فإن الكتاب أود أن نعترف برنامج مبادرة التخصصات الابتكار، جامعة إلينوي، منح 12035. وقد تم تمويل SK في UIUC من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) منحة 0965918 IGERT: تدريب الجيل القادم من الباحثين في الخلوية والجزيئية وميكانيكا BioNanotechnology.

افتعال وfunctionalizing المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من التصلب مع المجهرية الفلورسنت المدمجة بالقرب من سطح خلية ثقافة مختلفة. 1. Functionalizing غطاء زجاج الأعلى الزلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة زلات غطاء زجاجي (# 1.0، بقطر 12 ملم.) بالصابون والماء، تليها الإيثانول لإزالة الغبار دخيلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان غطاء زجاجي ينزلق على سطح المبشور (أي حامل ماصة تلميح) بحيث أنها لا لمس لتسهيل سهولة التفاعل مع لل coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف كامل سطح غطاء ينزلق مع بولي-D-يسين (0.1 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذا الوقت، إجراء 1: 10،000 التخفيف من الحل الغروانية من 0.1 ميكرون القطر، والمجهرية الفلورسنت الحمراء مع منزوع الأيونات (DI) المياه للحصول على كثافة الجسيمات من حوالي 1 المكروية في 20 ميكرون 2 على سطح هلام. انظر الشكل رقم (2) لنتائج مختلف التخفيفات. هذا dilutioيمكن تعديل ن لتلبية الحاجة من تجارب محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع محلول مخفف في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، استخدام ملاقط لرفع بعناية كل زلة غطاء وضربة الجافة مع الهواء. العودة زلات غطاء الجافة على سطح المبشور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الغروي المخفف من حمام بالموجات فوق الصوتية وماصة 150 ميكرولتر على كل زلة غطاء. يترك لمدة 10 دقيقة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملاقط لرفع بعناية كل زلة غطاء وضربة الجافة مع الهواء. العودة غطاء الجاف ينزلق إلى السطح المبشور وتخزينها في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 2. إعداد السلطة الفلسطينية جل مباشرة على الزجاج أطباق بتري القاع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقد سخن الى 100 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع من العدد المرغوب فيه من أسفل الزجاج أطباق بتري (35 ملم 14 ملم مع طبق الصغيرة جيدا، # 1.0) على سطح مستو في غطاء الدخان الكيميائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية جزء من الزجاج كل طبق بتري الصغيرة بشكل جيد مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysليان (3 APTES) لمدة 7 دقائق لتنشيط الكيميائي. أخذ الحيطة والحذر لتجنب نازف غير مقصود من APTES-3 إلى السطح من البلاستيك في طبق بيتري لتجنب تدهور البوليسترين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 دقائق، وملء طبق بيتري مع الماء DI والتخلص منها في حاوية النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.4 3X لكل طبق، ثم يهز طبق بيتري لإزالة الماء الزائد. وضع أطباق بتري على صفيحة ساخنة حتى جزء الزجاج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أطباق بتري من طبق ساخن والعودة إلى سطح مستو في غطاء الدخان الكيميائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غطاء الدخان الكيميائية، وجعل حل من 0.5٪ غلوتارالدهيد وتغطية جزء من الزجاج كل طبق بتري جيدا مع الحل لمدة 30 دقيقة. أخذ الحيطة والحذر لتجنب نازف غير مقصود من غلوتارالدهيد إلى السطح من البلاستيك في طبق بيتري لتجنب تدهور البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، وملء طبق بيتري مع الماء DI والتخلص منها في حاوية النفايات لشطف وإزالة glutaraldehyde. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.4 3X لكل طبق، ثم يهز طبق بيتري لإزالة الماء الزائد. وضع أطباق بتري على صفيحة ساخنة حتى جزء الزجاج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل خلط مكونات الحل هلام السلطة الفلسطينية، نقل الشرائح الزجاجية بين functionalized في غطاء الدخان الكيميائية بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة، مما يسمح للالحصر سريعة من هلام مع أسفل الزجاج أطباق بتري بعد خلط الحل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 15 مل أنبوب الطرد المركزي، خلط 40٪ bisacrylamide، 2٪ الأكريلاميد، وحمض الاكريليك على التوالي فورية في تركيزات المدرجة في الجدول 1 (مقتبس من البروتوكول نشرت 10) لتحقيق مرونة مصفوفة المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ملي HEPES، بيرسلفات الأمونيوم 10٪، وTEMED بكميات المدرجة في الجدول 1 الموافق المطلوب مرونة مصفوفة لاستكمال حل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة على الفور 15 ميكرولتر من الحل الهلام على مركز للجزء الزجاجمن أطباق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار فورا حتى بين functionalized الزجاج غطاء زلة مع ملاقط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه زلة غطاء زجاجي على مثل حبات الفلورسنت التي هي على اتصال صنع جنب مع حل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع انزلاق الغطاء بلطف على أعلى من هلام السلطة الفلسطينية الآن السائلة مثل أن الجانب بين functionalized في اتصال مع هلام (الشكل 1C). ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ينصح الشخص الثاني لدور مضيفا انزلاق الغطاء من أجل تجنب إمكانية البلمرة الجزئية pipetting لحين حل السائل هلام السلطة الفلسطينية على أطباق بتري متعددة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه كل أطباق بتري على للمساعدة في تجنب آثار الجاذبية على جزيئات الفلورسنت البلمرة إلى مستويات أدنى من هلام السلطة الفلسطينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لمدة 35 دقيقة على الأقل، أو حتى بلمرة المحلول من هلام السلطة الفلسطينية بشكل واضح في أنبوب الطرد المركزي لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه أطباق بتري إلى أكثر من وملئها PBS للمساعدة في إزالة انزلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل بعناية اتصال مع جزء من الزجاج طبق بيتري والخطوط العريضة للانزلاق الغطاء، وذلك باستخدام ملاقط لتتخلص من محيط من انزلاق الغطاء. أداء عدة دورات حتى يتم فكها انزلاق الغطاء. إزالة الغطاء زلة والتصرف في حاوية النفايات الحادة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة الغطاء عن زلات، سيكون قد نقل حبات الفلورسنت إلى هلام (الشكل 1D). تغطية المواد الهلامية السلطة الفلسطينية تماما مع برنامج تلفزيوني، ضع غطاء طبق بتري على كل طبق، وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li></ol> 3. Functionalizing هلام السلطة الفلسطينية مع فيبرونكتين] <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول خلط التالية كما هو موضح في بروتوكول إنشاء 11: نقع حل (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5٪ (V / V) الجلسرين) و2X عازلة الاقتران (0.2 M 2- (N -morpholino) حمض ethanesulfonic (MES)، 10 ٪ (ت / ت) الجلسرين، ودرجة الحموضة 4.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة كافة PBS من الأطباق الزجاجية القاع التي تحتوي على المواد الهلامية السلطة الفلسطينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصةنقع الشركة المصرية للاتصالات على حل كل هلام مثل أن الجل هي غارقة تماما. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دافئ 1 إيثيل-3- [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) وN -hydroxysulfosuccinimide (NHS) إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 10X حلول EDC (150 ملم، 19 ملغ / مل في الماء DI) وNHS (250 مم، 29 ملغ / مل في الماء DI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 1 جزء 10X EDC، 1 جزء 10X NHS، 3 أجزاء من الماء DI، و 5 أجزاء 2X عازلة الاقتران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة الحل نقع. تأكد من إزالة جميع السوائل من سطح هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي من الحل NHS / EDC لتغطية سطح هلام وملء البئر من الزجاج السفلي من طبق بتري (150-250 ميكرولتر). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فبرونيكتين ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، ومزيج الماء المعقم DI إلى إنشاء 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة فراغ في غطاء البيولوجي لإزالة SOLU NHS / EDCنشوئها. تأكد من إزالة جميع السوائل من سطح هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من الحل فبرونيكتين على كل هلام. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 35 دقيقة للسماح لمرفق من فبرونيكتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 35 دقيقة، إضافة PBS إلى كل طبق بتري وتخزينها في 4 درجة مئوية لتصل إلى 2 أسابيع. </li></ol> 4. تجارب قوة الجر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلية الإعلام الدافئة، PBS، والتربسين إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المواد الهلامية 5X مع برنامج تلفزيوني العقيمة، الشفط في برنامج تلفزيوني بين يشطف، وتترك مغطاة في غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل التربسين لكل 25 سم 2 إلى الخلايا التي تحتوي على قارورة. بعد أن يتم رفع الخلايا من القارورة، يخفف من التربسين مع وسائل الإعلام خلية وعدد الخلايا. بناء على مساحة هلام، وتحديد عدد الخلايا المطلوبة لكل هلام النهائية لكثافة البذر خلية من 3،000 خلية / سم 2. تمييع أو التركيز تعليق مثل أن 150 ميكرولتر من الخليط خلية الإعلام ويتضمن هذا العدد من الخلايا. قسامة 150 ميكرولتر من الخلايا suspensأيون إلى كل هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق بتري تحتوي على خلايا في حاضنة لمدة 30 دقيقة. ثم، وإزالة بعناية أطباق بتري وملء ما تبقى من طبق بيتري مع وسائل الإعلام (حوالي 2 مل) بحيث سطح الطبق هي غارقة تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق بتري مرة أخرى في الحاضنة حتى الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجهر ونظام الحصول على البيانات للتصوير: إدراج الهدف الغمر 40X المياه، إدراج التباين التدخل التفاضلية (DIC) المنشور، اختر mCherry أو مرشح الفلورسنت يعادل، وتشغيل غرفة البيئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما أعدت للتصوير، وإزالة واحدة طبق بيتري من الحاضنة ووضعه برفق على المسرح المجهر. إزالة غطاء طبق بتري لمدينة دبي للإنترنت التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خلية واحدة والتقاط صورة ثابتة واحدة من الخلية في مدينة دبي للإنترنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون تحريك المسرح المجهر، تشغيل وضع التصوير لمضان. التركيز على المجهرية الفلورسنت وتفصيلأورد صورة من المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وسائل الإعلام خلية من طبق بيتري مع ماصة وإضافة 0.05٪ التربسين-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة وفصل المجهرية تحت الخلية بعد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الجسيمات الصور velocimetry (التعريف الشخصية) تحليل في ImageJ 12 لحساب مجال النزوح بسبب القوات الخلوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelham, R. J., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility.">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li><li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts.">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li><li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate.">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).</li><li>Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Complaint+Matrices+for+Quantifying+Cellular+Contraction.">Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction.</a> JoVE. , (2010).</li><li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyacrylamide+Hydrogels+for+Cell+Mechanics:+Steps+Toward+Optimization+and+Alternative+Uses.">Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses.</a> Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li><li>Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+throughput+traction+microscopy+reveals+pivotal+role+for+matrix+stiffness+in+fibroblast+contractility+and+TGF-&#946;+responsiveness.">Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-&#946; responsiveness.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).</li><li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+deeply+cells+feel:+methods+for+thin+gels.">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).</li><li>Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micropatterning+and+image+processing+approach+to+simplify+measurement+of+cellular+traction+forces.">A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces.</a> Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).</li><li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+flexible,+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells.">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).</li><li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Hydrogel+Substrates+with+Tunable+Mechanical+Properties.">Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties.</a> Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).</li><li>Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+and+Patterning+Polyacrylamide+Substrates+Functionalized+with+N-Hydroxysuccinimide.">Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide.</a> Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).</li><li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Th&#233;ry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell&#8211;cell+junction+positioning.">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell&#8211;cell junction positioning.</a> PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li><li>Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular-matrix+tethering+regulates+stem-cell+fate.">Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate.</a> Nature Materials. 11, 642-649 (2012).</li><li>Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+chemistry,+topography,+and+mechanics+at+the+cell-biomaterial+interface:+Issues+and+challenges+for+assessing+the+role+of+substrate+mechanics+on+cell+response.">Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response.</a> Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).</li><li>Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinkovic&#769;, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Multiwell+Platform+for+Studying+Stiffness-Dependent+Cell+Biology.">A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).</li><li>Butler, J. P., Tolic&#769;-N&#248;rrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+fields,+moments,+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings.">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).</li><li>Tolic&#769;-N&#248;rrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+traction+response+in+human+airway+smooth+muscle+cells.">Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).</li><li>Atanackovic, T., Guran, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

