وقد دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد القومية للصحة (1R35GM133496-01) إلى Z. Gao. نود أن نشكر الدكتور ريان هوبز على المساعدة في القسم. نشكر المرافق الأساسية لكلية ولاية بنسلفانيا للطب، بما في ذلك علوم الجينوم والمعلوماتية الحيوية، والتصوير المجهري الضوئي المتقدم، وقياس التدفق الخلوي. كما نشكر الدكتور يوكا إيمامورا على المساعدة في تحليل الحمض النووي الريبي.

1. ثقافة mESC
<ol><li>معطف 10 سم الأنسجة الثقافة المعالجة لوحة مع 0.1٪ الجيلاتين والسماح للجيلاتين لتعيين ما لا يقل عن 15-30 دقيقة قبل أسبيراتينغ بها.</li>
	<li>البذور γ المشععة الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) قبل يوم واحد من زرع mESCs في المتوسط mESC قبل الاحماء (دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) مع 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، والأحماض الأمينية غير الأساسية، β ميركابتوثانول، إل-غلوتامين، البنسلين/الستربتومايسين، بيروفات الصوديوم، LIF، PD0325901 (PD)، وChir99021 (CH)).</li>
	<li>السماح للماء المشع γ لتسوية ونلتصق على سطح لوحة قبل زراعة الخلايا E14.</li>
	<li>تذوب E14 ESCs في حمام مائي 37 درجة مئوية ونقل الخلايا بسرعة في أنبوب مخروطي 15 سم مع المتوسطة mESC الدافئة. بيليه الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.</li>
	<li>إعادة تشغيل الخلايا في 10 مل من المتوسط mESC ولوحة الخلايا على لوحة الثقافة التي تحتوي على MEFs المشع γ المصنفة في وقت سابق. احتضان ثقافة الخلية في حاضنة 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.</li>
	<li>لثقافة passaging، يستنشق ه المتوسطة وغسل لوحة معقمة 1x PBS. إضافة ما يكفي من 0.05٪ تريبسين لتغطية سطح لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>تحييد التريبسين مع المتوسطة mESC وماصة لتوليد تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.</li>
	<li>عد الخلايا مع عداد الدم أو عداد الخلية والبذور حوالي 5.0 × 105 خلايا في لوحة ثقافة 10 سم.</li>
	<li>Resuspend الخلايا في 10 مل من المتوسطة mESC، لوحة الخلايا على لوحة زراعة الأنسجة المغلفة الجيلاتين واحتضان الثقافات كما هو موضح سابقا. ملاحظة: من المستحسن أن يتم تمرير mESCs كل يومين لمنع الخلايا من التفريق في مستعمراتها. فينول الأحمر في وظائف متوسطة فقط كمؤشر درجة الحموضة واعتمادا على الكثافة الخلوية، فإنه يمكن أن تتحول مصفر (أكثر حمضية)، في وقت أقرب من 2 أيام. وبالتالي، قد يكون من الضروري تغيير الوسط كل يوم. سوف تموت صناديق الاستثمار متعددة الإشعاعات γ في نهاية المطاف بعد بضعة مقاطع.</li>
</ol>2. EB، المجلس الوطني للصحافه، والتمايز العصبي
<ol><li>تنفيذ بروتوكول تمرير الثقافة المذكورة سابقا، وعدد الخلايا (الخطوات 1.7-1.10).</li>
	<li>طريقة إسقاط شنقا (يوم 0)<ol>
<li>للوحة زراعة الخلية 10 سم، عد ما يقرب من 2.5 × 104 خلايا حيث سيتم تعليق 5.0 ×10 2 خلايا في 20 ميكرولتر متوسط التمايز (DMEM مع 15٪ FBS، والأحماض الأمينية غير الأساسية، β ميركابتوثانول، L-الجلوتامين، البنسلين / streptomycin، وبيروفات الصوديوم). يمكن أن تكون مطلية ما يقرب من خمسين قطرات 20 ميكرولتر التي تحتوي على الخلايا على لوحة واحدة 10 سم.</li>
		<li>Aliquot العدد المناسب من الخلايا، ومن ثم الطرد المركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant.</li>
		<li>إعادة إنفاق الخلايا في الحجم المناسب من وسيط التمايز لكثافة الخلية من 5.0 × 102 خلايا لكل 20 ميكرولتر (على سبيل المثال، 2.5 × 104 خلايا في 1 مل من متوسط التمايز).</li>
		<li>باستخدام ميكروباينيت أو ماصة مكررة، ضع قطرات 20 ميكرولتر من تعليق الخلية على غطاء لوحة زراعة الأنسجة. تأكد من أن قطرات ليست قريبة جدا من بعضها البعض لمنعهم من الاندماج. ملاحظة: يمكن أن تكون مطلية قطرات على لوحة مرفق الأنسجة الثقافة المعالجة أو لوحة تعليق كما سيتم وضعها على الغطاء وليس لوحة نفسها. لنهج أكثر جدوى وعقيمة، لوحة قطرات على لوحة مرفق الأنسجة والثقافة ونقلها إلى لوحة تعليق كما هو موضح أدناه.</li>
		<li>ملء لوحة مع 5-10 مل من برنامج تلفزيوني 1x ووضع بعناية الغطاء مرة أخرى على لوحة. احتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية. ملاحظة: يتم إضافة برنامج تلفزيوني إلى لوحة الثقافة لمنع قطرات من الجفاف.</li>
	</ol></li>
	<li>في اليوم 2، استخدم micropipette لجمع قطرات من الغطاء ووضعها في لوحة تعليق خلية 10 سم مليئة 10 مل من وسيط التمايز. احتضان الثقافة على شاكر المداري تهتز بسرعة منخفضة في الحاضنة.</li>
