저자는 학제 간 혁신 이니셔티브 프로그램, 일리노이 대학을 감사드립니다, 12035을 부여합니다. SK는 국립 과학 재단 (NSF) 부여에서 UIUC에 투자되었다 0,965,918 IGERT : 세포 및 분자 역학 및 BioNanotechnology에 연구원의 차세대를 훈련.

제조 및 세포 배양 표면 근처에 포함 된 형광 미소와 강성을 변화의 PA 젤 관능. 1 상단 커버 유리 전표를 기능화 <ol><li> 청소 유리 커버 슬립 (# 1.0, 12mm의 DIAM.) 비누와 물, 에탄올 다음은 외부의 먼지를 제거합니다. </li><li> 도시 유리 커버들은 커버 슬립의 용이성과의 상호 작용을 용이하게 닿지 않도록되도록 강판의 표면 (즉, 피펫 팁 홀더)에 실수. </li><li> 코트 커버의 표면 전체가 폴리-D-라이신 1 시간 (도 1a)에 대한 (0.1 ㎎ / ㎖)와 함께 미끄러. </li><li> 이 시간 동안, 일 수행 0.1 μm의 직경의 콜로이드 용액 만 희석 탈 (DI) 물에 적색 형광 마이크로 스피어는 겔 표면에 20 μm의 2 당 약 1 마이크로 스피어의 입자 밀도를 얻었다. 다양한 희석의 결과는 그림 2를 참조하십시오. 이 dilutioN은 특정 실험의 필요성을 충족시키기 위해 변경 될 수있다. </li><li> 30 분 동안 초음파 물을 욕조에 희석 된 용액을 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, 신중하게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 강판 표면에 건조 커버 전표를 돌려줍니다. </li><li> 각 커버 슬립 위에 초음파 목욕 및 피펫 150 μL의 희석 된 콜로이드 용액을 제거합니다. 10 분 (그림 1B)에 두십시오. </li><li> 주의 깊게 각 커버 슬립을 들어 올려 공기와 바람을 불어 건조 핀셋을 사용합니다. 사용할 준비가 될 때까지 건조 커버가 어둠 속에서 강판 표면과 가게에 미끄러 져 돌아갑니다. </li></ol> 직접 바닥이​​ 유리 페트리 접시에 PA 젤을 준비 2 <ol><li> 100 ° C로 예열 열판. </li><li> 유리 바닥 배양 접시의 원하는 수의 레이아웃 (14mm와 35mm 요리를 마이크로 웰, # 1.0) 화학 흄 후드의 평평한면에. </li><li> 97 % 3 - 아미노 프로필 trimethoxys 각 페트리 접시 마이크로 웰의 유리 부분을 덮리안 화학 활성화를위한 7 분 (3-APTES). 폴리스티렌의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 3-APTES 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오. </li><li> 7 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 작성하고 폐기물 용기에 폐기하십시오. </li><li> 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> 핫 플레이트에서 배양 접시를 제거하고 화학 흄 후드에서 평평한 표면으로 돌아갑니다. </li><li> 화학 퓸 후드에서, 0.5 % 글루 타르 알데히드 용액을 잘 30 분 동안 용액으로 각각 페트리 접시의 유리 부분을 커버. 플라스틱의 열화를 방지하는 페트리 접시에서 플라스틱의 표면에 글루 타르 알데히드의 부주의 떨어지는 않도록주의하여주십시오. </li><li> 30 분 후, DI 워터와 페트리 접시를 채우고 씻어 폐기물 용기에 폐기하고 glutarald를 제거ehyde. </li><li> 를 반복 한 다음 각 요리에 대한 단계 2.4 배, 그리고 여분의 물을 제거하기 위해 페트리 접시를 흔들. 유리 부분은 물기가 없어 질 때까지 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓습니다. </li><li> PA 겔 용액의 성분을 혼합하기 전에, 유리 바닥 겔의 짧은 협 허용들은 쉽게 접근 할 수 있도록 화학적 흄 후드로 기능화 된 유리 슬라이드를 이동 겔 용액을 혼합 한 후 배양 접시가. </li><li> 15 ㎖의 원심 관에, 표 1에 기재된 농도로 직접 연속적으로 40 % 비스 아크릴 아미드, 2 % 아크릴 아미드, 및 아크릴산을 혼합 행렬 원하는 탄성을 달성하기 위해 (출판 (10)로부터 적응 프로토콜). </li><li> 겔 용액을 완료하기 위해 필요한 매트릭스 탄성에 대응하는 표 1에 열거 개당 100 mM의 HEPES, 10 %의과 황산 암모늄,과 TEMED를 추가한다. </li><li> 즉시 유리 부의 중심에 겔 용액 15 μL 피펫배양 접시의. </li><li> 즉시 핀셋 기능화 된 유리 커버 슬립을 선택합니다. <ol><li> 형광 구슬이 젤 솔루션 측면 만드는 접촉이되도록 위에 유리 커버 슬립 플립. </li><li> 부드럽게 기능화 측 겔 (도 1C)와 접촉되도록 해주기 액체 PA 겔의 상단에 커버 슬립을 놓는다. 주 : 최상의 결과를 위해, 두 번째 사람은 다수의 배양 접시에 액체 PA 겔 용액을 피펫 팅하면서 부분적인 중합을 방지하기 위해 커버 슬립을 추가의 역할을 위해 권장된다. </li></ol></li><li> PA 젤 낮은 수준으로 중합 형광 나노 입자에 중력 효과를 방지 지원하기 위해 모든 페트리 접시를 뒤집습니다. </li><li> PA 젤의 원액이 눈에 띄게 그 원심 분리 관에서 중합했다 적어도 35 분 동안, 또는 때까지 기다립니다. </li><li> 다시 이상 배양 접시를 뒤집어 커버 슬립을 제거 지원하기 위해 PBS로 채운다. </li><li> 조심스럽게 커버 슬립의 둘레를 긁어 핀셋을 사용하여, 배양 접시의 유리 부와 커버 슬립의 개요와 접촉. 