وأجري التصوير من على رأسي لايكا SP5 المجهر متحد البؤر التي تقع داخل منشأة FILM من امبريال كوليدج في لندن، الذي يديره الدكتور مارتن Spitaler. وقدم صاحب العينة وخوذة بالتعاون مع قسم الهندسة الكيميائية من كلية امبريال لندن، بمشورة من صمويل جونز والدكتور سيمون شولتز. كان نيكولا Ruivo، فرانسيسكو دياز والموظفين CBS في كلية امبريال فعال لما قدموه من مساعدة والمشورة بشأن تربية الماوس. يتم تمويل كافة سكوت بواسطة HFSP وFILM، Olufolake Akinduro بواسطة CRUK وكريستينا لو سيلسو بواسطة CRUK، KKLF، BBSRC وHFSP.

<ol>
	<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hematopoietic+Stem+Cell+Niche+at+a+Glance.">The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).</li><li>Wang, L. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Niches+in+the+Origination+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).</li><li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+the+Spleen+Colony-forming+Cell+and+the+Hematopoietic+Stem+Cell.">The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell.</a> Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).</li><li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+Between+Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Fibers.">Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers.</a> Development. 109 (4), 943-952 (1990).</li><li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-retaining+Cells+Reside+in+the+Bulge+Area+of+Pilosebaceous+Unit:+Implications+for+Follicular+Stem+Cells,+Hair+Cycle,+and+Skin+Carcinogenesis.">Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis.</a> Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).</li><li>Doetsch, F., Caill&#233;, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subventricular+Zone+Astrocytes+are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mammalian+Brain.">Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li><li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Calcium+Signalling+Using+Genetically+Targetable+Fluorescent+Indicators.">Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li><li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Cellular+Imaging+Pinpoints+the+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Early+Steps+of+Adult+Hematopoietic+Reconstitution.">In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Specialized+Bone+Marrow+Endothelial+Microdomains+for+Tumour+Engraftment.">In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li><li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+Tracking+of+Individual+Haematopoietic+Stem/Progenitor+Cells+in+their+Niche.">Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Functional+Haematopoietic+Stem+Cell+Niche+Using+Real-time+Imaging.">Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging.</a> Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).</li><li>K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Cellular+Dynamics+and+Endosteal+Location+of+Aged+Early+Hematopoietic+Progenitor+Cells+Revealed+by+Time-lapse+Intravital+Imaging+in+Long+Bones.">Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones.</a> Blood. 114 (2), 290-298 (2009).</li><li>Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Pattern+Coding+of+Sensory+Information+by+Climbing+Fibre-evoked+Calcium+Signals+in+Networks+of+Neighboring+Cerebellar+Purkinje+Cells.">Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells.</a> J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).</li><li>Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Imaging+of+Transplanted+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Mouse+Calvarium+Bone+Marrow.">In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow.</a> Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).</li><li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+(HSCs).">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e157 (2007).</li><li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Seeing+to+Believing:+Labelling+Strategies+for+in+vivo+Cell-tracking+Experiments.">From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).</li><li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relationship+Between+Bone,+Hemopoietic+Stem+Cells+and+Vasculature.">The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li><li>Nombela-Arrieta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+of+Haematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cell+Localization+and+Hypoxic+Status+in+the+Bone+Marrow+Microenvironment.">Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).</li></ol>

There is nothing to disclose.

