البروتوكول المقدم الذي يصف مقايسة النمو النوري التي هي ذات صلة كبيرة بيولوجيا الإنسان وتقييم السمية العصبية من مركبات جزيء صغير. توفر الإمكانات الانتقالية العالية والأهمية الفسيولوجية للخلايا السلف العصبية البشرية كنموذج الخلية البشرية الأولية ميزة كبيرة في فحص اكتشاف الأدوية المرتبطة بنوبريت خارج الجسم وتقييم السمية العصبية. ويمكن أيضا استخدام البروتوكول المقدم، والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان والخلايا العصبية الجذعية الجنينية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية، وذلك بالنسبة لمصادر الخلايا البديلة لمقايسة النمو العصبية والخلايا العصبية.
تبدأ بجمع وسائل الإعلام مع neurospheres العائمة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 إلى 400 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. ثم pirate بعناية عظمى.
و resuspend المجالات في 500 ميكرولترات من مذاب الخلية مُكشف تفكك. احتضان المجالات في 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 15 دقيقة. ثم إضافة خمسة إلى 10 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة ما قبل الدافئة والطرد المركزي الأنبوب في 300 إلى 400 مرات ز لمدة خمس دقائق لرواسب في رواسب neurospheres.
التعرق وإضافة ملليلترين من وسائل الإعلام الثقافية الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة 1000 ميكرولتر حتى العصبية تشكل تعليق خلية واحدة. بعد عد الخلايا، إضافة 2-3 مليون خلية إلى قارورة T25 في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام الثقافة. استبدال نصف وسائل الإعلام الثقافة كل ثلاثة أيام.
استخدام وسيلة التبريد المتاحة تجاريا لتجميد الخلايا. نقل الاعصاب الى أنبوب 50 ملليلتر والسماح للكرة لتسوية في القاع. استخدام 200 أو 1000 ميكرولتر ماصة تلميح لنقل neurospheres كبيرة إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر قبل passaging.
أجهزة الطرد المركزي في بقية neurospheres في 300 إلى 400 مرات ز لمدة ثلاث دقائق وإزالة بعناية فائقة. resuspend تصل إلى ألف المجالات في ملليلتر واحد من كاشف التبريد والكوندزير ونقله إلى أنبوب التبريد. تخزين أنبوب بين عشية وضحاها في ناقص 80 درجة مئوية، ثم نقله إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
لقياس نمو الخلايا العصبية، افتح الصورة في فيجي وحدد تحليل، أدوات ومدير عائد الاستثمار. انقر بزر الماوس الأيمن على الرمز الخامس في شريط الأدوات مباشرة والتبديل إلى خط حر. اختياريا، انقر نقرا مزدوجا فوق نفس الرمز لتغيير عرض الخط إلى 10.
ثم تتبع أطول نيوريت بداية بالقرب من جسم الخلية وتمتد إلى طرف. اضغط على التحكم و T ثم F لإضافة القياس إلى مدير ROI وتسليط الضوء على الخلايا العصبية قياس. حدد كل الأرقام في عائد الاستثمار.
انقر على قياس، ثم نسخ ولصق القياسات في جدول بيانات. لقياس كثافة الفلوريسنس للخلايا المسماة، انقر على الرمز الرابع في شريط الأدوات التحديدات الحرة ورسم شكل الخلية. انقر فوق تحليل و تعيين القياسات.
ثم تأكد من تحديد المنطقة، متوسط القيمة الرمادية، الحد الأدنى الأقصى لقيمة الرمادية والكثافة المتكاملة. انقر فوق تحليل وقياس. حدد المنطقة المجاورة للخلية كخلفية.
ثم انقر فوق تحليل وقياس. حدد كل البيانات المقاييس ونسخها، ولصقها في جدول بيانات. لمعطف لوحة إضافة 30 ميكروليتر من بولي L-ليسين في كل بئر من لوحة 384 جيدا واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
غسله مرتين مع برنامج تلفزيوني والسماح لها الجافة لمدة 30 دقيقة تقريبا. إضافة 30 ميكرولترات من اللامينيين إلى كل بئر، ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. كرر يغسل مع برنامج تلفزيوني والمضي قدما في طلاء الخلايا.
إضافة 20،000 الخلايا العصبية واحدة في 25 ميكرولتردات من وسائل الإعلام التمايز إلى كل بئر من لوحة 384 جيدا واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام. مهارات الأنابيب الدقة العالية مطلوبة لطلاء العدد الدقيق لل neurospheres التي يتم فصلها جميعًا في خلايا مفردة. لذلك ، يوصى بتمييز الخلايا العصبية إلى الخلايا العصبية قبل الطلاء لتحقيق المزيد من النتائج القابلة للاستنساخ.
بعد الحضانة، إضافة خمسة ميكرولترات من مجمع اختبار لكل بئر في ستة أضعاف التركيز المطلوب. واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. لتنفيذ مقال قابلية الخلية للتطبيق ، أضف 30 ميكروليترس من كاشف الإنارة لكل بئر.
واترك الصحن على شاكر لمدة دقيقتين الطرد المركزي لوحة في 300 إلى 400 مرة ز لمدة 30 ثانية، ثم احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وحمايتها من الضوء. بعد الحضانة ، وقياس الإنارة على قارئ microplate.
واستخدمت الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا العصبية المشتقة من السلف العصبي البشري لدراسة تأثير مثبطات HDAC كمركبات جزيء صغيرة لتمديد نيوريت والقدرة العصبية اللاحقة من مركبات الجزيء الصغيرة. كما تم تقييم السمية العصبية لمثبطات HDAC بعد التمييز بين خلايا السلف العصبي في 384 بئرا، مما يدل على إمكانية توسيع نطاق البروتوكول لعدد أكبر من المركبات. في دراسة مختلفة، تم استخدام قياس كثافة الخلايا العصبية الفلورية لتحديد مدى وفرة من هيستون H4 lysine خمسة أسيتيل كعلامة هيستون بعد علاج الخلايا العصبية مع مركبات التعديل اللاجينية.
بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا البروتوكول لتصور بروتين ما قبل متشابك، سينابت فيزيفيزين، للتحقق من الآثار السينيبتوجينية المحتملة لمركبات الجزيئات الصغيرة. باستخدام الطريقة المعروضة، يمكن قياس عدد النوريات، وكثافته، وطوله، وعرضه، إلى جانب الخصائص المتشابكة، بما في ذلك تعديلات البروتين قبل وما بعد التشابك.