커버 슬립이 빠질 때까지 여러주기를 수행합니다. 커버 슬립을 제거하고 적절한 날카로운 물건 폐기 용기에 폐기하십시오. </li><li> 모든 커버 전표를 제거한 후, 형광 구슬은 겔 (그림 1D)에 전송 한 것입니다. 완전히 PBS와 PA 젤 커버 각 접시에 페트리 접시의 뚜껑을 배치하고 4 ° C에서 보관. </li></ol> 3 피브로넥틴과 PA 젤 기능화 <ol><li> 설립 프로토콜 11에 설명 된대로 다음과 같은 예 혼합 솔루션을 준비 : 솔루션을 적시 (137 mM의 NaCl을, 5 % (v / v)로 글리세롤) 및 2 배 접합 버퍼 (0.2 M 2 (N의 -morpholino) 에탄 술폰산 (MES), 10 % (v / v)로 글리세롤, 산도 4.5). </li><li> PA 겔을 함유하는 유리 - 바닥 접시에서 모든 PBS를 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용한다. </li><li> 피펫테 겔이 완전히 침수 될 수 있도록 각 젤에 솔루션을 흡수. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 온난 한 에틸 3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 및 실온의 N -hydroxysulfosuccinimide (NHS). </li><li> EDC의 10 배 용액 (150 mM의 DI 물에, 19 ㎎ / ㎖) 및 NHS (250 mM의 DI 물에, 29 ㎎ / ㎖)를 혼합한다. </li><li> 1 부를보기 배 EDC, NHS 1 부를 10 배, 3 부 DI 물, 및 5 중량 배 공액 버퍼를 섞는다. </li><li> 흡수 용액을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용합니다. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다. </li><li> 겔 표면을 커버하고 페트리 접시 (150 ~ 250 μL)의 유리 바닥을 잘 채울 수있는 충분한 NHS / EDC 솔루션을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 실온에서 해동 피브로넥틴. 일단 해동, 50 μg / ml의 피브로넥틴 솔루션을 만들기 위해 멸균 DI 물을 섞는다. </li><li> NHS / EDC의 솔루을 제거하는 생물학적 후드에서 진공 펌프를 사용하여기. 모든 유체가 겔 표면으로부터 제거되어 있는지 확인합니다. </li><li> 각 겔에 피브로넥틴 용액 150 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 부착을 허용하기 위해 35 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 35 분 후 최대 2 주 동안 4 ° C에서 각 페트리 접시 및 저장에 PBS를 추가합니다. </li></ol> 4 트랙션 포스 실험 <ol><li> 물을 욕조에 따뜻한 세포 미디어, PBS, 37 ° C에 트립신. </li><li> 젤 린스 사이에 PBS를 흡입, 멸균 PBS로 5 배, 그리고 후드에 덮여있는 상태로 둡니다 씻어. </li><li> 플라스크를 포함하는 셀에 1 ㎖의 트립신이 25cm 당을 추가합니다. 세포가 플라스크에서 해제 된 후, 세포 미디어 트립신을 희석 세포를 계산합니다. 겔 표면 영역에 기초하여, / cm 2 3,000 세포의 최종 세포 밀도 시드 젤 당 필요한 세포의 수를 결정한다. 희석 또는 셀 미디어 혼합물의 150 μL 세포의 숫자를 포함하도록 서스펜션을 집중한다. 세포 suspens의 나누어지는 150 μL각 젤에 이온. </li><li> 30 분 동안 인큐베이터에서 세포를 포함하는 페트리 접시를 놓습니다. 이어서, 신중 배양 접시를 제거하고 접시의 표면이 완전히 잠기도록 용지 (약 2 mL)로 페트리 접시의 나머지 부분을 채운다. </li><li> 이미지 수집 될 때까지 배양기에서 배양 접시를 다시 배치합니다. </li><li> , 미분 간섭 대비 (DIC) 프리즘을 삽입, 40 배 침수 목적을 삽입 mCherry 또는 이에 상응하는 형광 필터를 선택하고 환경 챔버를 켜 : 이미징 현미경 및 데이터 수집 시스템을 준비합니다. </li><li> 영상을 준비 할 때, 인큐베이터에서 한 페트리 접시를 제거하고 현미경 무대에 조심스럽게 놓습니다. DIC 이미징 페트리 접시의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 하나의 셀을 찾아 DIC의 셀의 하나의 정지 영상을 캡처합니다. </li><li> 현미경 스테이지를 이동하지 않고 형광하는 촬상 모드를 전환. 형광 마이크로 및 녹화에 초점미소 구체의 화상 함수 ord. </li><li> 조심스럽게 피펫으로 배양 접시에서 세포 미디어를 제거하고 0.05 % 트립신-EDTA를 추가합니다. </li><li> 이미지 셀 후 셀 아래 미소 구는 분리했다. </li><li> ImageJ에 12에서 사용 입자 영상 유속계 (PIV) 분석에 의한 세포 힘 변위 필드를 계산합니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

