CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.

1. Electroporate التركيبة الاهتمام في الأنابيب العصبية للأجنة الدجاج HH12-13 في البيضة استخدام مراسل الفلورسنت، ويفضل في نسخة bicistronic أو تنصهر للبروتين في المصالح مع الإقحام الفيروسي 2A الببتيد 11، لتمكين سرعة تحديد الأفراد ذوي مستويات مرضية من ترنسفكأيشن. ملاحظة: فترة حضانة نموذجية لهذه المرحلة حوالي 48 ساعة في 37.8 درجة مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح نافذة صغيرة في البيض بعد إزالة 3 مل من الألبومين مع حقنة إلى جانب 18 G × 1 1/2 إبرة. لتعزيز الجنين التصور، حقن كمية صغيرة من الحبر الهندي المخفف 01:50 في محلول معقم رينغر تحت الجنين 1-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تغطية الجنين بمحلول معقم رينغر، وضخ 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.2 و 0.1٪ الغذاء صبغ (F، D &amp; C) محلول يحتوي على 2.5 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض النووي حتى نهاية الخلفي من الأنبوب العصبي حتى يملأيصل إلى المنطقة الدماغ المؤخر. لelectroporate، أقطاب البلاتين موقف (0.5 ملم في القطر) مفصولة 4 مم 1 على طول منطقة الجناح وتقديم 5 نبضات من 50 ميللي ثانية و 20 V مع فاصل من 100 ميللي ثانية بينهما 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد Electroporation لل، واحتضان الأجنة التلاعب بها لمدة 48 ساعة وأكثر حتى تصل إلى مرحلة HH23 وتحديد الأفراد تقديم مستوى عال من ترنسفكأيشن في المنطقة الاجنحة تحت stereomicroscope الفلورسنت. ملاحظة: مدة حضانة المرض بعد Electroporation لليعتمد على الهدف من التجربة. يمكن البلازميدات electroporated تولد مستويات التعبير كبيرة بعد 2 ساعة 2. وبالتالي، إذا كانت المصلحة تكمن في الجينات ظهور أوائل فترة الحضانة ما بعد Electroporation للويمكن تخفيضها. </li></ol> 2. الحصاد Transfected بنجاح الأجنة وتشريح الأنصاف الحبل الشوكي Electroporated ملاحظة: يستمر هذا الإجراء 2-3 ساعة لكل 10 أجنة والعوائد 1-2 الحمض النووي الريبي مجموع ميكروغرام لكل الجنين. تشريح الأنابيب العصبية يتطلب حركات غرامة وربما تكون بعض جلسات التدريب الضروري قبل تطبيقه على عينات تجريبية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير أدوات تشريح المعدنية مع حل ريبونوكلياز إزالة التلوث أو عن طريق الخبز على 150 درجة مئوية لمدة 4 ساعات 12 وإعداد برنامج تلفزيوني المعالجة DEPC. استخدام الوحيد الجديد مصدق خالية من ريبونوكلياز بلستيكور. ملاحظة: بعد الحصاد، فمن المهم اتباع الرعاية القياسية لمنع التلوث ريبونوكلياز خلال تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأجنة باستخدام زوج من مقص تشريح غرامة وملعقة جمع منخول. الحفاظ على الأجنة في برنامج تلفزيوني الباردة المعالجة DEPC في 100 مم طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج من ملاقط دقيقة، قطع منطقة الجناح كلها (بين الحد الخلفي لبرعم الطرف الأمامي والحد الأمامي لبرعم الطرف الخلفي) ونقل هذا القسم إلى طبق جديد يحتوي البارد PBS المعالجة DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من الإبر الزجاج غرامة لخرم في ثلاثة مختلفةيشير على كل جانب ظهراني الجنين بين الأنبوب العصبي والأديم المتوسط ​​المجاور للمحور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدخال الإبر الزجاج اثنين من ثقب في وسط والتحرك ببطء واحد منهم بعيدا على طول أنبوب المحور الأمامي الخلفي العصبي. كرر هذا للثقوب التي لا تصلها حركات الأولى. إزالة الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور منفصلة مع زوج من ملاقط غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الجنين جانبية، إدراج نصائح من ملاقط بين الأنبوب العصبي والحبل الظهري وشريحة منهم في اتجاهين متعاكسين على طول المحور الأمامي الخلفي للفصل بين الهيكلين. ملاحظة: هذا أيضا يجب إزالة أكثر من الأديم المتوسط ​​لا تزال تعلق على الأنبوب العصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، قم بإزالة أي أكبر قطعة من نسيج الأديم المتوسط ​​التي لا تزال تعلق عن طريق سحب مع زوج من ملاقط حين الضغط بخفة الأنبوب العصبي مع زوج آخر من الملقط. عند الانتهاء، ونقل بلطف الأنبوب العصبي إلى طبق آخر يحتوي على البارد المعالجة DEPC PBS باستخدامريبونوكلياز خالية من الزجاج ماصة باستير مقترنة لمضخة ماصة اليدوية والحفاظ على الجليد حتى يتم تشريح جميع الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الأنابيب العصبية إلى نصفين. لهذا، أدخل طرف حاد من زوج