ما تم انجازه؟ يستخدم بروتوكول التصوير متعدد الأبعاد الوقت الفاصل بين لمراقبة هجرة FACS تنقيتها، خارج الحي المسمى، HSPCs زرعها في الماوس قبة القحف نخاع العظام. وقد تحقق تحديد الخلايا المزروعة واحدة تم رصدها هذه على مدى فترات طويلة من الزمن (ساعة) مع دقة عالية. تم التقليل من التحف حركة التنفس الناجم وتم reimaged خلايا مرارا وتكرارا على مدى فترة زمنية بالطبع لفترة طويلة. ما هي التوجهات المستقبلية؟ تطوير تقنية يمكن إحراز تقدم نحو التجارب الانتعاش للسماح للتصوير في أيام متعددة، على مدار أسبوع أو أكثر واستخدام التخدير الغاز مثل الأيزوفلورين لاختصار وتبسيط عملية الانتعاش للماوس (ملاحظة: التجارب الانتعاش تتطلب بدقة شروط الجراحة المعقمة وإدارة المسكنات المناسبة). ديفelopment من أكبر لوحة الألوان من الأصباغ في الجسم الحي وكذلك وضع العلامات الوراثية كفاءة الخلايا المكونة للدم أيضا سيسهل التجارب متعددة العلامات، وتوفير مزيد من التبصر في التفاعلات خلية خلية داخل نخاع العظام والسماح لتجارب أكثر تعقيدا في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، فإن وضع العلامات في وقت واحد من عدة هياكل نخاع العظام ومكونات سدى توفر صورة أكثر اكتمالا للأحداث التي تجري في محاريب HSPC. استقرار الصورة من الأفلام مرور الزمن يمكن تحسين preacquisition عن طريق تثبيت المجهر مزيد فضلا عن التقليل من التدرجات درجة الحرارة في العينة وpostacquisition باستخدام خوارزميات تسجيل الصورة. القيود: تقنية الموضحة تقدم بعض القيود. بقاء الفئران التالية إدارة التخدير عن طريق الحقن لا يمكن التنبؤ بها وأنه من السهل جدا لمضاعفات خبرة اعتمادا على استجابة الفرد للمخدر. عموما، وتعد جلسة التصوير، وصعوبة هو الماوس للتعافي من التخدير ولذلك فمن المهم أن تخطط بعناية ما إذا كان الماوس لاستردادها، مما يحد بشكل مثالي مدة انقضاء وقت التصوير. استخدام التخدير عن طريق الحقن يحد من الوقت كل دورة التصوير يمكن أن تستمر ل. في حين أنه من الممكن إطالة التخدير بواسطة readministering جرعة صغيرة من المخدر، فمن الصعب إجراء هذا بدقة وجرعة زائدة الماوس هو واحد من الأسباب الأكثر شيوعا من السابق لأوانه إنهاء التصوير في الجسم الحي. التخدير الغاز هو أقل سمية ويسمح لجلسة التصوير تعد الأولية، ولكن الانتعاش السريع من الفأرة بعد&gt; 2 ساعة إدارة طويلة من الأيزوفلورين نادرا ما تكون ناجحة. تقييد آخر للتقنية هو القرار محدود من الصور التي يمكن الحصول عليها خلال متعددة نقطة التصوير مرور الزمن، بسبب ضرورة الحصول على الصور بسرعة. هذا، إلى جانب الانحراف البؤري أو الحقل يقفز (القرصussed أعلاه)، يمكن أن تجعل من الصعب تتبع الخلايا. مقارنة مع الطرق البديلة: وعادة ما وصفت HSPCs مع صبغ محبة للدهون فعلت، ولكن دير والجاذبة الأصباغ هي البدائل تعادل والأصباغ خلية أخرى يمكن استخدامها طالما مشرق بما فيه الكفاية، كما استعرضت في [16]. على الرغم من خارج الحي وسم الخلايا مع DID وقد تبين أن لا يؤثر على وظيفة على المدى الطويل HSCs، فمن لديه الحد الذي لم (أو أي صبغة كيميائية أخرى) والمخفف على انقسام الخلايا. منذ HSCs تتكاثر خلال الأيام الأولى بعد زرع، إشارة إلى نسبة الضوضاء لهذه الخلايا تتدهور بسرعة. وضع العلامات الذاتية للخلايا عن طريق التلاعب الجيني والتعبير عن البروتينات الفلورية هو طريقة بديلة قابلة للحياة، طالما يتم التعبير عن البروتينات الفلورية عند مستويات مرتفعة بما فيه الكفاية لتوليد إشارة اكتشافها من خلال عظم الجمجمة. هناك عدد من ميتاليك بديلiques متوفرة لتنفيذ تصوير HSPCs داخل الفضاء نخاع العظم، ولكل منها فوائدها الخاصة والقيود. إدخال أجهزة التصوير القائم على الألياف البصرية يسمح للتصوير من نخاع العظم في إعادة تشكيل العظام الطويلة [8]، في حين أن التصوير متحد البؤر بعد التعرض الجراحية من الساق وترقق العظام مع المينا الحفر الجراحية [12] ينتج صورا تفصيلية من المقيمين في HSPCs المناطق الطرفية من العظام الطويلة. ولكن هذه الأساليب هي أكثر الغازية بكثير من وصفها هنا، وبالتالي لا تسمح لتكرار جلسات التصوير مع التركيز على المنطقة نفسها نخاع العظم داخل نفس الماوس. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن هذه التقنيات قد تؤثر على خلايا احظ نظرا للاستجابة حتمية لأضرار واسعة النطاق في الأنسجة المحيطة بها. تم تصوير HSPCs لفترات قصيرة من الزمن من خلال coverslips وضعت على رفعه، كسور عظام الفخذ [11]، ولكن تأثير هذا المستحضر قاسية من النسيج على HSPCs ليس جزءا لا يتجزأ منوقد استخدم r و تقنية فريدة للحصول على نقطة واحدة الملاحظات الوقت. تم مقطوع العظام الثابتة إلى أقسام التسلسلية، الملون، والصور التي تم الحصول عليها بناؤها إلى نموذج 3D، وتوفير قرار 3D ممتازة، وخصوصا عندما تستخدم يلقي الأوعية الدموية [17]، واستخدمت مؤخرا الليزر الضوئي الخلوي (LaSC) للحصول على الكمية تدابير حول HSPCs في الموقع، أبرز بواسطة المناعية [18] ولكن غير قادر على تقديم أي معلومات الزمانية حول سلوك الخلايا. التقنيات الموضحة في هذه التقنية الجديدة توفر مزيجا من قرار جيد في 3D، وأخذ العينات الزمنية كافية لرصد الخلايا في 4D وهي نسبيا غير الغازية، وبالتالي تقديم نهج المثالي لتحقيق رصد طويل الأجل من HSPCs التفاعل مع نخاع العظام المكروية.