이 방법을 사용할 때, 비드 용액 적절히 희석 및 비즈 원하는 직경에 기초하여 선택되는 것이 필수적이며, PA 겔 기판 강성이고 원하는 실험 탐구되는 현상의 크기 스케일. 상단 유리 커버 슬립을 기능화하기 전에 비드 솔루션을 희석 할 때주의를 기울여야한다. 겔 표면에 구슬 사이의 간격은 콜로이드 용액의 희석 배수를 변화시킴으로써 변경 될 수있다. 너무 용액을 희석하?...

로컬 환경과 살아있는 세포의 기계적 상호 작용은 일반적으로 PA 젤을 이용하여 연구하고있다. 이러한 기판이 기판의 주요 이점 중 하나. 한 1997 Dembo 및 왕에 의해 설립 간단한 잘 특성화 프로토콜에 의존하는 그들의 강성 겔 용액의 특정 구성 요소의 농도를 변경함으로써 조절 될 수 있다는 것이다. 이것은 서로 다른 강성의 환경과 세포의 상호 작용을 연구하는 것이 바람직 플랫폼을 제공합니다. PA 젤은 세포 외 기질 (ECM) 단백질로 코팅하는 경우, 세포가 힘을 생성,이를 준수합니다. 셀 힘의 결과로,이 겔 탄성체로 변형된다. 이 변형은 세포 및 겔의 탄성 특성에 의해 가해지는 힘의 크기에 따라 달라진다. 다양한 연구 셀룰러 견인 세력을 조사하기 위해 PA 젤을 사용했다. PA 겔 제조의 한 변형에서, 형광 마이크로 스피어 (구슬) t을 포함하는다른 경직성이의 젤에 세포 견인 힘을 정량화하기 위해 젤을 hroughout. 셀 힘 부여되면, 비즈 겔 변형 전의 초기 위치로부터 변위. 변형 필드는 각각의 비드로부터의 변위를 측정한다. 이 변형 필드는 탄성 이론 및 견인력을 계산하는 겔의 탄성 특성과 함께 이용된다. 이러한 측정은 세포가 기계적으로 감지하고 해당 지역의 미세 세와 상호 작용하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 많은 널리 사용되는 PA 겔 제조 프로토콜에서 구슬은 액체의 비중 합 상태에서 PA 젤에 걸쳐 혼합된다. 완전히 중합 PA 젤은 볼륨에 걸쳐 형광 구슬이 포함되어 있습니다. 셀 견인력을 계산할 때, 겔 표면 (셀 기판 계면)에 가까운 가장 구슬 모니터링된다. 이러한 비드의 변위는 하중 calculatio의 간략화를 위해 세포 배양 표면에서 발생하는 것으로 가정명. 겔의 깊이 내의 비드의 실제 위치는 무시된다. 그러나, 탄성 매체 (예 PA 겔 등), 힘 적용 점에 가까운 비드 멀리 포인트로부터 비드보다 더 이동한다. 따라서, 셀룰러 트랙션의 과소에 표면에 그 결과로서 표면으로부터 말단 (비드 위치에서) 점의 변위를 치료. 에러의 정도는 표면으로부터의 비드의 거리에 의존한다. 오류가 비드의 위치의 지식없이 추정 될 수 없다. 매우 세포 배양 표면 근처 비드를 한정하는 간단한 방법의 필요성이 몇 가지 기술에 의해 해결되었다. 하나의 방법은 매우 표면 근처 움직임을 측정하는 상부 초점면에 비드 충분한 숫자가되도록 전체에 걸쳐 겔 비드의 밀도를 증가시키는 것이다. 또 다른 기술은 광으로부터 생균 이미징 촛점 촬상 챔버 건물 포함최상위 초점 평면에서만 비드 (4)를 수집한다. 다른 방법은 구슬 다섯없이 이미 중합 된 겔의 상단에 구슬을 포함하는 PA 젤의 매우 얇은 층을 오버레이 포함한다. 이러한 기술의 각각의 단점은 겔 내의 비드의 정확한 위치를 알 수없는 점이다. 