وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمعهد الصحة الوطني للحساسية والأمراض المعدية (IAA عدد AOD12058-0001-0000) ووكالة الدفاع لتقليص التهديد - علوم المشتركة ومكتب التكنولوجيا، الطبية S &amp; T قسم (أرقام المنح CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 وCBM.THRTOX.01.RC.014). تم إجراء هذا البحث أثناء احتجازهم PB تهديد الدفاع للحد من جائزة الوكالة الوطنية للمجلس البحوث زمالة البحوث وعقد KH جائزة المجلس الوطني للبحوث زمالة أبحاث. نشكر أنجيلا آدكنز وKaylie Tuznik (USAMRICD) للحصول على المساعدة التقنية؛ وسيندي Kronman (USAMRICD) للحصول على المساعدة التحريرية. الآراء الواردة في هذا المقال هي آراء أصحابها ولا تعكس السياسة الرسمية لوزارة الجيش، وزارة الدفاع، أو الحكومة الأمريكية.

1. التكيف من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتغذية خالية من خلية تعليق الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجالس الاقتصادية والاجتماعية ذوبان الجليد عند 37 درجة مئوية حتى تبقى شظية من الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة P1000، ونقل بلطف 1-2،5 × 10 6 فصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية إلى طبق المعالجة ثقافة غير الأنسجة التي تحتوي على 10 مل من قبل تحسنت المتوسطة ESC. احتضان في ترطيب حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 20 ساعة، وغسل الخلايا عن طريق نقل بلطف ثقافة تعليق إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام 10 مل الماصة المصلية. بيليه المجالس الاقتصادية والاجتماعية لمدة 3 دقائق في 200 × ز. أثناء الدوران، إضافة 10 مل من الطازجة المتوسطة ESC إلى طبق المنخفض التصاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، مع الحرص على تجنب طرد بيليه الخلية، وإضافة 1 مل المتوسطة ESC الطازجة إلى الخلية بيليه. نقل الخلايا إلى طبق البكتيري باستخدام الماصة P1000 والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الخلايا يوميا حتى تصبح المجاميع مرئية للعين المجردة (عادة من 4 - 8 أيام (د)، وسوف يكون الركام 0.2- 0.5 ملم). إذا المجاميع ليست واضحة بعد 4 د، كرر الخطوة 1.3. مرة واحدة المجاميع مرئية، فصل والحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية كما هو موضح في القسم 2. </li></ol> 2. ESC الركض والصيانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ESC المجاميع إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام العقيمة 10 مل الماصة والسماح المجاميع ليستقر على بيليه الصغير (عادة 3-5 دقيقة). نضح طاف، والحرص على تجنب تعطيل بيليه الخلية، وغسل الركام مع 5 مل PBS. وعلى الرغم من خطورة الاستيطان ويوصى، وخلايا بيليه بدلا من ذلك في 100 x ج لمدة 2.5 دقيقة بدلا من ذلك لتوفير الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS وإضافة 500 ميكرولتر التربسين. احتضان المجاميع في التربسين لمدة 3 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إضافة 500 ميكرولتر المتوسطة ESC لتخفيف التربسين وبلطف يسحن 10 مرات مع الماصة P1000 لتفريق المجاميع. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه فصل الخلايا لمدة 3 دقائق في 200 x ج و resuspend الخلايا إلى تركيز النهائي من 1.07 × 10 خلية / مل في ESC المتوسطة. نقل 150 ميكرولتر (1.5 × 10 6 خلايا) إلى 10 مل من الطازجة المتوسطة ESC في 10 سم طبق البكتيري والعودة إلى الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 48 ساعة. يمكن أن تكون متباينة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الزائدة، cryopreserved عند 1 - 5 × 10 6 خلية / مل في 90٪ ESC المتوسطة تستكمل مع 10٪ DMSO، أو التخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور المجاميع كل 48 ساعة. سوف المجاميع جاهزة للمرور تكون مرئية بشكل واضح، بأقطار تزيد على 0.5 مم. يتم إنجاز ذوبان وثقافة، خلايا تكييفها تعليق cryopreserved في الخطوات 1،2-1،4: ملاحظة. سوف المجاميع يكون جاهزا للالركض داخل 48-72 ساعة. </li></ol> 3. العصبية التمايز ملاحظة: إجراء الخطوات 3،1-3،5 قبل الظهر وخطوة 3.7 بعد الظهر. ويقدم لمحة عامة عن الإجراءات التمايز في الشكل 1A. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية كما هو الحال في الخطوات 2،1-2،5. نقل 350 ميكرولتر (3.5 × 10 6) من فصلالمجالس الاقتصادية والاجتماعية د إلى 10 سم طبق مرفق منخفضة تحتوي على 25 مل التمايز المتوسطة. وضع على شاكر المداري المقرر أن 30 - 45 دورة في الدقيقة داخل حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. هذا هو اليوم الأول من التمايز، يوم يطلق عليه في المختبر (DIV) -8. ملاحظة: إن استخدام طبق مرفق منخفضة للغاية يزيد من تكلفة الطريقة، ولكن تنتج عوائد أكبر قليلا من أطباق بتري البكتيرية منذ المجاميع يمكن أن تلتزم في بعض الأحيان إلى أطباق بتري. إذا فضلت الأحجام صحن مختلفة، وأحجام المتوسطة وأعداد الخلايا يمكن زيادتها وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة (DIV -6)، استخدام 25 مل الماصة لنقل المجاميع خلية التفريق إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة على الفور جديدة 25 مل من التمايز المتوسط ​​إلى طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح المجاميع ليستقر على 2-5 دقيقة، مما ينتج عنه بيليه واضحة على أن يكون من 1 - 2 مم عميق. تجاهل الخلايا واحد أو المجاميع الصغيرة المتبقية في تعليق. نضح بعناية المتوسطة ونقل مليرة لبنانية بيليه إلى طبق بتري باستخدام P1000. وضع على دوار شاكر في حاضنة زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV -4 كرر الخطوة 3.2. سوف يكون بيليه 2-4 ملم عميق. استبدال 30 مل التمايز المتوسطة تستكمل مع 6 ميكرومتر جميع العابر حمض الريتينويك (RA) إلى طبق بتري. العودة إلى دوار شاكر في حاضنة زراعة الأنسجة ل48 ساعة إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV -2 كرر الخطوة 3.3. سوف بيليه أن تكون من 4 - 8 ملم عميقة في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV -1، وإعداد الأسطح الطلاء كما هو الحال في القسم 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV 0، ذوبان الجليد 5 مل من قبل aliquoted والمجمدة مجلس الشعب trypsinization المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة من 5 - 10 دقيقة ومكان في نسيج الثقافة هود. باستخدام الماصة 25 مل، ونقل التفريق المجاميع إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. سماح المجاميع ليستقر والمتوسطة نضح بعناية. غسل بيليه مرتين مع 10 مل PBS، والسماح للمجاميع ليستقر بين يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل PBS الثاني، إضافة 5 مل من مجلس الشعب trypsinization المتوسطة لبيليه واحتضان عند 376؛ C لمدة 5 دقائق. نفض الغبار بلطف الأنبوب بعد 2.5 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من 0.1٪ فول الصويا مثبط التربسين (STI) لإبطال نشاط التربسين وتخلط بواسطة قلب. يسحن بلطف 10-15 مرات مع الماصة 10 مل المصلية حتى يتم إنتاج تعليق خلية متجانسة نسبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ببطء تعليق الخلية إلى مصفاة الخلية 40 ميكرون أو 70 ميكرون وضعت في الجزء العلوي من 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. مرة واحدة وقد تم تصفيتها كل تعليق، إضافة 1 مل من N2 المتوسطة لغسل الخلايا المتبقية من خلال تصفية وبيليه تعليق خلية فصلها لمدة 6 دقائق في 200 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من دون إزعاج بيليه. غسل الخلايا مرتين مع 10 مل المتوسطة N2، التكوير خلايا لمدة 5 دقائق في 200 x ج والطحن بين يغسل مع P1000. قبل غسل الثاني، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في N2 المتوسطة في 1 × 10 7 خلايا لكل ESNs مل و لوحة في مناطق ذات كثافة خلية من 150،000 - 200،000 خلية / سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بلات حديثاإد ESNs لترطيب حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 والحفاظ كما في القسم 5. </li></ol> 4. إعداد الثقافة السطوح لتصفيح العصبية السلائف في DIV 0 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أطباق الأنسجة المعالجة الثقافة لا يقل عن 1 يوم قبل الطلاء. إضافة polyethyleneimine كافية (PEI، و 25 ميكروغرام / مل في H العقيمة 2 O) أو بولي-D-ليسين (PDL؛ 100 ميكروغرام / مل في H العقيمة 2 O) لتغطية علاج الأنسجة ثقافة الأطباق البلاستيكية واحتضان O / N في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صباح الطلاء، وغسل الأطباق مرتين مع المزدوج المقطر H 2 O ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. بعد غسل النهائي، إضافة يكفي المتوسطة N2 لتغطية الطبق (على سبيل المثال، 1 مل لكل بئر من صحن 12-جيدا أو 4 مل لكل 6 سم طبق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 18 ملم coverslips الزجاج على الأقل يوم واحد قبل الطلاء الخلايا العصبية. coverslips نظيفة عن طريق لمدة 4 دقائق لتنظيف البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل على الفور coverslips تنظيفها إلى بارافيلم غسلها الإيثانول في الجزء السفلي منطبق العقيمة كبير وإضافة 400 ميكرولتر من PEI أو PDL الحل، الذي أعد كما في الخطوة 4.1. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الصباح، وغسل coverslips ثلاث مرات بالماء وإضافة 5 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني لمدة 1 - 3 ساعة على 37 درجة مئوية. قبل النأي الخلايا العصبية، نضح laminin وعلى الفور نقل ساترة لبئر من صحن 12-جيدا تحتوي على 1 مل من المتوسط ​​مجلس الشعب، ويجري التأكد من الحفاظ على الجانب المعالج مواجهة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر أطباق وcoverslips عند 37 درجة مئوية حتى الشخصيات مستعدة لوحة. </li></ol> 5. الحفاظ على الخلايا العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV 1، نضح المتوسطة واستبدالها مع N2 مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV 2 و 4، نضح المتوسطة واستبدالها مع الثقافة B27 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV 8، نضح المتوسطة واستبدالها مع الثقافة B27 المتوسطة التي تحتوي على مثبطات الإنقسامية للقضاء على تلوث الخلايا غير العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في DIV 12، استبدال ثقافة B27 المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تقم بإزالة DIV12 + ESNs من 5٪ CO 2 حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 6. تثبيط تقاس من متشابك بالإرسال (ميست) الفحص لقياس التيارات مصغرة مثير بعد متشابك تنبيه: أعصاب المطثية هي أكثر المواد السامة المعروفة، مع LD الإنسان يقدر بنحو 50 قيم منخفضة تصل إلى 0،1-1 نانوغرام / كغ. الحصول على الموافقات اللازمة قبل استخدام هذه السموم واستخدام الاحتياطات المناسبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع بعناية بونت / A إلى 100X التركيز النهائي المطلوب في ESN مستنبت ودافئة إلى 37 درجة مئوية. إضافة حجم مناسب من السم لDIV 21 + ESN الثقافات، دوامة الطبق الثقافة، والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان سيتم تحليل خلايا أكثر من 4 ساعات بعد التسمم، إضافة السم إلى الطبق ودوامة دون إزالة من 5٪ CO 2، مثل مباشرة في الحاضنة أو في ثابت CO 2 غرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة زمنية مناسبة، aspiraالشركة المصرية للاتصالات ESN مستنبت ويغسل مرتين مع العازلة تسجيل خارج الخلية (إرب). إضافة 4 مل من ERB تستكمل مع 5.0 ميكرومتر سم الأسماك الرباعية الأسنان و 10 ميكرومتر bicuculline، وعرقلة امكانات العمل واستعداء GABA A نشاط مستقبلات، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الطبق إلى الكهربية تلاعب. مطلوب لا نضح ولا التحكم في درجة الحرارة للمقايسة ميست. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الزجاج البورسليكات باستخدام مجتذب ممص مكروى لإنتاج ماصة تسجيل مع 5-10 mΩ المقاومة وملء مع العازلة تسجيل داخل الخلايا. تراجع بلطف شغل ماصة تسجيل في siliconizing كاشف قبل التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة مليئة بالهواء، وتوفير الضغط الايجابي كما هو خفض تسجيل ماصة في ERB. بعد الهبوط بلطف تسجيل ماصة على سوما من الخلايا العصبية ليتم تسجيلها، وإزالة الضغط الايجابي وتشكيل gigaseal. تقليل الجهد لعقد -70 بالسيارات. تطبيق بعناية الضغط السلبي لكسر في تكوين خلية كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى المشبك الحالي لرصد وتسجيل يستريح غشاء المحتملة. دون تعديل لإمكانات تقاطع السائلة، فإن إمكانات غشاء الراحة ما بين -67 إلى -82 بالسيارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء المستمر -70 بالسيارات تسجيل الجهد المشبك ل4-5 دقيقة للكشف عن مصغرة مثير التيارات ما بعد المشبكية (mEPSCs). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل 4 دقائق من البيانات المسجلة للكشف mEPSC باستخدام برنامج الكشف عن ارتفاع مع الإعدادات التالية: عتبة، 5؛ فترة للبحث كحد أقصى المحلي، 10،000 μsec. الوقت قبل ذروة لخط الأساس، 5،000 μsec. فترة للبحث وقت الاضمحلال، 20،000 μsec. جزء من الذروة إلى إيجاد الوقت الاضمحلال، 0.37، فترة إلى متوسط ​​خط الأساس، 1،000 μsec. العتبة منطقة، 20؛ عدد من النقاط لمتوسط ​​الذروة، 1؛ اتجاه الذروة، سلبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وحفظ المعلومات عن الأحداث الكشف عنها. تقسيم عدد من الأحداث الكشف عنها في 4 دقائق و 240 لتحديد وتيرة mEPSC في هرتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ترددات mEPSC عن 8-12 تابعسيادة القانون والأمن و8-12 عينات بونت المعاملة لكل حالة التعرض. تحليل التردد ضد السن و-الكثير مطابقة الضوابط. تحديد الدلالة الإحصائية لل٪ تثبيط النشاط متشابك باستخدام باتجاه واحد ANOVA الاختبار واختبار ما بعد خاص-Dunnett ل. </li></ol>

<ol>
	<li>Simpson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+steps+in+botulinum+toxin+action.">Identification of the major steps in botulinum toxin action.</a> Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).</li><li>Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Characterization+of+a+Novel+Botulinum+Neurotoxin+Type+H+Gene.">Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene.</a> The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).</li><li>Singh, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+neurotoxin+structure,+engineering,+and+novel+cellular+trafficking+and+targeting.">Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting.</a> Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).</li><li>Larsen, J. C. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Army+botulinum+neurotoxin+(BoNT)+medical+therapeutics+research+program:+past+accomplishments+and+future+directions.">Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions.</a> Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).</li><li>McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+neurons+are+a+novel,+highly+sensitive+tissue+culture+platform+for+botulinum+research.">Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research.</a> Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).</li><li>Eubanks, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+and+in+vivo+disconnect+uncovered+through+high-throughput+identification+of+botulinum+neurotoxin+A+antagonists.">An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).</li><li>Pellett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+quantitative+detection+of+botulinum+neurotoxin+in+neurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).</li><li>Mesngon, M., McNutt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Latrotoxin+Rescues+SNAP-25+from+BoNT/A-Mediated+Proteolysis+in+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neurons.">Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons.</a> Toxins. 3, 489-503 (2011).</li><li>Kiris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Whitemarsh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+human+neurons+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+highly+sensitive+botulinum+neurotoxin+detection.">Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection.</a> Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).</li><li>Hubbard, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+yield+derivation+of+enriched+glutamatergic+neurons+from+suspension-cultured+mouse+ESCs+for+neurotoxicology+research.">High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research.</a> BMC Neurosci. 13, 127 (2012).</li><li>Brook, F. A., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+efficient+derivation+of+embryonic+stem+cells+in+the+mouse.">The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).</li><li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines:+formation+of+visceral+yolk+sac,+blood+islands+and+myocardium.">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).</li><li>Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+RNA+sequencing+of+the+deep+transcriptome+during+neurogenesis+of+cortical+glutamatergic+neurons+from+murine+ESCs.">Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs.</a> F1000Research. 2 (35), (2013).</li><li>Gut, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+application+of+stem+cell-derived+neurons+to+evaluate+the+time-+and+dose-dependent+progression+of+excitotoxic+injury.">Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury.</a> PLoS One. 8, e64423 (2013).</li><li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture.">The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).</li><li>Capek, P., Dickerson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+the+deadliest+toxin:+technologies+for+botulinum+neurotoxin+detection.">Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection.</a> Toxins. 2, 24-53 (2010).</li><li>Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+protein+interactions+in+vivo:+evidence+from+botulinum+A,+C,+D+and+E+action+at+frog+neuromuscular+junction.">Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction.</a> The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).</li><li>Baskaran, P., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+and+chronic+effects+of+botulinum+neurotoxin+a+on+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction.</a> Muscle &amp; Nerve. 50, 206-215 (2014).</li></ol>

The U.S. Government has filed two international patent applications that incorporate methods described in this article: PCT/US2014/22042, titled &#8220;Methods of detecting neurotoxin using synaptic activity&#8221;; and PCT/US13/40641, titled &#8220;Toxin detection using stem cell-derived neurons.&#8221;