	<li>في اليوم 4، لحصاد EBs ، وجمع الخلايا ، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant. ملاحظة: يمكن غسل EBs أيضا مع برنامج تلفزيوني 1x وفقا لمتطلبات التجارب اللاحقة.</li>
	<li>لمواصلة الإجراء والحث على التمايز EB في خلايا السلف العصبي (NPCs)، وإعداد وسيط التمايز مع حمض الريتينويك 5 ميكرومتر (RA).</li>
	<li>إزالة المتوسطة القديمة عن طريق بيليه EBs في 100 × ز لمدة 3 دقائق أو السماح لEBs لتسوية قبل أسبيراتينغ خارج المتوسطة القديمة. أضف 10 مل من وسيط التمايز الذي يحتوي على 5 ميكرومتر RA إلى لوحة الثقافة.</li>
	<li>في اليوم 6، استبدل ما لا يقل عن نصف الوسط بوسط طازج يحتوي على 5 ميكرومتر RA عن طريق إمالة اللوحة وأنابيب الوسط كما هو موضح أعلاه. ملاحظة: من المستحسن أن يتم استبدال نصف المتوسط على الأقل مع وسيطة جديدة تحتوي على RA في اليومين 5 و 7. يحيط علما مؤشر فينول الأحمر; إذا كان يتحول مصفر، فمن الأفضل أن تحل محل كل من المتوسط.</li>
	<li>في اليوم 8، حصاد الشخصيات الوطنية عن طريق جمع الخلايا ، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقائق ، وإزالة supernatant. ملاحظة: يمكن غسل الشخصيات أيضا مع برنامج تلفزيوني 1x وفقا لاحتياجات التجارب اللاحقة. وإذا لزم الأمر، يمكن تجميد المركبات غير الوطنية وذوبانها مرة أخرى من أجل الثقافة والتحليل في وقت لاحق. إذا كان ل NPCs أن تكون مثقفة، يمكن أيضا استخدام accutase كبديل للتريبسين.</li>
	<li>لمواصلة الإجراء وتمييز الشخصيات في الخلايا العصبية، وجمع الخلايا العصبية في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق الطرد المركزي، وتفكيكها مع التريبسين واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. ماصة الشخصيات لضمان أن يتم فصل جميع المجاميع المجلس الوطني لنواب الشعب وتحييد التريبسين مع المتوسطة.</li>
	<li>تصفية الخلايا مع 40 ميكرومتر مصفاة خلايا النايلون والعد الخلايا قبل الطلاء لهم في كثافة 1.5 × 105/ سم2 في N2 المتوسطة (DMEM / F12 المتوسطة + 3 ملغ / مل الجلوكوز + 3 ملغ / مل الدهون الغنية مصل البقري الألبومين (LBSA) + 1:100 N2 الملحق + 10 نانوغرام / مل bFGF + 50 U / مل القلم / العقدية + 1 mM L-الجلوتامين) على لوحة الأنسجة والثقافة المعالجة لPCR اللاحقة والتجارب لطخة الغربية; أو على غرفة زراعة الأنسجة لتجارب immunofluorescence.</li>
	<li>في اليوم 9، استبدل الوسط القديم بوسط N2 طازج.</li>
	<li>في اليوم 10, تبديل المتوسط N2 مع N2/B27 المتوسطة (50٪ DMEM/F12 و 50٪ القاعدية العصبية, 3 ملغم/مل LBA, 1:200 N2 الملحق, 1:100 B27 الملحق, 50 U/mL القلم / العقدية, و 1 MM L-الجلوتامين).</li>
	<li>في الأيام 11-12، حصاد الخلايا العصبية على النحو التالي. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x، إضافة تريبسين، واحتضان الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق قبل تحييد التريبسين مع أجهزة الطرد المركزي والمتوسطة في 200 × ز لمدة 3 دقائق.</li>
</ol>3. توصيف mESCs والخلايا المتمايزة
<ol><li>الفوسفاتاز القلوية (AP) المقايسة 
	<ol>
<li>استخدم مجموعة لتقييم نشاط الفوسفاتاز القلوية (انظر جدول المواد).</li>
		<li>إزالة المتوسطة من لوحة الثقافة وغسل ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x.</li>
		<li>إضافة 1 مل من حل الإصلاح (يتكون من الفورمالديهايد والميثانول) المقدمة مع عدة إلى لوحة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق. ملاحظة: الإفراط في الحضانة في حل الإصلاح يمكن أن يعرض نشاط AP للخطر.</li>
		<li>إزالة الحل الإصلاح، وغسل ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x وترك بعض كمية من برنامج تلفزيوني في لوحة. ملاحظة: حافظ على رطوبة ESCs في PBS لعدم تعريض نشاط AP للخطر.</li>
		<li>قم بإعداد حل AP عن طريق خلط حلول الركيزة A وB وC بنسبة 1:1:1. امزجي المحاليل A وB أولا واحتضني الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين قبل إضافة محلول C.</li>
		<li>إزالة برنامج تلفزيوني 1x وإضافة الحل AP أعدت في وقت سابق.</li>
		<li>احتضان ESCs لمدة 15 دقيقة في الظلام عن طريق التفاف لوحة الثقافة مع رقائق الألومنيوم أو أداء الخطوة 3.5 في غرفة مظلمة.</li>
		<li>مراقبة رد الفعل وإزالة محلول رد الفعل عندما يتحول الحل مشرق لتجنب تلطيخ غير محددة.</li>
		<li>غسل ESCs مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.</li>