من ملاقط مغلقة في التجويف وفتح لوحة السقف عن طريق تحريك ملاقط من خلال ذلك. بعد ذلك، فصل نصفين عن طريق خفض لوحة الأرض مع النصائح ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع electroporated من نصفين غير electroporated تحت نطاق الفلورسنت تشريح ونقل إلى أنبوب 1.5 مل مليئة المعالجة DEPC PBS الجليد الباردة. إذا لزم الأمر، ونفض الغبار microtubes بلطف للافراج عن أي نوع من الأنسجة التي تعلق على الجدران البلاستيكية وتشجيع الترسيب من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 100 x ج لمدة 3 ثوان، وإزالة ببطء شديد كما PBS قدر ممكن مع 1 مل ممص مكروى. تفعل هذا في حين تبحث في مصدر الضوء الذي يضيء من خلال microtube لمراقبة إذا تم امتصاص أي مادة الجنينية لطرف ماصة. إذا حدث هذا، الوفاء ببطء وتكرار centrifugaنشوئها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 70 ميكرولتر من محلول تحلل لاستخراج الحمض النووي الريبي في الأنبوب العصبي نصف ونفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ودوامة بقوة. تكرار حضانة 5 دقائق وvortexing لمرتين أخريين. تخزين في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما لا يقل عن ثمانية نصفين الأنبوب العصبي لكل عينة لضمان العائد المناسب لاتخاذ الخطوة التالية. تجميع عينات أصغر إذا مطلوبة عدة جلسات Electroporation لل/ تشريح لجمع عدد كاف من الأنابيب العصبية. تخزين عينات كافية للمكررة أو يثلث لكل حالة. </li></ol> 3. تنقية RNA وإعداد مكتبات التسلسل البورشيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات من -80 ° C تخزين ووضع على الجليد لمدة 15-30 دقيقة. استئناف ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حتى تكتمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة جيدا ويترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الدوامة مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 1 دقيقة لتكوير المواد غير القابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لأنبوب جديدوالشروع في استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لمجموع العزلة RNA دليل طقم التعليمات. أزل في الحد الأدنى للحجم الموصى بها لزيادة التركيز. ملاحظة: العلاج الدناز بعد تنظيف يوصى من أجل تجنب التلوث المحتمل لتسلسل الحمض النووي الجيني في قواعد البيانات-RNA يليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار الأنبوب لخلط محتويات وإزالة 5 ميكرولتر لتحليل ومراقبة الجودة. تخزين العينة المتبقية في -80 درجة مئوية حتى إعداد مكتبة. يجب إذابة هذه العينات مرة واحدة فقط لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل RNA المنقى في صك Bioanalyzer باستخدام نانو عدة RNA 6000. يجب أن تكون قيمة رين على الأقل فوق 7 والمضي قدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مكتبات باستخدام-RNA يليها متوافقة إعداد مكتبة والبورشيد ومتعدد يصل إلى 4 مكتبات في ممر واحد صك HiSeq المتوقع أن تولد 100 BP يقرأ احد. إذا كان ذلك ممكنا، وتشمل جميع العينات في نفس المدى للحد من التحف الفنية المحتملة. ملاحظة: يجب أن تسفر عن ما يصل الى 50 مليون صEADS في العينة، التي هي أكثر من كافية للحصول على تغطية لمعظم الجينات 13. </li></ol> 4. قارن بين مجموعات البيانات-RNA يليها في خادم غالاكسي العامة 10. ملاحظة: مساحة التخزين خادم محدودة وتجارب مقارنة عينات كثيرة قد تتطلب حذف الملفات وسيطة ولدت في الخطوات الترشيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء حساب مستخدم في وحدة خدمة الجمهور غالاكسي ( <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) وبروتوكول نقل الملفات تحميل قواعد البيانات البورشيد في شكل fastq. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الملفات التي يتم تحميلها مع أداة FastqGroomer 14 تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. إذا تم ترميز نقاط جودة بالفعل في PHRED + 33 (سانجر)، تخطي هذه الخطوة ببساطة عن طريق تغيير نوع الملف إلى fastqsanger تحت سمات لكل مجموعة البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نوعية العامة لكل مجموعة البيانات باستخدام أداة FastQC تحت NGS: مراقبة الجودة والتلاعب لينو. ملاحظة: ينبغي إيلاء اهتمام خاص لرسومات الناتجة عن محتوى تسلسل في تسلسل جودة قاعدة ولكل قاعدة، كما ستوفر هذه التقديرات للمعلمات المستخدمة لتقليم نهايات يقرأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم يقرأ لتجاهل 3 &quot;ينتهي مع البيانات منخفضة الجودة باستخدام أداة