على الرغم من محاريب الخلايا الجذعية بعد أن تم الاعتراف منذ عقود 3 وتتميز في العديد من الأنسجة بشكل جيد مثل البصلة الشمية، ألياف العضلات، وبصيلات الشعر أو انتفاخ CNS منطقة subventricular 4-7، والتفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية (HSCs) ونخاع العظام المكروية ( BM) لا تزال غير مفهومة نظرا لصعوبة مراقبة مباشرة الخلايا واحد من خلال العظام وكذلك طبيعة السوائل للغاية من الأنسجة نفسها. فقد تبين، من خلال عدد من الدراسات وظيفية على أساس ablating أو overexpressing جينات معينة في أي HSCs أو الخلايا اللحمية من المكروية نفسها، أن شبكة معقدة من أنواع مختلفة من الخلايا وإشارات التنظيمية هي المسؤولة عن تنظيم التوازن الدقيق بين هدوء والانتشار والتوسع وتمايز HSCs 1-2. الحديث المتبادل بين HSCs والمنافذ التي يمكن فهمها بعمق إلا من خلال الملاحظة المباشرة. هذا هو منظمة العمل ضد الجوعبفضل ievable في تطوير بروتوكولات التصوير المتقدمة، والجمع بين التكنولوجيا المتاحة ليس فقط من حيث المجهري، ولكن أيضا من الحلول حامل العينة والبرمجيات الاستحواذ. أظهر قرار وحيد الخلية الحية التصوير من الخلايا المزروعة الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs) في حجرة BM العظام calvaria الفأر الذي HSPCs engrafting توطين في القرب من السفن SDF-1 وVCAM-1-ايجابية 8-9 وأن الخلايا غير الناضجة أكثر وتوجد داخل 15-20 ميكرون من خلايا بانيات العظم GFP إيجابية (Col2.3-GFP خط الماوس المعدلة وراثيا، الذي المقيدة بناء العظم الكولاجين 1α المروج يقود GFP التعبير)، في حين ذريتهم هي أكثر البعيدة 10. تم الحصول على ملاحظات مماثلة من تشريح وكسور عظام الفخذ و11 من عظام ضعيفة tibeal 12. لا يزال التصوير من نخاع العظام قبة القحف نهج أقل الغازية لتحقيق رؤية مباشرة من داخل HSPCs عشرمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو المكروية الأصلية. مع أي التصوير العينة الحية هناك حاجة ملازمة للحفاظ على عينة كما لا يزال ممكن لتجنب أي لا لزوم لها القطع الأثرية بسبب حركة العينة. التنفس يسبب حركات متذبذبة من الرأس الماوس، والتي تحتاج إلى تجنبها عند التصوير نخاع العظام قبة القحف. أصحاب المجسم التقليدية، وتستخدم على سبيل المثال لتصوير الدماغ والكهربية، ليست مناسبة للتصوير القبة لأنها تعرقل العظام الأمامية. بدءا من حامل الماوس تستخدم لتقليل الشدة أثناء التصوير والكهربية الدراسات الحية 13، وقد وضعت حامل 2 عنصر، مع قطعة صغيرة ثابتة في الرأس من الماوس لخلق نافذة التصوير متصلة الذراع أكبر ضمان عقد ثابت مع لوحة قاعدة الثقيلة التي يؤمن بقوة في مرحلة المجهر. تأمين قطعة الرأس إلى الجمجمة من الفأرة يتيح حرية التنفس في حين لا يزال شل حركة الرأس في مكان والقضاء على نحو كاف مovements بسبب التنفس. آلية &quot;القفل والمفتاح&quot; الذي يربط الرأس قطعة للجسم حامل تسمح حجم النافذة ليكون الحد الأدنى فضلا عن زيادة دقة تحديد المواقع، وبالتالي تبسيط عملية جراحية، ونوبة من لوحة قاعدة في مرحلة يسمح للمحاذاة دقيقة على المجهر. لمراقبة بدقة خلايا متحركة، تم تصميم متعدد نقطة بروتوكول الفاصل الزمني للسماح تتبع الخلايا مع مرور الوقت 5 دقائق الفاصلة بين النقاط الزمنية. يتم حقن HSCs هنا، هل وصفت في col2.3GFP osteoblasitc الفئران مراسل 10،14 وبعد تصوير حوالي 20 ساعة. صاحب الماوس التي تم تصميمها ويتم وصف إعدادات التصوير المطلوبة لأداء سريع متعدد نقطة الوقت الفاصل بين التصوير من نفس المناطق على مدى ساعة متعددة بالتفصيل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ketamine(Narketan 100mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Vetoquinol</td>
			<td style="width:119px;">407575 0107 C</td>
			<td style="width:167px;">Other anesthetics may be used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Medetomidine(Domitor 1mg/ml)</td>
			<td style="width:71px;">Elanco</td>
			<td style="width:119px;">134800-2</td>
			<td style="width:167px;">Other analgesics may b used in place of this.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Vibrant DiD cell labeling solution</td>
			<td style="width:71px;">Roche Products Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">V22887</td>
			<td style="width:167px;">Other colors are available and may be used if required.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lacrilube ophtalmic ointment</td>
			<td style="width:71px;">Allergan</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:167px;">avaliable by prescription by the local vet</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Kemdent &#34;Diamond Carve&#34; glass ionomer cement</td>
			<td style="width:71px;">Associated Dental Products Ltd. via Kemdent</td>
			<td>SUN527</td>
			<td style="width:167px;">We use shade A3, but any shade of cement can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sterile water</td>
			<td style="width:71px;">multiple equivalent</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Insulin syringes</td>
			<td style="width:71px;">Terumo Medical Corporation</td>
			<td style="width:119px;">SS10M3109</td>
			<td style="width:167px;">1mL, 31G</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse restrainer</td>
			<td style="width:71px;">Harvard Apparatus</td>
			<td align="right" style="width:119px;">340031</td>
			<td style="width:167px;">Cone type (small)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Autoclaved forceps and scissors</td>
			<td style="width:71px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGT577 
			AGT5034</td>
			<td style="width:167px;">Iris scissors - 90mm; Dumont HP tweezers (0.06mm tip)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Weigh boat and cement stirrer</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td>611-1996/231-0370</td>
			<td style="width:167px;">5mL weigh-boat (black)/ Wooden tongue depressor</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Leica SP5 upright confocal microscope with motorized stage and two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Not available</td>
			<td style="width:167px;">Call for quote</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">25x water dipping objective lens (N.A. = 0.95)</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506323</td>
			<td style="width:167px;">HCX IRAPO L lens</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Custom designed mouse holder</td>
			<td style="width:71px;">Imperial College Engineering Workshop</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">See Figure 1 for details</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Heating pad with rectal thermometer probe</td>
			<td style="width:71px;">BASi Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td>
			<td style="width:167px;">Heat mat/ Control box/ Thermometer probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow

من خلال التوازن الدقيق بين هدوء وانتشار، وتجديد الذات وإنتاج ذرية متباينة، والخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) الحفاظ على دوران الأنساب جميع خلايا الدم الناضجة. تنسيق الإشارات المعقدة التي تفضي إلى مصائر شهادة الثانوية العامة المحددة يعتمد على التفاعل بين HSCs ومعقدة المكروية نخاع العظام، التي لا تزال غير مفهومة [1-2]. ونحن تصف كيف من خلال الجمع بين حامل العينة وضعت حديثا لتحديد المواقع الحيوانات مستقرة مع متعددة الخطوات متحد البؤر والفوتون اثنين في تقنيات التصوير الجسم الحي، فمن الممكن الحصول على مداخن 3D عالية الدقة تحتوي على HSPCs والمنافذ المحيطة بها ورصد لهم على مر الزمن من خلال متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير. تصوير عالية الوضوح يتيح الكشف عن فيفو السابقين الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف المسمى (HSPCs) المقيمات داخل نخاع العظام. وعلاوة على ذلك، متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير 3D، سbtained مع إعدادات اقتناء أسرع، ويوفر معلومات دقيقة عن حركة HSPC والتفاعلات المتبادلة بين HSPCs وخلايا سدى. ويظهر من تتبع HSPCs فيما يتعلق GFP الخلايا بانية العظم إيجابي كتطبيق المثالي لهذه الطريقة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتتبع أي المسمى بشكل مناسب للدم أو انسجة الخلايا المصالح داخل الماوس القبة مساحة النخاع العظمي.