		<li>منع العينة من التجفيف عن طريق تغطية ESCs مع برنامج تلفزيوني 1x أو تركيب المتوسطة. ملاحظة: سوف تظهر وصمة عار حمراء أو أرجوانية للتعبير عن AP. يمكن تخزين الطبق في ثلاجة 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>جمع الخلايا في مراحل مختلفة باتباع الخطوات 1.6-1.7 و 2.4 لESCs وEBs وNPCs، على التوالي.</li>
		<li>عزل الحمض النووي الريبي باستخدام الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، واستخراج البروتين الحل (انظر جدول المواد).</li>
		<li>إنشاء cDNA مع عدة النسخ العكسي (انظر جدول المواد)واتبع دليل الشركة المصنعة.</li>
	</ol></li>
	<li>التثبيت والتضمين 
	<ol>
<li>حصاد EBs وNPCs كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2.6) وإصلاحها مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) الحل في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>إزالة PFA وغسل العينة مع برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>ضع العينة في مخفف متسلسل من حلول 1x PBS و 10٪ - و 20 ٪ - و 30 ٪ سكروز في 25 درجة مئوية حيث يتم نقل العينة إلى الحل التالي بعد 30 دقيقة من الحضانة. ملاحظة: يمكن تخزين العينة في محلول السكروز بنسبة 30٪ عند 4 درجات مئوية قبل المتابعة مع خطوة التضمين.</li>
		<li>الرطب تلميح ماصة مع محلول السكروز قبل وضع العينة (دون التراص لهم) في وسط العفن cryo وماصة من السائل الزائد. ملاحظة: يمكن أيضا استخدام ورقة التصفية لإزالة الحل الزائد. التبول تلميح ماصة مع محلول السكروز مهم لمنع EBs وNPCs من الالتصاق بجدران الطرف.</li>
		<li>إضافة بعناية درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) حل للقالب دون إعادة تعليق العينات وإزالة الفقاعات الزائدة مع ماصة.</li>
		<li>ضع القالب مع العينة على خلاط مختبر بسرعة منخفضة لإثارة العينة بشكل معتدل لمدة 15 دقيقة. وهذا يساعد على تسوية EBs و NPCs إلى أسفل إذا تم إعادة إنفاقها في حل OCT.</li>
		<li>تجميد العينة بسرعة عن طريق وضع القالب في النيتروجين السائل أو على الجليد الجاف. ملاحظة: يمكن تخزين العينات في ثلاجة -70 درجة مئوية قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.</li>
	</ol></li>
	<li>بكاء 
	<ol>
<li>تعيين cryostat لتهدئة إلى -20 إلى -18 درجة مئوية قبل نقل العينة إلى الصك.</li>
		<li>فصل كتلة أكتوبر المجمدة من القالب وتأمينه على حامل مع حل أكتوبر قليلا وضعت على سطح حامل.</li>
		<li>قم بمحاذاة كتلة OCT بحيث تكون EBs وNPCs الأقرب إلى النصل لضمان عدم فقدان العينة أثناء المقطع.</li>
		<li>بعناية القسم 10 ميكرومتر من كتلة وإيلاء اهتمام وثيق لشرائح التي تحتوي على العينة.</li>
		<li>ضع بسرعة شريحة OCT التي تحتوي على العينة على الشريحة الزجاجية التي تتضمن الأنسجة والسماح لشرائح OCT بتجفيف الهواء لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -70 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.</li>
	</ol></li>
	<li>الفلورة المناعية (IF) 
	<ol>
<li>كتلة أقسام أكتوبر أو غرف الثقافة التي تحتوي على الخلايا العصبية في 10٪ مصل الحمير العادية / 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>احتضان العينات في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 5٪ مصل الحمير العادي/0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.</li>
		<li>غسل العينات في 1x PBS/0.1٪ تريتون X-100 ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل غسل.</li>
		<li>احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 5٪ مصل الحمير العادي /0.05٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1x لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>غسل العينات في 1x PBS/0.1٪ تريتون X-100 ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل غسل ثم احتضان العينات في 1 ميكروغرام / مل DAPI.</li>
		<li>جبل العينات مع غطاء وبعض المتوسطة المتصاعدة والسماح لها لتجف.</li>
		<li>مراقبة العينات تحت المجهر الفلوري.</li>
	</ol></li>
	<li>تحليل الحمض النووي الريبي-seq 
	<ol>
<li>جمع الخلايا في مراحل مختلفة وأداء استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الخطوة 3.2).</li>
		<li>إعداد مكتبات cDNA، وإجراء تسلسل عميق وتحليل البيانات وفقا للبروتوكول الموصوف في وانغوآخرون.</li>
		<li>إجراء تحليل علم الأنتولوجيا الجينية (GO) باستخدام حزمة R، clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>قياس التدفق الخلوي 