FASTQ الجودة المتقلب 14 تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. تعيين أداة لمعالجة 3 فقط &#39;ينتهي لدرجة جودة أقل من 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متواليات محول من يقرأ باستخدام أداة كليب ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) تحت NGS: القائمة مراقبة الجودة والتلاعب. تعيين أداة لتجاهل يقرأ مع أقل من 45 BP اليسار، إدخال سلسلة من محول المستخدمة واختيار الانتاج لتشمل كلا متواليات قص وغير قص. بالإضافة إلى ذلك، تختار عدم تجاهل تسلسل مع قواعد معروفة لأن معظم القواعد جودة منخفضة أزيلت بالفعل في الخطوة الأخيرة. </lأنا&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة تسلسل تريم ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) تحت NGS: مراقبة الجودة والقائمة التلاعب، وتقليم الأسس الأولى ليقرأ لإزالة 5 &quot;التحيز تسلسل الكشف عنها بواسطة FastQC (عادة 10). ملاحظة: عند هذه النقطة، انها فكرة جيدة لتشغيل FastQC مرة أخرى ومقارنتها مع التحليل السابق لتحديد ما إذا تم تحسين نوعية البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتفريغ أحدث التجمع جينوم الدجاج للمتصفح الجينوم UCSC من البورشيد iGenomes ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) وتحميل كامل الجينوم FASTA شكل ملف وملف تنسيق GTF الجينات الشرح لتاريخ المجرة باستخدام ملف تحميل أداة ضمن القائمة إحضار بيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خريطة يقرأ لكل عينة لجينوم الدجاج باستخدام اليجنر TopHat2 تحت 15وNGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الجينوم من التاريخ (حدد الملف FASTA تحميلها في الخطوة 4.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء Transcriptome على توقع لكل عينة باستخدام أزرار أكمام تحت 16 خ ع: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الشرح الإشارة كدليل (حدد الملف GTF التي تم تحميلها في الخطوة 4.7) وتشغيل خيارات تنفيذ تصحيح التحيز (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7) والاستخدام الصحيح قراءة متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج transcriptomes توقع لجميع العينات باستخدام Cuffmerge 16 تحت NGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. اختيار لاستخدام الشرح المرجعية (ملف GTF من الخطوة 4.7) وبيانات تسلسل (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة ملفات BAM الناتجة عن TopHat2 لكل عينة باستخدام Cuffdiff 16 تحت NGS: القائمة تحليل الحمض النووي الريبي. في النصوص الحقل حدد ليTranscriptome على rged ولدت قبل Cuffmerge وتشغيل الخيارات نفذ تصحيح التحيز (من التاريخ، وملف FASTA من الخطوة 4.7) والاستخدام الصحيح قراءة متعددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع التعبير التفاضلي اختبار الجداول تصاعدي عدديا في العمود 13 (قيمة ف) باستخدام أداة ترتيب ظل تصفية وفرز القائمة. ملاحظة: الجينات / النصوص التي تبين التعبير فارق كبير بين ظروف تجريبية سيقدم أدنى قيم س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق النتائج بصريا مع تغطية الرسوم البيانية، أولا تحويل الملفات إلى تنسيق BAM bedGraph باستخدام أداة إنشاء BedGraph تغطية الجينوم 17 ضمن القائمة BEDTools. تعطيل الإبلاغ عن المناطق بدون تغطية، واختيار لعلاج إدخالات كما تقسم فترات متميزة وتوسيع نطاق التغطية من قبل أحد العوامل التي تطبع عمق التسلسل لجميع مجموعات البيانات التي تقارن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الملف إلى تنسيق bedGraph الناتجة العظيم الشأن باستخدامأداة الباروكة / BedGraph-إلى-العظيم الشأن ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) ضمن القائمة تنسيقات تحويل. تحميل الملفات العظيم الشأن من المسارات المخصصة في متصفح الجينوم UCSC ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) لتجميع galGal4 والبحث في الجينات التي تهم تصور التغطية في قواعد البيانات. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229 (3), 433-439 (2004).</li><li>Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporations+of+HH+stage+10+chicken+embryos.">In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos.</a> J. Vis. Exp. (9), 10-3791 (2007).</li><li>Sauka-Spengler, T., Barembaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+approaches+in+the+chick+embryo.">Gain- and loss-of-function approaches in the chick embryo.