المعيار الذهبي الحالي للكشف عن CNT، وتحديد النمط المصلي والكميات هو MLA. وMLA يستجوب مجموعة كاملة من المضيف: انشقاق تفاعلات السم اللازمة لالتسمم تحدث في الجسم الحي (على سبيل المثال، السم ملزمة لمستقبلات سطح الخلية، واستيعاب للمجمع السم مستقبلات، LC النبات إلى السيتوبلازم، LC بوساطة من الركيزة و تثبيط العصبي متشابك) 18. ومع ذلك، على الرغم من أن MLA تقدم نموذجا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتسمم، فمن موارد كثيفة، يمكن مرتبك من الملوثات وينطوي على أعداد كبيرة من الفئران مع الموت باعتباره نقطة النهاية. بدلا من ذلك، المقايسات خلية القاعدة للكشف بونت والكميات اقتصرت على الثقافات الخلايا العصبية الأولية، والتي تتطلب أيضا استخدام الحيواني، أو خطوط الخلايا العصبية، التي لا تشكل نقاط الاشتباك العصبي وتظهر عادة سيئة الحساسية للأعصاب 8. وحتى الآن، فإن معظم قياسات سكر في الوقد اعتمدت منصات خلية القاعدة جنوب شرقي على الكشف عن انشقاق بروتين من SNAP-25، VAMP1 / 2 أو syntaxin-1 11. وهذه مشكلة لأنه قد ثبت أن بروتين كمين الانقسام أن تكون مرتبطة غير خطي مع تثبيط متشابك في الجسم الحي، وبالتالي قد لا تمثل بدقة التسمم أو الشفاء من التسمم 19،20. ومن شأن نظام النموذج القائم على خلية مثالية للكشف عن CNT (ط) أن يكون القائم على الخلايا العصبية. (ب) أن يقترن synaptically مع الاستجابات الكهربائية neurotypic. (ج) تكون حساسة للغاية لجميع الأنماط المصلية CNT أو فرعية. و (د) عرض التدرجية، والإنتاجية وفحص الأوقات التي تعادل أو المحسنة خلال MLA، بتكلفة أقل، ودون الحاجة إلى استخدام الحيوانات. لتلبية هذه الاحتياجات، قمنا بتطوير طريقة لإنتاج كميات كبيرة من التخصيب والثقافات شبكية لglutamatergic والخلايا العصبية GABAergic من المتاحة تجاريا خطوط الماوس ESC. نحن بعد ذلك وضعت الفحص ميست لتحديدتثبيط متشابك ردا على التسمم مع خيمة وبونت / A- / G. بينما يمكن إجراء الفحص ميست على أية مجموعة من السكان الخلايا العصبية نشطة synaptically (على سبيل المثال، الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ)، حاليا ESNs هي فقط في المختبر المستمدة نموذج الخلايا العصبية التي تطور بتكاثر السلوكيات شبكة الناشئة وبالتالي فهو مناسب للمقايسة ميست. تنتج كميات كافية من الخلايا العصبية من النسب المحددة للدراسات CNT المطلوبة العديد من الابتكارات في الثقافة ESC والتمايز. أولا، من خلال تحديد للزراعة والمجالس الاقتصادية والاجتماعية التي يمكن البقاء على قيد الحياة تعليق-التكيف، فإننا التخلص من احتمال تلوث بواسطة الخلايا المغذية، والحاجة إلى تنقية الخلايا المغذية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية في بداية التمايز. على الرغم من أن الآليات الجزيئية الكامنة وراء تعليق-التكيف غير معروفة، لا تزال المجالس الاقتصادية والاجتماعية-تكييفها تعليق النشطة ميتوتيكلي والاحتفاظ بها Oct3 / 4 التعبير وستظل العصبية. باستخدام هذه الطريقة، ~ 1.5 × 10 7 Eوعادة ما يتم استردادها اللجان الدائمة كل ممر. ثانيا، تم زيادة إنتاج الشخصيات ~ 300٪ من خلال دمج الإثارة الميكانيكية لمنع التكتل خلال التمايز، وزيادة ظاهريا الوصول إلى المغذيات الداخلية للركام. وخلال هذه العملية، وجدنا أن المصل المستخدمة للثقافة ESC وتمايز الخلايا العصبية هو العنصر الأكثر أهمية في الحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية العصبية. للحصول على أفضل نجاح، ونحن نوصي تعليق التكيف خلايا ES لبعضها الكثير من المصل وتخزين المصل عند -20 درجة مئوية إلى دعم الثقافة ESC وتمايز الخلايا العصبية من خلال تاريخ انتهاء الصلاحية. كما هو الحال مع معظم الثقافات النشطة synaptically، DIV 14 + ESNs هي عرضة للتغيرات مفاجئة في درجة الحموضة، وحتى التعرض قصيرة إلى الغلاف الجوي CO 2 يمكن تركيزات يؤدي إلى العصبية خلال 24 ساعة. للتجارب التي تتطلب العلاج الثقافات تليها حضانات O / N أو أكثر، يجب أن تعامل الخلايا العصبية مباشرة دائم طن الحاضنة أو نقلها إلى ثابت CO 2 غرفة قبل التجريب. مجموعة متنوعة من التقنيات وأكدت تكوين الخلايا العصبية والخلايا العصبية النضج، بما في ذلك المحكمة الجنائية الدولية، النسخي وخلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية. وكانت التغيرات الزمانية في التعبير الجيني والخلايا العصبية التشكل بما يتفق مع التقدم السريع من خلال مراحل تطور الخلايا العصبية، وDIV 16، عرضت ESNs مثير والمثبطة تيارات ما بعد متشابك مصغرة مع شبكة الناشئة السلوكيات 16. اقترح دليل على النشاط متشابك أن ESNs قد تكرار pathophysiologies المسؤولة عن المظاهر السريرية للالتسمم الغذائي والكزاز. وهذا ما أكده باستخدام ميست لإظهار أن التسمم مع بونت / A- / G أو خيمة ضعاف الترددات mEPSC التي كتبها&gt; 95٪ مقارنة مع الخلايا العصبية المعالجة المركبة أو غير المعالجة. وأشارت قياسات لحساسية ميست لبونت / أ أ المثبطة متوسطتركيز (IC 50) من 0.013 PM (ما يعادل 0.5 الماوس وحدة قاتلة / مل) وحد من الكشف أدناه 0.005 م، قياس في 20 ساعة بعد إضافة حمام. وبناء على هذه القيم، ميست هو تقريبا ضعف حساسة مثل و2-4 مرات أسرع من MLA و 30 أضعاف أكثر حساسية من الكشف القائم على طخة مناعية من المشقوق SNAP-25. بشكل جماعي، وهذه البيانات تشير إلى أن السكان بالشبكة من الخلايا العصبية الجذعية المشتقة من خلية تقدم، نموذج قائم على خلية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للتسمم. جنبا إلى جنب مع أساليب محسنة لاستخلاص الثقافات ESN الشبكية من المجالس الاقتصادية والاجتماعية-تكييفها تعليق، يجب استخدام ميست تقلل من الحاجة إلى التجارب على الحيوانات والمساوئ المرتبطة بها والتكاليف والمخاوف الأخلاقية للMLA في الوقت الذي توفر مقياسا أكثر سرعة، حساس ونوعي ل التسمم. وعلى الرغم من خلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية هي طريقة منخفضة الإنتاجية لتحديد وجود أعصاب النشطة، وهو يقدم القرار، وجمعية مهندسي البترولإد الذي لا يمكن تحقيقه باستخدام الطرق الجزيئية. كما توفر هذه النتائج دليل على أن تطبيق الأساليب التي تعتمد على النشاط لتقييم النشاط متشابك وربما تمكن سلوك الشبكة الكشف السريع ومحددة من أعصاب. ان مثل هذه النهج إنتاجية أعلى جعل الدراسات الميكانيكية، وفحص العلاجي أو المقايسات التشخيصية الممكنة لمجموعة واسعة من وكلاء neuromodulatory، بما في ذلك الأنابيب النانوية الكربونية.