	<ol>
<li>جمع ESCs باتباع الخطوات 1.6-1.7 وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط. جمع EBs و NPCs باتباع الخطوة 2.4 وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط.</li>
		<li>تصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية النايلون 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 15 مل.</li>
		<li>قياس إشارة GFP للعينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي (الذي يؤديه المرفق الأساسي للمؤسسة).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Kaufman, M. H., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).</li><li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains.">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li><li>Sugaya, K., Vaidya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases.">Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).</li><li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems.">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).</li><li>McKee, C., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+stem+cell+culture.">Advances and challenges in stem cell culture.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).</li><li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage.">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WDR68+is+essential+for+the+transcriptional+activation+of+the+PRC1-AUTS2+complex+and+neuronal+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).</li><li>Visan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+a+tool+to+assess+developmental+neurotoxicity+in+vitro.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro.</a> NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochemical So. 31, 45-49 (2003).</li><li>Park, Y. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro.</a> Development &amp; Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+leukemia+inhibitory+factor+for+establishing+and+maintaining+embryonic+stem+cells+in+mice.">Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).</li><li>Onishi, K., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIF+signaling+in+stem+cells+and+development.">LIF signaling in stem cells and development.</a> Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).</li><li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides.">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336, 688-690 (1988).</li><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ghimire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+naive,+primed+and+ground+state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells+originating+from+the+same+genetic+background.">Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Method+for+Forming+Embryoid+Body+from+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).</li><li>Wang, X., Yang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+(mES)+cells+using+the+hanging+drop+method.">In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).</li><li>Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Retinoic+Acid+in+the+Differentiation+of+Embryonal+Carcinoma+and+Embryonic+Stem+Cells.">Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells.</a> Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).</li><li>Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox1+marks+an+activated+neural+stem/progenitor+cell+in+the+hippocampus.">Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus.</a> Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+Re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Bahmad, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt/mTOR+pathway+in+cancer+stem/progenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma.">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li><li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings.">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li><li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة.