</a> Methods Cell Biol. 87, 237-256 (2008).</li><li>Ghadge, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+wild-type+SOD1+and+FALS-linked+mutant+SOD1+cause+neural+cell+death+in+the+chick+embryo+spinal+cord.">Truncated wild-type SOD1 and FALS-linked mutant SOD1 cause neural cell death in the chick embryo spinal cord.</a> Neurobiol. Dis. 21 (1), 205-20 (2006).</li><li>Megason, S. G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitogen+gradient+of+dorsal+midline+Wnts+organizes+growth+in+the+CNS.">A mitogen gradient of dorsal midline Wnts organizes growth in the CNS.</a> Development. 129 (9), 2087-2098 .</li><li>Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sparking+new+frontiers:+using+in+vivo+electroporation+for+genetic+manipulations.">Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations.</a> Dev. Biol. 233 (1), 13-21 (2001).</li><li>Cloonan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+transcriptome+profiling+via+massive-scale+mRNA+sequencing.">Stem cell transcriptome profiling via massive-scale mRNA sequencing.</a> Nat. Methods. 5 (7), 613-619 (2008).</li><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galaxy+Team.+Galaxy:+a+comprehensive+approach+for+supporting+accessible,+reproducible,+and+transparent+computational+research+in+the+life+sciences.">Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences.</a> Genome Biol. 11 (8), 86 (2010).</li><li>Trichas, G., Begbie, J., Srinivas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+viral+2A+peptide+for+bicistronic+expression+in+transgenic+mice.">Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice.</a> BMC Biol. 6, 40 (2008).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning. A laboratory manual. , (1982).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+coverage+and+depth+of+transcriptome+by+RNA-Seq+in+chickens.">Evaluation of the coverage and depth of transcriptome by RNA-Seq in chickens.</a> BMC Bioinformatics. 12, 10-1186 (2011).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinformatics. 26 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), 36 (2013).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Vieceli, F. M., Sim&#245;es-Costa, M., Turri, J. A., Kanno, T., Bronner, M., Yan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+chicken+Scratch2+is+expressed+in+a+subset+of+early+postmitotic+neural+progenitors.">The transcription factor chicken Scratch2 is expressed in a subset of early postmitotic neural progenitors.</a> Gene Expr. Patterns. 13 (5-6), 189-196 (2013).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system.">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Dev. Growth. Differ. 45 (4), 361-367 (2003).</li><li>Rao, M., Baraban, J. H., Rajaii, F., Sockanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+comparative+study+of+RNAi+methodologies+by+in+ovo+electroporation+in+the+chick+embryo.">In vivo comparative study of RNAi methodologies by in ovo electroporation in the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 231 (3), 592-600 (2004).</li><li>Lu, Y., Lin, C., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PiggyBac+transgenic+strategies+in+the+developing+chicken+spinal+cord.">PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 141 (2009).</li><li>Sim&#245;es-Costa, M., Tan-Cabugao, J., Antoshechkin, I., Sauka-Spengler, T., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+reveals+novel+players+in+the+cranial+neural+crest+gene+regulatory+network.">Transcriptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network.</a> Genome Res. 24 (2), 281-290 (2014).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نحن هنا توفير مبادئ توجيهية لتحليل الآثار بعد Electroporation للمن الحبل الشوكي الدجاج. على الرغم من Electroporation للناقلات الحمض النووي هو أكثر كثيرا ما تستخدم لبإفراط عن الجين من الفائدة، ويمكن للمرء أيضا استخدام التركيبات ترميز السلبيات المهيمنة، والبروتينات quimeric أو السلائ?...