عند استخدام هذه التقنية، فمن الضروري أن الحل حبة وتضعف بشكل صحيح ويتم اختيار حبات بناء على القطر المطلوب، PA هلام الركيزة وصلابة، وحجم حجم الظواهر التي تم استكشافها في التجربة المطلوبة. وينبغي اتخاذ الحذر عند تمييع الحل حبة قبل fun...

وعادة يتم دراستها التفاعل الميكانيكي للخلية الحية مع البيئة المحلية في استخدام المواد الهلامية السلطة الفلسطينية. هذه تعتمد على ركائز بسيط، بروتوكول جيدا اتسم أنشأها ديمبو وانغ في عام 1997 1. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه ركائز هو أن صلابة بهم يمكن ضبطها عن طريق تعديل تركيزات مكونات محددة من الحل هلام. وهذا يوفر منصة مرغوبة لدراسة تفاعل الخلايا مع بيئات مختلفة من الجمود. عندما المواد الهلامية المغلفة السلطة الفلسطينية مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات، والخلايا التمسك بها، وتوليد القوة. نتيجة لقوة الخلية، وهلام يشوه كهيئة مرن. هذا التشوه يعتمد على مقدار القوة التي تطبقها الخلايا وخصائص المرونة من هلام. وقد استخدمت العديد من الدراسات والمواد الهلامية السلطة الفلسطينية للتحقيق في قوات الجر الخلوية. الاختلاف في واحدة من السلطة الفلسطينية هلام تلفيق، هي جزء لا يتجزأ المجهرية الفلورسنت (الخرز) رالاحجار الكريمه هلام لقياس قوات الجر خلية في المواد الهلامية من الجمود مختلفة 2. بناء على طلب قوة الخلية، وحبات تهجير من موقع الأولي في أعقاب هلام تشوه. يتم قياس مجال تشوه من التشريد حبة الفردية. ويستخدم هذا المجال تشوه مع نظرية المرونة وخصائص المرونة من هلام لحساب القوات الجر. توفر هذه القياسات فكرة عن كيفية الخلايا ميكانيكيا الشعور والتفاعل مع المكروية المحلية 3. في العديد من بروتوكولات السلطة الفلسطينية هلام تلفيق المستخدمة على نطاق واسع، واختلطت حبات في جميع أنحاء هلام السلطة الفلسطينية في السائل، وحالته unpolymerized. جل بلمرة تماما PA يحتوي على حبات الفلورسنت طوال حجمه. عند حساب قوى الجر الخلية، ويتم مراقبة الخرز الأكثر بالقرب من سطح هلام (واجهة الخلية الركيزة). ويفترض أن النزوح من هذه الخرز تحدث على سطح خلية للثقافة البساطة في calculatio القوةن. وتجاهل الموقع الفعلي من الخرز داخل عمق هلام. ومع ذلك، في وسيلة مرنة (مثل هلام PA)، حبة أقرب إلى نقطة تطبيق القوة ستتحرك أكثر من حبة وهذا هو أبعد من هذه النقطة. وبالتالي، علاج تشريد نقطة (في الموقع حبة) البعيدة من السطح كما انه في نتائج السطحية في التقليل من tractions الخلوية. درجة الخطأ تعتمد على المسافة من حبة من السطح. لا يمكن تقدير الخطأ من دون معرفة مكان وجود حبة. لقد تم تناول الحاجة إلى طريقة بسيطة لحصر الخرز جدا بالقرب من سطح خلية ثقافة ببضعة التقنيات. طريقة واحدة هي زيادة كثافة الخرز طوال هلام كله مثل أن هناك عددا كافيا من الخرز في الطائرة التنسيق العليا لقياس الحركة قريبة جدا من السطح. أسلوب آخر ينطوي على بناء غرفة التصوير مبائر للتصوير الخلايا الحية بحيث الضوء منفقط حبات في الطائرة العلوي الأكثر الوصل يتم جمع 4. يتضمن طريقة مختلفة تتراكب طبقة رقيقة جدا من هلام السلطة الفلسطينية تحتوي على الخرز على رأس هلام بلمرة بالفعل دون الخرز 5. والعيب كل من هذه التقنيات هو أن الموقع الدقيق من الخرز داخل هلام غير معروف. هذا الخطأ يدخل في حساب مجال النزوح من الخرز، وبالتالي حساب القوات