تم إنشاء طريقة التمايز العصبي للخلايا الجذعية الجنينية الماوس لعقود واستمر الباحثون في تعديل البروتوكولات السابقة أو إنشاء بروتوكولات جديدة لأغراض مختلفة7و10و11. استخدمنا سلسلة من المقايسات لتحليل شامل لكفاءة وتقدم مراحل التمايز من mESCs ?...

منذ اشتقاقها الأول من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الكيسية الماوسالنامية 1،2، وقد استخدمت الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESC) كأدوات قوية لدراسة الخلايا الجذعية التجديد الذاتي والتمايز3. وعلاوة على ذلك، فإن دراسة التمايز mESC يؤدي إلى فهم هائل للآليات الجزيئية التي قد تحسن الكفاءة والسلامة في العلاج القائم على الخلايا الجذعية في علاج أمراض مثل الاضطرابات العصبية4. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية، يوفر هذا النظام في المختبر العديد من المزايا بما في ذلك البساطة في الممارسة والتقييم، وانخفاض التكلفة في الحفاظ على خطوط الخلايا على النقيض من الحيوانات، وسهولة نسبية في التلاعب الجيني. ومع ذلك، فإن كفاءة وجودة أنواع الخلايا المتمايزة تتأثر في كثير من الأحيان بخطوط مختلفة من mESCs وكذلك طرق التفريق5و6. كما أن المقايسات التقليدية لتقييم كفاءة التمايز تعتمد على الفحص النوعي لجينات العلامات المختارة التي تفتقر إلى القوة، وبالتالي فهي تفشل في فهم التغيرات العالمية في التعبير الجيني.
هنا نهدف إلى استخدام بطارية من المقايسات لتقييم منهجي للتمايز العصبي. باستخدام كل من التحليلات التقليدية في المختبر على علامات مختارة ورنا-seq، ونحن إنشاء منصة لقياس كفاءة التمايز، فضلا عن التغيرات النسخية خلال هذه العملية. استنادا إلى بروتوكولالمنشأةسابقا 7 , أنشأنا الأجسام الجنينية (EBs) من خلال تقنية إسقاط شنقا, تليها التعريفي باستخدام كمية فوقفيزيولوجية من حمض الريتينويك (RA) لتوليد خلايا السلف العصبية (NPCs), التي تم تمييزها في وقت لاحق إلى الخلايا العصبية مع وسيط التعريفي العصبي. لدراسة كفاءة التمايز ، بالإضافة إلى المقايسات التقليدية RT-qPCR والمناعة (IF) ، قمنا بإجراء قياس الخلايا الحمض النووي الريبي والتدفق. وتوفر هذه التحليلات قياسا شاملا لتطور التمايز الخاص بالمرحلة.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>40-&amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>C298-500</td><td>Fisher Chemical</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR Analytical</td><td>Diluted in de-ionized water</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Collected from MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#039;</td></tr><tr><td>MEM Non-essential amino acids</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#039;</td></tr><tr><td>mNes primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mNeuroD1 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>mOct4 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#039;</td></tr><tr><td>mPax6 primers</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5&#039;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#039;&lt;br/&gt; 5&#039;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#039;</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin primary antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td></tr><tr><td>Neural basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament primary antibody</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prepared in de-ionized water</td></tr><tr><td>- Potassium chloride</td><td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium chloride</td><td>BP358-10</td><td>Fisher Bioreagents</td><td></td></tr><tr><td>- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>Random hexamer primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>84097</td><td>Diluted in 1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure Isolation Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لزراعة وتمييج الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الأنساب العصبية، تليها سلسلة من المقايسات لتوصيف الخلايا المتمايزة. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية للفأرة E14 لتشكيل أجسام جنينية من خلال طريقة الإسقاط المعلق ، ثم تم حثها على التفريق إلى خلايا السلف العصبي بواسطة حمض الريتينويك ، وتم تمييزها أخيرا إلى خلايا عصبية. كشفت تجارب النسخ العكسي الكمي البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) وتجارب immunofluorescence أن السلف العصبي والخلايا العصبية تظهر علامات المقابلة (نستين للسلف العصبية والتشخيص العصبي للخلايا العصبية) في اليوم 8 و 12 بعد التمايز، على التوالي. أظهرت تجارب قياس التدفق الخلوي على خط E14 التي تعبر عن مراسل GFP مدفوع من قبل Sox1 أن حوالي 60٪ من الخلايا في اليوم 8 إيجابية GFP ، مما يشير إلى التمايز الناجح لخلايا السلف العصبي في هذه المرحلة. وأخيرا، استخدم تحليل الحمض النووي الريبي-seq لتحليل التغيرات العالمية في النسخ. هذه الأساليب مفيدة لتحليل مشاركة جينات ومسارات محددة في تنظيم انتقال هوية الخلية أثناء التمايز العصبي.

