定和量化的辅因子在其可检测的氧化还原状态。 该技术是互补的直接电化学（伏安）接近，因为它不提供对电子传输速率的信息，但是并正在研究建立在蛋白质的辅助因子的身份和氧化还原状态。该技术广泛适用于含有电子顺磁共振（EPR）检测辅因子的任何蛋白质。 一个典型的滴定需要2 ml蛋白质具有在1-100微米的范围内的辅因子浓度。该蛋白质以泊样品在一定的电势滴定用化学还原剂（连二亚硫酸钠）或氧化剂（铁氰化钾）。铂丝和一个Ag / AgCl参考电极连接到伏特计来测量蛋白质溶液的电位。一组13种不同的氧化还原介体时所使用的蛋白质的氧化还原辅因子和电极之间达到平衡。样品被绘制在不同的电位和电子顺磁共振光谱特性为在该蛋白质的不同的氧化还原辅因子，被测量。信号强度与样品潜在的情节是使用能斯特方程以确定该辅因子的中点电位进行分析。

含蛋白质Nar1来自酿酒酵母的铁-硫簇的氧化还原滴定导致三种不同的辅助因子的鉴定：Nar1：一个[3FE-4S]簇，一个[4FE-4S]簇和单核铁中心（ 图1） 。 EPR的信号的特征在于它们的G-值：对于[3FE-4S] + Gž2.01克2.00 交叉 （ 图1B）;对于[4FE-4S] +，Gž2.02克Ÿ1.93，G X 1.82（ 图C），和单核的Fe 3+克4.3和9.7（ ?...

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EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR监控的辅助因子氧化还原滴定<em&gt;酿酒酵母</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

13.4K 次观看.  Delft University of Technology. The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.