الخلية. أسلوب آخر ينطوي على الاقتران من الخرز إلى السطح العلوي من هلام السلطة الفلسطينية بلمرة بالفعل باستخدام سلفو-SANPAH 6. هذا الأسلوب يضمن الخرز هي في الواقع إلا على الجزء العلوي من هلام السلطة الفلسطينية، ولكن إلى أي مدى هي جزء لا يتجزأ في عمق هلام غير معروف. هذا يحتمل أن إنشاء الطبوغرافيا المحلية للخلايا، والتي يمكن أن تغير سلوك الخلية، كما اقترح العمل قبل أن الخلايا يمكن الشعور بالقوة عدة ميكرون بعيدا 7. مؤخرا، وهي تقنية لالزخرفة المواد الهلامية السلطة الفلسطينية مع 1 ميكرون القطر وتأسست luorescent فبرونيكتين نقطة علامات في مجموعة وقننت 8. في هذه الحالة، وعمق من علامات الفلورسنت هو معروف، وأساسا الصفر، كما تتم طباعة نمط فبرونيكتين غير مباشرة على سطح هلام. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لا توفر بيئة مستمرة على الخلايا التي يمكن أن نعلق، والبروتين ECM يقتصر على 1 ميكرومتر النقاط القطر. لم يتم بعد تأسيس طريقة لدمج الخرز بالكامل تعقب المواد الهلامية داخل السلطة الفلسطينية وقصر بعضها إلى موقع معروف جدا بالقرب من السطح. هنا، ونحن نطور تقنية لتقييد ميكرون الفرعي إلى قطرها ميكرون الخرز الفلورسنت إلى المستوى البؤري جدا بالقرب من سطح الثقافة خلية داخل هلام السلطة الفلسطينية. عادة يتم الشفاء جل بواسطة يقحم unpolymerized حل هلام السائل بين لوحين من الزجاج. واحدة من لوحات وبين functionalized بحيث هلام تتمسك بشدة لذلك. والآخر هو unfunctionalized وتتم إزالة بعد علاج هلام. نقوم بتعديل هذا الزجاج قابل للإزالة سوrface بواسطة طلاء بطبقة من الخرز. على يقحم الجل السائل بين بين functionalized وحبة المغلفة سطح الزجاج، ونقل الخرز إلى هلام في حين أنه هو علاج. وهذا يحد من مسافة التكامل الخرز &quot;في هلام في 1.6 ميكرون من السطح. تستخدم الأطباق الزجاجية القاع بيتري على سطح ملتصقة الذي يتم علاجه هلام. لتشكيل السطح العلوي هلام شقة خلال البلمرة، يتم استخدام غطاء زجاجي دائري زلة لشطيرة هلام مع طبق بتري الزجاج السفلي. قبل تلفيق هلام، وهي مغلفة زجاج الغطاء العلوي زلة مع بولي-D-يسين (PDL)، مما أسفر عن تهمة سطح إيجابي. نفخ في PDL قبالة مع الهواء المضغوط، ويترسب حل من الخرز في الماء على زلات الغطاء. نحن نستخدم بلي الفلورسنت carboxylated، التي تحمل شحنة سالبة، والتفاعل مع سطح موجبة الشحنة التي أنشأتها العلاج مع PDL. بعد تهب الحل حبة قبالة ساترة مع الهواء المضغوط، وطبقة واحدة منحبات تبقى مقرونة كهربية لتغطية زلة الجاف. طلاء PDL لا يؤثر على الإلتصاق من الزجاج على سطح هلام، والشرائح الزجاجية غير تالفة وإزالتها من هلام PA سليمة تماما. مصنوعة من الزجاج أطباق بتري السفلي ملتصقة عن طريق العلاج مع 97٪ 3 أمينو بروبيل-trimethoxysliane و 0.5٪ غلوتارالدهيد. يتم إنشاء المواد الهلامية السلطة الفلسطينية من الجمود المطلوب عن طريق خلط تركيزات مناسبة من bisacrylamide والأكريلاميد عن طريق الإجراء القياسي 9. وpipetted قطرات من الحل الهلام على طبق بتري الزجاج السفلي. يتم استخدام زلة غطاء زجاجي يحتوي على حبات لشطيرة الجل مع طبق بيتري. عندما يتم الشفاء هلام، يتم إزالة الغطاء العلوي زلة تاركا جزءا لا يتجزأ من الخرز في هلام داخل السلطة الفلسطينية 1.6 ميكرون من السطح.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