العرف، عالية الدقة حامل الماوس بما في ذلك نافذة التصوير القبة يسمح التصوير لفترة طويلة من FACS تنقيته، HSPCs المسمى حقن الفئران المتلقي المشع القاتلة (الشكل 1A). عادة، بعد حقن من بين 15-20000 الخلايا المسمى، 8 إلى 15 خلايا وعادة ما تكون معترف بها داخل منطقة التصوير نخاع العظام من الجمجمة في اليوم التالي. هنا هو مبين كيفية الحصول على واحدة مداخن 3D قرار خلية من HSPC المناطق التي تحتوي على نخاع العظم من حوالي 90-120 ميكرون سمك، (الشكل 1B)، تليها 4D الوقت الفاصل بين الأفلام التي تم تحديدها من HSPCs (الشكل 1C والفيلم). ويتم الحصول على النتائج المثلى إذا لم يتم إعدادها على النحو الأمثل الاسمنت الأسنان، على سبيل المثال الماء قد تسرب من المناطق غير مختومة، وعلى الرغم من أنه يمكن تصدرت ارتفاعا من الجزء العلوي من حامل، أي الفترة الزمنية التي لا تراجع عدسة في المياه يؤدي إلى و السوداء<html> rames. بعض الانجراف في الصور أمر لا مفر منه بسبب التمدد الحراري للمواد من صاحب الماوس، ومع ذلك فإنه يمكن بفعل التصاق الاسمنت دون المستوى الأمثل، مما أدى إلى انفصال التدريجي للماوس، واضطرابات في التصوير اقامة، مما أدى إلى قفزات مفاجئة من التركيز خلال الوقت الفاصل بين التصوير. ويمكن أيضا الانجراف خلال متعددة نقطة الوقت الفاصل بين التصوير يكون سببها عدم دقة في الحركات مرحلة إعادة النظر في المواقف عند تصويرها سابقا. يمكن تصحيح انحراف وتلعثم التحف في أفلام الوقت الفاصل عن طريق استخدام الخوارزميات تسجيل الصورة. الجدول 1. الإثارة وضبط الانبعاثات. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td style="width:204px;"> قناة اللون </td><td style="width:213px;"> الإثارة </td><td style="width:208px;"> الانبعاثات </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px؛ &quot;&gt; 488 نانومتر </td><td style="width:208px;"> 500-530 نانومتر </td></tr><tr><td style="width:204px;"> تألق ذاتي </td><td style="width:213px;"> 543 نانومتر </td><td style="width:208px;"> 560-610 نانومتر </td></tr><tr><td style="width:204px;"> لم </td><td style="width:213px;"> 633 نانومتر </td><td style="width:208px;"> 640-700 نانومتر </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 نانومتر (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 نانومتر </td></tr></tbody></table><img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> الرقم 1. في الجسم الحي 4D التصوير من HSPCs في الماوس القبة. خلايا أمثلة من النتائج التي تم الحصول عليها (B) شرائح 2D من كومة 3D (عمق إجمالية تبلغ 114 ​​ميكرون)، التي تحتوي على إشارة من العظام الكولاجين (أبيض)، هل المسمى (الحمراء) - (A) الخطوط العريضة للتجربة (C B). ، سل autofluorescentليرة سورية (الأصفر) وخلايا عظمية (الخضراء). أشرطة النطاق: 100 ميكرون شرائح (C) 2D من 4D فيلم الوقت الفاصل يظهر لم HSC المسمى (الحمراء) المهاجرة في القرب من خلايا عظمية (الخضراء). خط منقط يسلط الضوء على النزوح من الخلية. أشرطة النطاق: 50 ميكرومتر (B) و 100 ميكرون (C). ملاحظة: الفيلم تم الحصول عليها من اكتساب الوقت الفاصل في (C) ستعرض خلال المقالة الفيديو <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow at JoVE.com