الدراسات الجينية على الكائنات الحية كثيرا ما تستخدم الجنين الدجاج كنموذج لأنه في Electroporation للالبيضة يمثل وسيلة سريعة وغير مكلفة لبالنقل جزئيا الهياكل الجنينية في الجسم الحي مع الحمض النووي يبني 1-5. ناقلات التعبير Bicistronic التي تكود نسخة واحدة تحتوي مراسل فلوري مع الجينات في المصالح، مثل pCIG 6 أو 7 pMES، يسمح بالتحقق السريع للجودة ترنسفكأيشن في المنطقة المطلوب بموجب stereomicroscope قبل معالجة الأجنة لتحليل المصب. مع التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي، أصبح من الممكن الآن الحصول رقمية كاملة لمحات Transcriptome على التعبير من عينات الحمض النووي الريبي RNA باستخدام تسلسل 8،9. لذا، بدلا من الأساليب تستغرق وقتا طويلا التي تمكن من تحليل سوى عدد قليل من المنتجات الجينات في موازاة ذلك، مثل الموقع التهجين، المناعية وQPCR، وإعداد مكتبات [كدنا في ليمكن عالية الإنتاجية تسلسل تقديم المعلومات من Transcriptome على كله. يمكن ملاحظة آثار التجريبية على مستويات التعبير الجيني من كل واحد بدوره تقدم رؤى قوية على مسارات غيرت من التركيبة المستخدمة. هذا أمر سهل لا سيما إذا كان التجمع الجيني للكائن المستخدم هو متاح، وبالتالي فإن الجنين الفرخ هو نموذج مناسب مرة أخرى. إذا كان المستخدم لديه حق الوصول إلى مركز موثوق تسلسل الجينوم، القضية الرئيسية هي الحصول على عينات الحمض النووي الريبي جودة عالية. يوضح هذا العمل وسيلة للحصول على عينات من الحمض النووي الريبي من الأنابيب العصبية transfected مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي، وكذلك الخطوات اللاحقة للسيليكون في تحليل مجموعات البيانات الناتجة عن ذلك. بعد Electroporation للفي HH12-13 تليها 48 ساعة الحضانة، تم تشريح الجذع transfected نصفين الحبل الشوكي في ظروف خالية من ريبونوكلياز، هي lysed على الفور وزيادة حمايتها من التدهور قبل منخفضة للغاية حتى تجميد تنقية RNA ومكتبة preparatأيون. خادم العام غالاكسي 10 يوفر وصولا إلى تحرير الموارد لتحليل البيانات التسلسل الإنتاجية العالية. مقدار المساحة المعروضة للمستخدمين المسجلين يكفي للتجارب صغيرة، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى البنية التحتية الحاسوبية المحلية. ويشمل تحليل البيانات RNA يليها الترشيح، والمحاذاة والكميات / المقارنة بين التعبير الجيني. على الرغم من أن هناك مبادئ توجيهية عامة لتحليل البيانات RNA يليها، ومعايير الترشيح سيعتمد إلى حد كبير على نوعية التسلسل وينبغي أن تحدد بعد تحليل ومراقبة الجودة للبيانات الخام. يصف هذا البروتوكول الخطوات للحصول على ومقارنة ملامح-RNA يليها من الدجاج الجنينية النخاع الشوكي transfected في الجسم الحي. نتيجة التمثيلية، وأظهرت المقارنة بين مجموعات البيانات التي تم الحصول عليها من عينتين مراقبة مستقلة transfected مع ناقلات الفارغة أن الأسلوب هو استنساخه وينبغي أن يسمح بتحديد اكسبريس تفاضليالنصوص سد في العينات التجريبية. وبالتالي، تطبيق هذه الطريقة لها القدرة على زيادة كبيرة في عدد من الاكتشافات بعد تجربة واحدة واحدة، وبالتالي توفير مجموعة كبيرة من البيانات للتحقيق لاحق.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1031">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:425px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indian &#236;nk</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18G x 1 1/2 needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>819620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F D &#38; C Blue 1</td>
			<td>Spectra Colors Corporation</td>
			<td>5.FC.0010P0</td>
			<td>Food Dye used to visualize DNA injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ringer&#39;s solution (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 7.2 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.37 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.225 g CaCl2.2H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.217 g Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.02 g KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 1 L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Filter and autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 8 g NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.2 g KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 1.15 g Na2HPO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.2 g KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - ddH2O to 1 L and filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160; - Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sieved spoon</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNaseZap RNase decontamination solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine point surgical scissors</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Straight fine point tweezers</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>40A502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">9&#39;&#39; glass Pasteur pipette</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Manual pipette pump</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNAlater solution for RNA stabilization</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNAqueous total RNA isolation kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Biology Grade Ethanol</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Truseq RNA Sample Preparation Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001/RS-122-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