ولطالما استخدمت المواد الهلامية السلطة الفلسطينية كمنصة لدراسة قوات الجر الخلية بسبب سهولة تصنيع والقدرة على ضبط خصائصها المرنة. عند الركيزة المغلفة مع بروتين المصفوفة خارج الخلية، وخلايا تلتزم جل وتنطبق القوات، مما تسبب في هلام لتشويه. تشوه يعتمد على الجر الخلية وخصائص المرونة من هلام. إذا كان من المعروف مجال تشوه السطح، سطح الجر يمكن حسابها باستخدام نظرية مرونة. يتم قياس هلام تشوه عادة عن طريق دمج الخرز علامة فلوري بشكل موحد في هلام. تحقيقات تهجير ويشوه هلام. يتم تعقب تحقيقات بالقرب من سطح هلام. تعتبر النزوح التي أبلغ عنها هذه التحقيقات والتشريد السطح. يتم تجاهل أعماقها من السطح. يقدم هذا الافتراض خطأ في التقييمات قوة الجر. لقياس الدقيق للقوات خلية، من المهم جدا للموقع من الخرز ليكون معروفا. طورناوهي تقنية تستخدم الكيمياء بسيط لحصر الخرز علامة فلوري، 0.1 و 1 ميكرون في القطر، والمواد الهلامية في السلطة الفلسطينية، ضمن 1.6 ميكرون من السطح. نحن معطف ساترة مع بولي-D-يسين (PDL) والخرز الفلورسنت. ثم محصورة بين السلطة الفلسطينية حل هلام ساترة وسطح ملتصقة. نقل حبات الفلورسنت إلى حل خلال هلام علاج. بعد البلمرة، PA هلام يحتوي على حبات الفلورسنت على مقربة الطائرة إلى سطح هلام.