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو تقييم وظيفيا النشاط متشابك في الثقافات شبكات الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية تتعرض لأعصاب المطثية. وهذا هو أول مظاهرة من نموذج مستمد في المختبر أن يعيد ظيفيا pathophysiologies المسؤولة عن المظاهر السريرية للالتسمم الغذائي ويؤكد ESNs كنموذج مناسبة للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية، وفحص العلاجي والدراسات الميكانيكية. BoNTs للأعصاب البكتيرية القاتلة للغاية التي تنتجها أعضاء المطثيات. بما في ذلك اقترح مؤخرا بونت / H، وقد وصفت ثمانية أنماط مصلية بونت متميزة مستضديا (/ A- / H) 1،2. يتم التعبير عن كل الأنماط المصلية إلى 150 كيلو دالتون الببتيدات التي هي في مرحلة ما بعد translationally رصدت لإنتاج dichain تتكون من 100 كيلو دالتون السلسلة الثقيلة (HC) و 50 كيلو دالتون ضوء سلسلة (LC) ويربطها به السندات ثاني كبريتيد 3. وHC يتوسط ملزم لمستقبلات قبل المشبكي والأنف والحنجرةراي من السم في الخلايا العصبية عن طريق الإلتقام متشابك. أثناء معالجة endosomal، وHC يخضع الهيكلية إعادة تنظيم لتشكيل المسام في الغشاء حويصلة، وتسهيل النبات من LC في العصارة الخلوية قبل المشبكي. وLC ثم يستهدف تحديدا ويشق للذوبان N-حساسة -ethylmaleimide الانصهار مرفق البروتين مستقبلات (كمين) البروتينات في المقصورة قبل المشبكي: SNAP-25 (بونت / A، / C، / E)، VAMP2 (بونت / B، / D، / F، / G) أو syntaxin (بونت / C) 1. انشقاق أي من هذه البروتينات كمين يمنع الجمعية من الآلات إيماس متشابك، وبالتالي عرقلة الافراج عن الناقلات العصبية. هذا المزيج من استهداف الخلايا العصبية كفاءة وتوطين قبل المشبكي يجعل BoNTs السموم أقوى معروفة، بجرعات قاتلة الإنسان المقدرة منخفضة تصل إلى 0،1-1 نانوغرام / كغ 1. فحوصات الكيمياء الحيوية يمكن استخدامها للكشف عن وجود أو نشاط CNT خطابات الاعتماد مع حساسية عالية. ومع ذلك، فشلت هذه الأساليب إلى interrogate قدرة السم لربط، أدخل، وتفعيل وظيفة داخل الخلايا العصبية، وبالتالي هي التدابير غير المباشرة وربما مضللة من وجود السم النشط. في المقابل، المقايسات الفنية للتسمم مثل فحص الماوس الفتك (MLA) تقييم شامل لقدرة الأنابيب النانوية الكربونية للتفاوض جميع مراحل امتصاص وتفعيل بنجاح، وتوفير تقييمات أكثر ذات الصلة ومحددة من النشاط السم. في حين أن MLA هو الذهب مستوى الكشف بونت، وهو الأسلوب في الجسم الحي الذي يستخدم الموت باعتبارها نقطة نهاية وبالتالي لديه فائدة محدودة كمنصة البحث. لقد عانى محاولات لتطوير النماذج القائمة على خلية من CNT التسمم مناسبة للدراسات الميكانيكية والفحص العلاجي أيضا قيودا كبيرة. في حين الثقافات الخلايا العصبية الأولية توفر درجة عالية من الأهمية الفسيولوجية، معقد استخدامها من قبل عدد من العوامل، بما في ذلك تكاليف الموارد عالية، والعائد المنخفض نسبيا، وجود عدة الفرعية العصبيةأنواع والرقابة التنظيمية والإدارية واسعة تشارك مع استخدام الحيواني. كبديل للالخلايا العصبية الأولية، استخدمت خطوط الخلايا العصبية (التي يمكن أن يتسبب في اعتماد العصبية التي تشبه الخلايا الخصائص التي كتبها التحفيز الكيميائي) مثل neuroblastomas والخلايا أليفة الكروم الكظرية كنماذج في المختبر من التسمم. وبما أن هذه الخلايا هي مثقف بشكل مستمر قبل الاستقراء، فهي تدرجية عالية، وبالتالي مناسبة تماما للنهج المعتدل الإنتاجية. ومع ذلك، أهميتها مشكوك منذ الظواهر التي يسببها غير متجانسة عادة، هي سيئة حساسة لتشارك المركز الوطني وتفشل في معرض السلوكيات العصبية الحرجة، بما في ذلك عدم القدرة على تشكيل المقصورات قبل وبعد متشابك أن التجمع في نقاط الاشتباك العصبي يعمل 4. في غياب المقصورات قبل المشبكي سليمة من الناحية الفسيولوجية، ومجموعة كاملة من السم: التفاعلات العصبية لا يمكن تكرارها والقياسات وبالتالي الوظيفية للتسمم وليس من الممكن 5. لار من المستغرب، ومحاولات لإجراء دراسات الآلية أو فحص المخدرات للBoNTs باستخدام خطوط الخلايا العصبية التي يسببها أسفرت عن النتائج التي تتعارض مع في الجسم الحي والدراسات الخلايا العصبية الابتدائية 6. وقد اقترح التي تنبع قد توفر الجهاز العصبي المركزي (CNS) الخلايا العصبية المشتقة من خلية منصة تستند خلية الجيل المقبل للبحث بونت الذي يجمع بين أهمية الخلايا العصبية الأولية مع مرونة خطوط خلايا مستنبتة 7-10. على وجه الخصوص، تم العثور على الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الماوس (ESNs) أن تكون حساسة للغاية لجرعات الفسيولوجية للبونت / A- / G وتكرار كثير في استجابات الجسم الحي إلى التسمم، بما في ذلك persistences التفاضلي، محسنة النشاط التسمم، والنمط المصلي potencies -specific 5،8،11. وتشير هذه السلوكيات التي في آليات الجسم الحي من بونت امتصاص وتجهيز والاتجار والنشاط يتم حفظها في ESNs. ومع ذلك، وتثبيط النشاط. متشابكذ هو مظهر من مظاهر توقيع التسمم الغذائي، وبالتالي يدل على فقدان النشاط متشابك التالية التسمم عن طريق الأنابيب النانوية الكربونية من الضروري قبل الختامية التي ESNs هي مناسبة في اشتقاق نموذج قائم على خلية المختبر للدراسات CNT. لقياس آثار التسمم مع الأنابيب النانوية الكربونية على النشاط متشابك، تم استخدام خلية كاملة التصحيح، المشبك الكهربية لقياس التيارات الأحادي المشبك في المعالجة المركبة أو CNT المعاملة DIV 21 + ESNs. وجدنا أن التسمم من ESNs مع بونت / A- / G أو خيمة تسبب فقدان&gt; 95٪ من النشاط متشابك في غضون 20 ساعة في جميع الحالات. بإجراء مزيد من توصيف 20 ساعة بعد التسمم مع بونت / A كشفت عن وجود تأثير تعتمد على الجرعة على النشاط متشابك، مع الحد من الكشف أدناه 0.005 PM وقيمة IC 50 من 0.013 PM. وتشير هذه النتائج إلى أن حساسية والإطار الزمني للكشف الكهربية من التسمم وتحسنت بشكل كبير خلال مقارنة القائم على طخة مناعية آناlyses من SNAP-25 الانقسام والحية المقايسات الماوس الفتك، مما يدل على أن القياسات الوظيفية للتسمم في الثقافات الخلايا العصبية نشطة synaptically قد تسهل طرق أكثر حساسية ومحددة وسريعة لتوصيف الاستجابة الخلوية لبونت.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. ESC and ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC culture medium 
			Formulation and notes: 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES qualified FBS</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>90 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>1.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>107 Units/mL LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>60 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>Media: ESC differentiation medium 
			Formulation and notes: 436.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x MEM NEAA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESC-qualified serum</td>
			<td>Applied Stem Cell</td>
			<td>ASM-5007</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>55 mM 2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>0.9 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Media: NPC trypsinization medium 
			Formulation and notes: 100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (18.3%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3690</td>
			<td>Media: freeze in 5 mL aliquote 
			Formulation and notes: 0.266 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8802</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Media: Surface coating solutions 
			Formulation and notes: 2.5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine (PDL)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Media: use within 1 wk 
			Formulation and notes: 100 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>5 &#181;g/mL in H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>Media: NPC culture medium 