이 비드의 변위 필드, 따라서 세포의 힘의 계산의 계산에 오류를 소개한다. 또 다른 기술은 설포 SANPAH 6을 이용하여 이미 중합 PA 겔의 상면에 접합 비드를 포함한다. 이 기술은 비드 만 PA 겔 위에 실로 보장하지만, 그들은 겔의 깊이에 매립되어있는 정도를 알 수있다. 이전 작품은 세포가 힘 마이크론 멀리 칠을 감지 할 수 있음을 제안했다 이것은 잠재적으로 세포의 동작을 변경할 수있는 세포에 대한 지역의 지형을 만들 수 있습니다. 최근에, 1 μm의 직경 F와 PA 젤을 패터닝하는 기술정규화 배열 luorescent 피브로넥틴 도트 마커 팔을 설립되었습니다. 이 경우, 형광 마커의 깊이가 알려져 있으며, 피브로넥틴 패턴 간접적 겔 표면 상에 인쇄 될 때, 본질적으로 제로이다. 그러나,이 방법은 ECM 단백질 1 μm의 직경 도트로 한정되는 바와 같이 세포가 부착 할 수있는 연속적인 환경을 제공하지 않는다. 완전히 매우 표면 근처 알려진 위치 PA 겔 내에 추적기 구슬을 통합하고이를 한정하는 방법이 아직 확립되어야한다. 여기서, 우리는 매우 PA 겔 내의 세포 배양 표면 근처 초점면에 μm의 직경 형광 비드 부 μM을 제한하는 기술을 개발한다. 겔은 전형적으로 두 개의 유리판 사이에 미 중합 액체 겔 용액을 개재하여 경화된다. 겔에 강하게 밀착되도록 플레이트 중 하나가 작용된다. 다른 작용 화하고 겔 경화 후에 제거된다. 우리는이 이동식 유리 스와 수정비즈의 층으로 코팅하여 rface. 기능화 및 비드 코팅 유리 표면 사이의 액체 겔을 끼운 후, 겔 비드 전송은 경화된다. 이것은 표면의 1.6 μM 내의 겔화 구슬 &#39;통합의 거리를 제한한다. 유리 바닥 페트리 접시는 젤이 경화되는 부착면으로 사용된다. 중합시 겔 평면형 표면을 형성하도록, 원형 유리 커버 슬립이 샌드위치에 유리 바닥 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔의 제조에 앞서, 상부 유리 커버 슬립은 양성 표면 전하를 산출, 폴리-D-라이신 (PDL)로 코팅된다. PDL은 압축 공기를 분출하고, 물에 비드 용액 커버 슬립 상에 증착된다. 우리는 음전하를 운반 카르 형광 마이크로 비즈를 이용하고, PDL로 처리하여 생성 된 양으로 대전 된 표면과 상호 작용. 압축 공기의 단일 층 커버 슬립 오프 비드 용액을 불어 후에구슬은 정전 건조 커버 슬립에 연결 상태를 유지합니다. 유리 슬라이드가 완전히 손상되지 않은 그대로 PA 겔로부터 제거됨에 따라 PDL 코팅은 겔 표면에 유리의 접착에 영향을 미치지 않는다. 유리 바닥 페트리 접시는 97 % 3 - 아미노 프로필 - trimethoxysliane 및 0.5 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)로 처리하여 부착 만들어집니다. 원하는 경직성의 PA 젤은 표준 절차 구를 통해 비스 아크릴 아미드와 아크릴 아미드의 적절한 농도를 혼합하여 만들어집니다. 겔 용액의 액체 방울은 유리 바닥 배양 접시 상에 피펫 팅한다. 비드를 함유 유리 커버 슬립이 샌드위치에 페트리 접시와 겔을 사용한다. 겔이 경화 될 때, 상단 커버 슬립은 표면으로부터 1.6 μM 내에 PA 겔에 포함 된 비드를 남겨 제거된다.