كتمثيل لطريقتنا ، قمنا بإجراء تجربة تمايز EB و NPC والخلايا العصبية على خلايا E14. تم استزراع خلايا E14 على γ المشععة MEFs(الشكل 1A)حتى تم تخفيف مجموعة MEF المشععة γ. أكدنا pluripotency من الخلايا E14 من خلال أداء الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب)تلطيخ (الشكل 1B)وRT-qPCR في وقت لاحق (انظر أ...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.

التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.8K Views.  Penn State Hershey Cancer Institute. نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.

Video: Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

تحليل الناجم عن حمض الريتينويك العصبية تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الهيئات مضغي اثنين وثلاثة الأبعاد

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Neuroscience

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Biology

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Neural Progenitors from Mouse Embryonic Stem Cells by the Hanging Drop Method

Source: Hanafiah, A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61446">Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video demonstrates the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) to embryoid bodies (EBs) by the hanging drop method. Upon suspending the mESCs in hanging drops and incubating, the cells aggregate to form EBs, which are further differentiated into neuronal progenitor cells (NPCs) using a differentiation medium supplemented with retinoic acid (RA).

توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر بطريقة القطرة المعلقة

1. mESC culture

	Coat a 10 cm tissue-culture-treated plate with 0.1% gelatin and allow the gelatin to set for at least 15&#8211;30 min before aspirating ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Differentiating Human Embryonic Stem Cells into Neural Progenitors

Source: Jeon, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60571">Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates the differentiation of human embryonic stem cells, or hESCs, directly into neural progenitor cells without using feeder cells or any intermediate steps. The selective inhibition of bone morphogenetic protein or BMP and transforming growth factor-beta, or TGF-&#946;, signaling pathways leads to hESCs differentiation into neural progenitor cells, or NPCs.

تفريق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى أسلاف عصبية

1. Preparation of human embryonic stem cells (hESC)-qualified Basement Membrane Matrix-coated Plates

	Slowly thaw the hESC-qualified basement membrane ...

Advanced Neuronal Models

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

تقنية لتوليد الخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Source: Mao, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
The video showcased a cell culture method for differentiating neural progenitor cells into neurons. By incubating cells in a nutrient-rich medium supplemented with growth factors, the progenitor cells matured into neurons with developed axons and dendrites. A stabilizing agent ensured cell viability and protected against oxidative damage throughout the differentiation process.