			Formulation and notes: 492.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N2 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up to 1 month 
			Formulation and notes: 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10888-022</td>
			<td>Media: ESN culture medium 
			Formulation and notes: 482.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B27 vitamins</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media: store at 4 &#176;C for up 1 month 
			Formulation and notes: 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2115</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x antibiotics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluoro-2&#39;-deoxyuridine (5FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td>Media: 2000x Mitotic inhibitors aliquot and store at -20 &#176;C 
			Formulation and notes: dd 150 mg 5FDU and 350 mg uridine to 10 mL Neurobasal A. Sterile filter, aliquot and freeze. Use 2000x in ESN culture medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Formulation and notes: store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>soybean trypsin inhibitor (STI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6414</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4403</td>
			<td>Prepare 100 mM stock by dissolving 100 mg ascorbic acid in 5.7 mL of 50:50 DMSO/ethanol mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>retinoic acid (RA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td>Resuspend 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/ethanol. Supplement with 1 mL of 100 mM ascorbic acid stock. Aliquot and stored at -80 &#176;C. Stable for 6 mos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. MIST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: Extracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60135</td>
			<td>Media: (ERB; pH = 7.3, 315 mO) 
			Final Concentration (mM): 74.56 
			MW: 3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3139</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 119.98 
			MW: 1.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8644</td>
			<td>Final Concentration (mM): 180.16 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td>Media: Intracellular Recording Buffer 
			Final Concentration (mM): 234.5 
			MW: 140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71386</td>
			<td>Media: (IRB; pH = 7.3, 320 mO) 
			Final Concentration (mM): 58.44 
			MW: 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 507.18 
			MW: 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5884</td>
			<td>Final Concentration (mM): 523.18 
			MW: 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21115</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 110.98 
			MW: 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 95.21 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>380.35</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 380.35 
			MW: 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td>Media: Stable at 4 &#176;C for at least 6 mo. 
			Final Concentration (mM): 238.3 
			MW: 10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bicuculline</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>131</td>
			<td>Media: Miscellaneous 
			Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 417.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C239</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.01 
			MW: 276.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8001</td>
			<td>Final Concentration (mM): 0.005 
			MW: 645.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BoNT/A-/G</td>
			<td>Metabiologics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Media: 
			Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetanus toxin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3194</td>
			<td>Final Concentration (mM): TBD 
			MW: 150,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SL-2</td>
			<td>Final Concentration (mM): N/A 
			MW: N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniAnalysis (version 6.0.7)</td>
			<td>Synaptosoft, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Event detection software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro (version 6.22A)</td>
			<td>WaveMetrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Software for visualization of recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>Heka</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>MPC-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>patch-clamp amplifier</td>
			<td>Heka</td>
			<td>ECB10USB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td>Corning 7740</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm glass coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer (40 &#181;m)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stovall Belly Dancer Shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low adhesion dishes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-539-101</td>
			<td>Corning 3262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacterial dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons

تم الدراسات العلاجية والآلية للأعصاب المطثية المستهدفة presynaptically (الأنابيب النانوية الكربونية) محدودة بسبب الحاجة إلى وجود نموذج قائم على خلية قابلة للأن تنتج نقاط الاشتباك العصبي عاملة ويخضع الاستجابات الفسيولوجية للتسمم. نحن هنا وصف طريقة بسيطة وقوية للتمييز كفاءة خلايا الفئران الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) في الأنساب محددة من النشطة synaptically، الخلايا العصبية المتصلة بالشبكة. بعد بروتوكول التمايز 8 يوم، الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (ESNs) بسرعة تعبير عن وتجزئة البروتينات neurotypic، تشكل الأشكال التضاريسية العصبية وتطوير الاستجابات الكهربائية الجوهرية. قبل 18 يوما بعد التمايز (DIV 18)، ESNs يحمل glutamatergic نشط وγ الغاما حمض (GABA) نقاط الاشتباك العصبي ergic والسلوكيات شبكة الناشئة التي تتميز مثير: التوازن المثبطة. لتحديد ما إذا كان التسمم مع الأنابيب النانوية الكربونية يعادى وظيفيا متشابك العصبي، وبالتالي تكرار عشره في الجسم الحي الفيزيولوجيا المرضية هي المسؤولة عن المظاهر السريرية للتسمم أو مرض الكزاز، تم استخدام خلية كاملة المشبك التصحيح الكهربية لقياس التيارات عفوية مصغرة مثير آخر متشابك (mEPSCs) في ESNs تتعرض لعصبي الكزاز (خيمة) أو عصبي البوتولينوم (بونت) الأنماط المصلية / A- / G. في جميع الحالات، عرضت ESNs فقدان شبه كاملة من النشاط متشابك في غضون 20 ساعة. وظلت الخلايا العصبية مخمورا قابلة للحياة، كما يتبين من دون تغيير إمكانات غشاء يستريح والاستجابات الكهربائية الجوهرية. لمزيد من تميز حساسية هذا النهج، تم قياس الآثار التي تعتمد على جرعة من السكر على النشاط متشابك 20 ساعة بعد إضافة بونت / A. أدى التسمم مع 0.005 PM بونت / A في إنقاص كبير في mEPSCs، مع تركيز مثبط متوسط ​​(IC 50) من 0.013 PM. مقارنات بين جرعات متوسط ​​تشير إلى أن القياسات الوظيفية لتثبيط متشابك هي أسرع وأكثر تحديدا وأكثر حساسية من كمينالمقايسات الانقسام أو مقايسة الماوس الفتك. هذه البيانات التحقق من صحة استخدام جانب synaptically، الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية خلية للكشف محددة للغاية وحساسة من الأنابيب النانوية الكربونية.