للتحقق من صحة الطريقة الموصوفة، وقد تم توليد عينات سيطرة اثنين من الأجنة electroporated مع pMES ناقلات الفارغة 7 وعينة واحدة من أجنة transfected مع نفس ناقلات تحتوي على إدراج بناء SCRT2-ZNF، الذي يشفر المجالات الزنك وأصابع الدجاج SCRT2 18. وقد تم الحصول على عينات العائد 11-22 ميكر...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord at JoVE.com

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K Views.  Universidade de São Paulo. This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

Video: RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Dissection and Culture of Chick Statoacoustic Ganglion and Spinal Cord Explants in Collagen Gels for Neurite Outgrowth Assays

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation depends on a combination of axon guidance cues1 and survival factors2 located along the trajectory of growing axons and/or within their sensory organ targets. For example, functional interference with a classic axon guidance signaling pathway, semaphorin-neuropilin, generated misrouting of otic axons3. Also, several growth factors expressed in the sensory targets of the inner ear, including Neurotrophin-3 (NT-3) and Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), have been manipulated in transgenic animals, again leading to misrouting of SAG axons4. These same molecules promote both survival and neurite outgrowth of chick SAG neurons in vitro5,6.
Here, we describe and demonstrate the in vitro method we are currently using to test the responsiveness of chick SAG neurites to soluble proteins, including known morphogens such as the Wnts, as well as growth factors that are important for promoting SAG neurite outgrowth and neuron survival. Using this model system, we hope to draw conclusions about the effects that secreted ligands can exert on SAG neuron survival and neurite outgrowth. 
SAG explants are dissected on embryonic day 4 (E4) and cultured in three-dimensional collagen gels under serum-free conditions for 24 hours. First, neurite responsiveness is tested by culturing explants with protein-supplemented medium. Then, to ask whether point sources of secreted ligands can have directional effects on neurite outgrowth, explants are co-cultured with protein-coated beads and assayed for the ability of the bead to locally promote or inhibit outgrowth. We also include a demonstration of the dissection (modified protocol7) and culture of E6 spinal cord explants. We routinely use spinal cord explants to confirm bioactivity of the proteins and protein-soaked beads, and to verify species cross-reactivity with chick tissue, under the same culture conditions as SAG explants. These in vitro assays are convenient for quickly screening for molecules that exert trophic (survival) or tropic (directional) effects on SAG neurons, especially before performing studies in vivo. Moreover, this method permits the testing of individual molecules under serum-free conditions, with high neuron survival8.

We demonstrate how to dissect and culture chick E4 statoacoustic ganglion and E6 spinal cord explants. Explants are cultured under serum-free conditions in 3D collagen gels for 24 hours. Neurite responsiveness is tested with growth factor-supplemented medium and with protein-coated beads.

تشريح العقدة والثقافة والفرخ Statoacoustic Explants النخاع الشوكي في الهلام الكولاجين لفحوصات ثمرة Neurite

The sensory organs of the chicken inner ear are innervated by the peripheral processes of statoacoustic ganglion (SAG) neurons. Sensory organ innervation ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

الجاذبة - DRG وصفها من الخلايا العصبية لدراسة المحاور المتفرعة في إعداد جبل الجامعة الحبل الشوكي الفأر الجنينية

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

تشريح والتركيب الجانبي من اسماك الزرد الأجنة: تحليل التنمية الحبل الشوكي

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Transection الحبل الشوكي في اليرقات الزرد

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

التعبير المرتبطة بالغدة التحوير الفيروس بوساطة في المعرفة وراثيا من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...