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

هناك سوء فهم لطبيعة التفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية والسلف (HSPCs) ومحاريب نخاع العظام. التعديلات الأجهزة المخصصة وبروتوكول اكتساب متعددة الخطوات تسمح باستخدام اثنين من الفوتون والفحص المجهري متحد البؤر لصورة فيفو السابقين HSPCs المسمى المخزن داخل المناطق نخاع العظام، وتتبع التفاعلات والحركة.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

13.7K Views.  Imperial College London.  هناك سوء فهم لطبيعة التفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية والسلف (HSPCs) ومحاريب نخاع العظام. التعديلات الأجهزة المخصصة وبروتوكول اكتساب متعددة الخطوات تسمح باستخدام اثنين من الفوتون والفحص المجهري متحد البؤر لصورة فيفو السابقين ...

Video: In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

ناقضة العظم اشتقاق من الفأر نخاع العظم

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Assessment of Cellular Bioenergetics in Mouse Hematopoietic Stem and Primitive Progenitor Cells using the Extracellular Flux Analyzer

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their energetic needs. However, under stress conditions such as infection or blood loss, HSCs become proliferative and rapidly produce downstream progenitor cells, which in turn further differentiate, ultimately producing mature blood cells. During this transition and differentiation process, HSCs exit from quiescence and rapidly undergo a metabolic switch from glycolysis to oxidative phosphorylation (OxPHOS). Various stress conditions, such as aging, cancer, diabetes, and obesity, can negatively impact mitochondrial function and thus can alter the metabolic reprogramming and differentiation of HSCs and progenitors during hematopoiesis. Valuable insights into glycolytic and mitochondrial functions of HSCs and progenitors under normal and stress conditions can be gained through the assessment of their extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which are indicators of cellular glycolysis and mitochondrial respiration, respectively. 
Here, a detailed protocol is provided to measure ECAR and OCR in mouse bone marrow-derived lineage-negative cell populations, which include both hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs), using the extracellular flux analyzer. This protocol describes approaches to isolate lineage-negative cells from mouse bone marrow, explains optimization of cell seeding density and concentrations of 2-deoxy-D-glucose (2-DG, a glucose analog that inhibits glycolysis) and various OxPHOS-targeted drugs (oligomycin, FCCP, rotenone, and antimycin A) used in these assays, and describes drug treatment strategies. Key parameters of glycolytic flux, such as glycolysis, glycolytic capacity, and glycolytic reserve, and OxPHOS parameters, such as basal respiration, maximal respiration, proton leak, ATP production, spare respiratory capacity, and coupling efficiency, can be measured in these assays. This protocol allows ECAR and OCR measurements on non-adherent HSPCs and can be generalized to optimize analysis conditions for any type of suspension cells.

The method presented here summarizes optimized protocols for assessing cellular bioenergetics in non-adherent mouse hematopoietic stem and primitive progenitor cells (HSPCs) using the extracellular flux analyzer to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of HSPCs in real time.

تقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم للفأر والخلايا السلفية البدائية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية

Under steady state, hematopoietic stem cells (HSCs) remain largely quiescent and are believed to be predominantly reliant on glycolysis to meet their ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene manipulation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro makes HSPCs an ideal target cell for gene therapy. However, HSPCs moderately lose their engraftment and multilineage repopulation potential in ex vivo culture. In the present study, ideal culture conditions are described that improves HSPC engraftment and generate an increased number of gene-modified cells in vivo. The current report displays optimized in vitro culture conditions, including the type of culture media, unique small molecule cocktail supplementation, cytokine concentration, cell culture plates, and culture density. In addition to that, an optimized HSPC gene-editing procedure, along with the validation of the gene-editing events, are provided. For in vivo validation, the gene-edited HSPCs infusion and post-engraftment analysis in mouse recipients are displayed. The results demonstrated that the culture system increased the frequency of functional HSCs in vitro, resulting in robust engraftment of gene-edited cells in vivo.

The present protocol describes an optimized hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) culture procedure for the robust engraftment of gene-edited cells in vivo.