لقد قمنا بتطوير بروتوكول تمايز تمكن الإنتاج الاقتصادي لكميات كبيرة من الخلايا العصبية الجذعية نقية للغاية المستمدة من الخلايا من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (المفصل في الشكل 1A) 8،11. وقد استخدمت هذه الطريقة على مدى فترة من السنوات للتمييز بتكاثر المتولدة من القطاع الخاص والمتاحة تجاريا خطوط ESC إلى الخلايا العصبية الأنساب محددة 12-14. وتشمل العناصر الحاسمة في هذا البروتوكول (1) التكيف من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لالمغذية ثقافة تعليق خالية من الخلايا. (2) الصيانة المناسبة للثقافات تعليق. و (3) التمايز في ظل ظروف الدوارة. الانتقال إلى ثقافة تعليق يقلل بشكل كبير من الوقت وتكلفة الصيانة ESC، ويغني عن الحاجة لإزالة الخلايا المغذية قبل التمايز. وبعد التكيف تعليق، Oct3 / 4 التعبير يتسق خلال 30 على الأقل الممرات، مشيرا إلى أن التكيف تعليق لا يغير التعبير عن علامات تعدد القدرات (الشكل 1B-D </stroنانوغرام&gt;). المجالس الاقتصادية والاجتماعية هي مناسبة للتمايز الخلايا العصبية مرة واحدة العائد خلية باستمرار يتجاوز 1 × 10 7 خلايا في المرور. ويحدث هذا عادة في غضون عشر الممرات بعد التكيف تعليق أو خمس فقرات بعد ذوبان المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي كانت سابقا تكييفها تعليق. تم العثور على التناوب الميكانيكية التفرقة المجاميع أيضا أن تكون حاسمة لزيادة العائد الخلايا العصبية. إضافة شاكر دوارة القضاء تشكيل فائقة الكلي، وزيادة قابلية الإجمالية وإنتاج زيادة ~ 300٪ في محصول الخلايا الاصلية العصبية (الشخصيات) في DIV 0 (الشكل 1E). يبدأ تمايز نموذجي مع 3.5 × 10 6 المجالس الاقتصادية والاجتماعية في DIV -8 وتنتج 115 × 10 6 الشخصيات في DIV 0، ما يقرب من 60٪ من الذي سوف البقاء على قيد الحياة وتصبح الخلايا العصبية. تتكون ال 40٪ المتبقية الخلايا غير العصبية ويتم التخلص إلى حد كبير بالحرمان المصل بين DIV 0 - 1. ويمكن إزالة عدد صغير من استمرار الدبقية التي كتبها إضافة INH الإنقساميةibitors من DIV 2-4 أو DIV 8 - 12. كثافة تصفيح أمر بالغ الأهمية في DIV 0؛ والخلايا العصبية مطلي قليلة جدا لا تتجاوز 2 أسابيع البقاء على قيد الحياة. في غضون أيام من الطلاء، والخلايا العصبية متباينة يحمل الأشكال التضاريسية العصبية وتجزئة البروتينات neurotypic، مثل MAP2 علامة somatodendritic وعلامة محور عصبي تاو (الشكل 2A). يمكن تحديدها من قبل DIV 14 سينابسينات-1 + نقاط وعلى واجهات محواري تغصني، توحي تشكيل المشبك. وهذا يتفق مع التعبير عن البروتينات علامة متشابك قبل DIV 7 8،11. تستمر الأشكال التضاريسية العصبية إلى أن تنضج من خلال DIV 21، وعند هذه الثقافات الوقت يحمل العرش محواري تغصني تفصيلا ونقاط ومتشابك كبيرة (الشكل 2A). إذا حافظت على نحو ملائم، لا تزال قابلة للحياة ESNs ونشطة لمدة 4 أسابيع على الأقل بعد الطلاء. التنميط التعبير طولية باستخدام RNA-التسلسل أيد أدلة الصرفي وبروتيوميك من الخلايا العصبية مواصفات لد إنضاج 11،15. علامات التمثيلية للتطور التنموي أظهرت ملامح التعبير مرحلة معينة، بما في ذلك Oct3 / 4، Nestin، DCX، NeuN وKCC2 (الشكل 2B). بواسطة DIV 0، أعرب ESNs نسخ وفيرة من البروتينات الهيكلية الخلايا العصبية محددة، بما في ذلك MAP2 وتاو. وتمشيا مع النتائج السابقة، وقد لوحظت علامات لاثنين فقط من الأنواع الفرعية العصبية: الدماغ المتوسط ​​/ الدماغ المؤخر الخلايا العصبية glutamatergic، معربا عن vGluT2 وinterneurons GABAergic 8. في المقابل، أظهرت مجموعة واسعة من glutamatergic وGABAergic علامات زيادات حادة في التعبير بين DIV 0 وDIV 7، بما في ذلك البروتينات كمين قبل متشابك اللازمة لإطلاق سراح العصبي. المستقبلات العصبية اللازمة لاستجابات ما بعد المشبكية. والبروتينات السقالات اللازمة لحبل هذه المستقبلات على غشاء بعد المشبكي. الخلايا العصبية يحمل الخصائص الكهربائية الجوهرية الناضجة التي كتبها DIV 14 و عفوية مصغرة تيارات ما بعد متشابك مثير كتبها DIV16 16. تم استخدام تثبيط تقاس من متشابك بالإرسال (ميست) فحص لتقييم تأثير التسمم على النشاط متشابك. وبمقارنة الترددات mEPSC بين DIV حالة سكر والمعالجة السيارة 24 + ESNs، ويوفر ميست قياس الكمي ومحددة من التسمم بناء على تثبيط وظيفي من النشاط متشابك (الشكل 3A). وقد استخدم ميست لقياس آثار بونت / A- / G أو خيمة على النشاط متشابك في ESNs في 20 ساعة بعد إضافة حمام من كل السموم. أضيفت السموم في تركيز يعادل 10 أضعاف قيمة EC 50، والتي سبق تحديدها من خلال تحليل طخة مناعية من كمين البروتين انشقاق 11. جميع السموم خفضت الترددات mEPSC إلى أقل من 5٪ من الضوابط المعالجة السيارة. كانت تخفيضات في أسعار متشابك لا تعزى إلى موت الخلايا أو ردود الجوهرية تتغير منذ كانت ESNs مخمورا قابلة للمصححة، أطلقت إمكانات العمل المتكررةردا على حقن الحالي وعرضت أي تغيير كبير في يستريح غشاء المحتملة (الشكل 3B، C). لمقارنة حساسية ميست إلى الأساليب القائمة للكشف عن الأنابيب النانوية الكربونية والحد من الكشف وتركيز مثبط متوسط ​​(IC 50) تم تحديد 20 ساعة بعد إضافة بونت / A إلى ESNs. التسمم من قبل ما لا يزيد عن 0.005 PM بونت / A تنتج انخفاض كبير إحصائيا في وتيرة mEPSC، حيث بلغت قيمة IC 50 من 0.013 PM وإسكات كاملة من النشاط متشابك فوق 12:05 (الشكل 4A). هذه القيمة IC 50 يتوافق مع ما يقرب من 0.5 الماوس وحدة قاتلة / مل، مما يوحي بأن ميست هو ضعف حساسة و2- إلى 4 أضعاف أسرع من MLA في الكشف عن وجود بونت / A. القياسات طخة مناعية من SNAP-25 انشقاق أنتجت قيمة EC 50 من 12:38 وجرعة كشف تقل عن 0.05 مساء، مشيرا إلى أن ميست هو ما يقرب من 30 أضعاف أكثر حساسيةمن الكشف القائم على طخة مناعية من البروتينات كمين المشقوق (الشكل 4B). <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig1.jpg" /> لا تزال الشكل 1. ESNs-تكييفها تعليق مستقرة ميتوتيكلي وسرعة علامات تعدد القدرات. (A) رسم تخطيطي للصيانة ESC والتمايز. تم وضع علامة على وجود أو عدم وجود حمض الريتينويك (RA) أو عامل