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	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">70% Glutaraldehyde</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>111-30-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1M HEPES buffer solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83264</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">40% Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4058</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">2% Bisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1533</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F8801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Fibronectin, Human, 1mg</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0700</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-RAD</td>
			<td>161-0801</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:255px;">1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22980</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">N-hydroxysulfosuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>24500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">NaCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Acrylic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>147230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass</td>
			<td>In Vitro Scientific</td>
			<td>D35-14-1-N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glass cover slips, 12 mm diam.</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy

PA 젤 긴 제조 및 조정 자신의 탄성을 할 수있는 기능의 용이성으로 인해 세포 견인 힘을 연구하기위한 플랫폼으로 사용되어왔다. 기판은 세포 외 기질 단백질로 코팅되는 경우, 세포 부착 및 겔 겔 변형 일으키는 힘을 적용한다. 변형은 세포 견인 및 겔의 탄성 특성에 의존한다. 표면 변형 필드가 알려진 경우, 표면 정지 마찰은 탄성 론을 이용하여 계산 될 수있다. 겔 변형은 일반적으로 균일하게 겔화 형광 마커 비드 매립에 의해 측정된다. 젤 변형으로 프로브는 변위. 겔의 표면 근처에 프로브를 추적됩니다. 이러한 프로브에 의해보고 된 변위는 표면 변위로 간주됩니다. 표면에서 그들의 깊이는 무시됩니다. 이 가정은 견인력 평가에 오류를 소개합니다. 비드의 위치가 알려 져야하는 셀의 힘의 정확한 측정을 위해, 중요하다. 우리는 개발표면의 1.6 μm의 내 PA 젤에, 형광 마커 구슬, 직경 0.1 μm의 한을 제한하는 간단한 화학을 활용하는 기술. 우리는 코트 폴리-D-라이신 (PDL)과 형광 구슬 커버 슬립. PA 겔 용액을 커버 슬립과 접착면 사이에 개재된다. 형광 비드가 경화 중에 겔 용액에 옮긴다. 중합 후, PA 겔은 겔 표면에 비행기 주변에 형광 구슬이 포함되어 있습니다.

공 초점 이미징은 비즈 겔 표면 아래에 실제로 있다고 결정하고 젤 깊이 내 자신의 정확한 위치를 정량화하기 위해 사용되었다. 겔 내부 것과 다른 파장의 형광 비드 표면에 정착하도록 허용하고, 임베디드 형광 나노 입자 및 그 표면 사이의 거리가 중심 식별 알고리즘을 이용하여 계산 하였다. 겔 표면 상에 비드의 위치는 겔 세포가 표면에 부착시에 힘을인가의 상면에 대한 기준으로서 역할을한...

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A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

a-novel-method-for-localizing-reporter-fluorescent-beads-near-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  형광 프로브를 함유하는 폴리 아크릴 아미드 (PA) 겔을 제조하기위한 전통적인 기술은 접착 표면 및 유리 슬라이드 사이에 겔을 개재 포함한다. 여기서, 우리는 폴리-D-라이신 (PDL) 및 형광 프로브이 슬라이드 코팅은 겔 표면으로부터 1.6 μM 내로 프로브 지역화 것을 보여준다. 

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

연구

생체공학

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

레퍼런스 프리 견인력 현미경 플랫폼 제작 및 구현

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

화학적 집단 이동을 위한 미세 유체와 통합된 견인 현미경 검사법

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

B 림프구 활성화를 연구하는 견인력 현미경 검사법

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

조기 골관절염을 검출하기 위한 원자력 현미경 검사법 적용

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...