وقد استخدم التصوير متحد البؤر لتحديد أن كانت حبات الواقع تحت سطح هلام وتحديد موقعها بالضبط داخل عمق هلام. وسمح الخرز الفلورسنت من طول موجة مختلفة عن تلك داخل هلام ليستقر على السطح، وحساب المسافة بين جزيئات الفلورسنت المدمجة وتلك التي على السطح باستخدام خوارزمية تحد?...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy at JoVE.com

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

التقنيات التقليدية لتصنيع بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي تحتوي على تحقيقات الفلورسنت تتضمن يقحم هلام بين سطح ملتصقة وشريحة زجاجية. هنا، وتبين لنا أن هذه الشريحة مع طلاء بولي-D-يسين (PDL) وتحقيقات الفلورسنت يموضع تحقيقات في حدود 1.6 ميكرون من سطح هلام.

طريقة مبتكرة لإضفاء الطابع المحلي على مراسل نيون الخرز بالقرب من سطح الثقافة الخليوي لقوة الجر المجهري

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  التقنيات التقليدية لتصنيع بولي أكريلاميد (PA) المواد الهلامية التي تحتوي على تحقيقات الفلورسنت تتضمن يقحم هلام بين سطح ملتصقة وشريحة زجاجية. هنا، وتبين لنا أن هذه الشريحة مع طلاء بولي-D-يسين (PDL) وتحقيقات الفلورسنت يموضع تحقيقات في حدود 1.6 مي?...

Video: A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

سطح القياس المحتمل للبكتيريا عن طريق كلفن التحقيق قوة المجهر

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

تصنيع وتنفيذ منصة المجهر قوه السحب المرجعية الحرة

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

الجر قوة المجهر لدراسة B تنشيط الخلايا الليمفاوية

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

تطبيق المجهر القوة الذرية للكشف عن هشاشة العظام في وقت مبكر

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...