مثبط سرطان الدم (LIF) من قبل + أو -. ويرد مقارنة بين أيام في المختبر (DIV) ومراحل تطور الكلاسيكية (DS) للثقافات الخلايا العصبية الابتدائية 17. معدلات (B) انتشار لR1، D3 وخطوط الخلايا C57BL / 6J ES استقرار خمسة ممرات بعد التحول إلى ثقافة تعليق. (C) التدفق الخلوي البيانات تظهر أي تغيير جوهري في Oct3 / 4 التعبير في R1، D3 وخطوط الخلايا C57BL / 6J ES قياس أكثر من 25 فقرات في الثقافة تعليق (ن = 6 لكل منهما). (D) غلة خلية الفعلية خلال الركض الروتينية للحصول على خط R1 ESC-تكييفها تعليق قياسها بين الممرات 5 و 30 (خط أسود). وتعرض العوائد التراكمية النظرية إذا يتم تجاهل أي خلايا أثناء الركض أيضا (خط أحمر). (E) وصور برايت مجال DIV 0 المجاميع المنتجة في إطار ثابت (يسار) أو شروط الدوارة (يمين). شروط دوارة تنتج المجاميع كروية دون التكتل وارتفعت غلة NPC 3 أضعاف (P &lt;0.001، قررت استخدام اختبار t الطالب) 11. * يشير إلى P &lt;0.05. لقد تم تعديل هذا الرقم من هوبارد وآخرون 11 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig2.jpg" /> الشكل 2. المورفولوجية، والعلاقات العامةدليل oteomic وtranscriptomic من مواصفات العصبية ونضوج (A) كيمياء سيتولوجية مناعية من DIV 7 - 49 DIV يوضح تشجر العصبية وظهور نقاط ومتشابك في واجهات محواري تغصني. وصفت محاور مع تاو (الأخضر)، وصفت التشعبات مع MAP2 (الحمراء)، وصفت مقصورات قبل متشابك مع سينابسينات (أبيض)، وهي ملطخة النوى مع دابي (الأزرق). (B) التنميط التعبير طولية من الجينات تمثيلية يدل التنموي التعبير مراحل محددة وتحديد الأنواع الفرعية العصبية. وأعرب جميع النصوص الجين كرقم تقريبي من النصوص لكل خلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig3.jpg" /> الشكل 3. ESNs تحت. اذهب تثبيط النشاط متشابك عند تعرضها للبونت / AG وخيمة (A) آثار التمثيلية من ESNs جمعت 20 ساعة بعد إضافة حمام من ~ 10 × 50 EC قيم بونت / A - / G، وخيمة أو مركبة. كل عصبي تخفيض النشاط متشابك من قبل أكثر من 95٪ بالمقارنة مع مجموعة المقارنة. ظلت (ب) الخلايا العصبية مخمورا قادرة على إطلاق الجزائرية المتكررة ردا على إزالة إستقطاب حقن الحالي (كما هو موضح لبونت / A، ولكن لوحظ في جميع الثقافات مخمورا) و (C) عرضت أية تغييرات في يستريح غشاء السلبي المحتمل (C، N&gt; 18 لكل معاملة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52361/52361fig4.jpg" /> الشكل 4. تحديد حساسية MIST في بونت / A المعاملةESNs. (A) القياسات ميست من النشاط متشابك 20 ساعة بعد إضافة حمام من بونت / A. أظهرت تمثيلية شرائح أثر الجهد المشبك انخفاضا في وتيرة mEPSC التالية بونت / A التعرض (الجانب الأيسر). الكميات من التردد mEPSC (شريط الرسم البياني، الجانب الأيمن، ن = 20 للضوابط، ن = 11-22 لكل جرعة) يؤكد انخفاض تعتمد على الجرعة في وتيرة mEPSC. تم تحديد تركيز مثبط متوسط ​​مع المربعات الصغرى تناسب من الانحدار غير الخطية باستخدام منحدر متغير أربعة المعلمة (R 2&gt; 0.91). ملاحظة الحد من الكشف عن طريق MIST في ESNs هو 0.005 على الأقل مساء. (B) بونت / A التسمم النتائج ESNs في الانقسام من SNAP-25 كما تصور من قبل التحولات التنقل هلام (وصمة عار التمثيلية الغربية على الجانب الأيسر مع الكمي شريط الرسم البياني يظهر من SNAP-25 انشقاق على الحق، ن = 4) . لاحظ انخفاض حساسية باستخدام كمين البروتين الانقسام (SNAP-25)، ونقطة نهاية (EC 50 0.36 مساء) مقابل </eم&gt; ميست (IC 50 من 0.013 م). * يشير إلى P &lt;0.05. *** يشير إلى P &lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52361/52361fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons at JoVE.com

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

functional-evaluation-biological-neurotoxins-networked-cultures-stem

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Views.  United States Army Medical Research Institute of Chemical Defense. A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Video: Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Intrathecal Delivery of Antisense Oligonucleotides in the Rat Central Nervous System

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central nervous system (CNS). However, its existence also dramatically lowers the accessibility of systemically administered therapeutic agents to the CNS. One method to overcome this, is to inject those agents directly into the cerebrospinal fluid (CSF), thus bypassing the BBB. This can be done via implantation of a catheter for either continuous infusion using an osmotic pump, or for single bolus delivery. In this article, we describe a surgical protocol for delivery of CNS-targeting antisense oligonucleotides (ASOs) via a catheter implanted directly into the cauda equina space of the adult rat spine. As representative results, we show the efficacy of a single bolus ASO intrathecal (IT) injection via this catheterization system in knocking down the target RNA in different regions of the rat CNS. The procedure is safe, effective and does not require expensive equipment or surgical tools. The technique described here can be adapted to deliver drugs in other modalities as well.

Here, we describe a method for delivering drugs to the rat central nervous system by implanting a catheter into the lumbar intrathecal space of the spine. We focus on the delivery of antisense oligonucleotides, though this method is suitable for delivery of other therapeutic modalities as well.

توصيل البراز المضاد للندرة في الجهاز العصبي المركزي للفئران

The blood brain barrier (BBB) is an important defense against the entrance of potentially toxic or pathogenic agents from the blood into the central ...