The authors thank Drs. Hukriede and Tsang for discussions. M.K. was supported by an NIH training grant (T32EB001026). This work was supported in part by grants from the American Liver Foundation, the March of Dimes Foundation (5-FY12-39), and the NIH (DK101426) to D.S.

وأثيرت الزرد ولدت وفقا للإجراءات القياسية. تمت الموافقة على التجارب التي أجرتها جامعة بيتسبرغ المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. 1. إعداد الأجنة / يرقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء التزاوج في الوقت المناسب، وإعداد الذكور البالغين والإناث تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) s931 الأسماك فرداني الزيجوت أو متماثل O / N ووضع مقسم بينهما. إزالة هذا المفرق صباح اليوم التالي عند الرغبة التزاوج. جمع الأجنة عن طريق توتير المياه باستخدام غرامة شبكة بلاستيكية مصفاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مصفاة رأسا على عقب وشطف السطح شبكة مع تيار غرامة من الماء البيض الاستغناء عن زجاجة الضغط. نقل 100 الأجنة إلى 100 مم طبق بتري مع 25 مل من الماء البيض. الحفاظ على ما لا يزيد عن 100 الأجنة في طبق بتري ورفع لهم في 28 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع تصبغ، إضافة الفنيل (PTU) في أطباق بتري قبل 10 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، ورفع هmbryos / اليرقات حتى 80 HPF. التركيز النهائي من PTU هو 0.2 ملم. تنبيه: PTU غير سامة. استخدام وفقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير اليرقات وذلك بإضافة 3-الأمينية البنزويك اثيل استر حمض (تريكين)، في تركيز النهائي من 0.016٪، في أطباق بتري. ثم، باستخدام مجهر epifluorescence ويرقات النوع CFP الإيجابية. استخدام اليرقات مع حجم مماثل الكبد وتجاهل تلك التي لديها الكبد أصغر أو أكبر. ملاحظة: أي يرقات-CFP الإيجابية، بغض النظر عن كثافة، ويمكن استخدامها لأنه لا يوجد اختلاف في مدى الكبدية الاجتثاث بين يرقات فرداني الزيجوت ومتماثل. تنبيه: تريكين غير سامة. استخدام وفقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الماء البيض التي تحتوي على تريكين وإضافة الماء البيض تستكمل مع 0.2 ملي PTU. الحفاظ على الأجنة / اليرقات في 28 ° C. </li></ol> 2. Mtz لعلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطازجة حل 10 ملم Mtz لعن طريق إذابة 0.171 غرام من مسحوق Mtz لفي 100 مل من الماء البيض تستكمل مع 0.2٪ DMSO و 0.2 ملي PTU. حل تماما MTZ، مزيج الحل في RT مع التحريك السريع لمدة 20-30 دقيقة. للمساعدة على إذابة Mtz لوتعزيز Mtz لنفاذ إلى يرقات، إضافة DMSO عند إعداد Mtz ل. تحذير: التعرض لفترات طويلة أو زيادة تركيز Mtz لمادة سامة. استخدام وفقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل اليرقات في السيطرة والتجريبية المجموعات عن طريق نقل العدد المرغوب فيه من اليرقات إلى قسمين مختلفين 100 طبق بتري ملم أو لوحة متعددة أيضا. لصالح المجموعة التجريبية، والحفاظ على اليرقات في 10 ملي Mtz لحل. لمجموعة المراقبة، والاحتفاظ بها في المياه التي تحتوي على البيض 0.2٪ DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحات أو أطباق بتري تحتوي على حل Mtz لبورق الألمنيوم لمنع الصور تثبيط MTZ، واحتضان عند 28 ° C. تعتمد مدة العلاج على Mtz لمرحلة اليرقات وخط المعدلة وراثيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمراقبة مماثلة الاجتثاث الكبدية الشديد في <eم&gt; تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) خط، علاج اليرقات مع الحل Mtz لمن أي 3،5 يوما بعد الإخصاب (DPF) (لمدة 36 ساعة) أو من إدارة الشرطة الاتحادية 5 (لمدة 24 ساعة). </li></ol> 3. تحليل صفراوية يحركها تجديد الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الفترة الاجتثاث، وإزالة الحل Mtz لمن لوحات. غسل اليرقات Mtz لمعاملة بإضافة 25 مل من الماء البيض. دوامة لوحة 2-3 مرات لغسل اليرقات قبل رميه الماء البيض. كرر ثلاث مرات ثم تزج اليرقات مرة أخرى في الماء البيض. لتجنب ذمة القلب والموت اليرقات في اليرقات Mtz لالمعاملة، إضافة إلى تركيز أقل من تريكين، بتركيز نهائي من 0.008٪، لشل حركة اليرقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الكبد، فحص حجم الكبد من اليرقات Mtz لمعاملة تحت المجهر epifluorescence مع مرشح CFP. تقييم مستويات الاجتثاث الكبدية على أساس حجم النسبي للكبد: كبيرة (غير ذاب؛ 0-10٪ اليرقات) ومتوسطة (ذاب جزئيا؛ 02/100٪)، وصغيرة جدا (ذاب تماما؛ 80-90٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة اليرقات مع كبد غير ذاب ذاب أو جزئيا. تبقي فقط اليرقات مع كبد صغير، مما يدل على الاجتثاث الكبدية الشديد. لتحليل الكبد في تجديد 0 نقطة زمنية ساعة (R0h)، حصاد اليرقات بعد Mtz لتبييض وCFP الفرز. خلاف ذلك، والحفاظ على يرقات مرتبة في الماء البيض تستكمل مع 0.2 ملي PTU لتصبح جاهزة للحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات التي تحصد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ويحل محل المياه البيض مع الحل التثبيت من 3٪ الفورمالديهايد في المخزن PEM. احتضان الأنبوب على محور دوار O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل تثبيت مع 1 مل من PBSDT وتدوير الأنبوب الذي يحتوي على اليرقات على محور دوار لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات ثابتة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على PBSDT وباستخدام ملقط، يدويا إزالة صفار البيض والصدرية زعانف تحت المجهر تشريح. نقل ما يصل TP 20 اليرقات تشريح في أنبوب 1.5 مل. </li> &lt;لى&gt; استبدال حل PBSDT مع 1 مل من محلول منع والصخور الأنبوب على محور دوار في RT لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال عرقلة الحل مع 100 ميكرولتر من عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة الأولية. صخرة ببطء أنبوب على محور دوار O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة الأولية ويغسل مع PBSDT 5 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة. ثم إضافة 100 UL من عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية والصخور على محور دوار في RT ل2HR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 5 مرات مع PBSDT لمدة 10 دقيقة في كل مرة في RT التي كتبها هزاز على محور دوار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه اليرقات أفقيا على شريحة المجهر وإضافة قطرة من وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. غطاء لهم بعناية مع غطاء زجاجي وختم غطاء زجاجي مع ملمع الأظافر. الآن، وانها مستعدة للفحص المجهري متحد البؤر. </li></ol>

<ol>
	<li>Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+liver+regeneration.">New concepts in liver regeneration.</a> J Gastroen Hepatol. 26, 203-212 (2011).</li><li>Fausto, N., Campbell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+hepatocytes+and+oval+cells+in+liver+regeneration+and+repopulation.">The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation.</a> Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).</li><li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+and+Liver+Regeneration.">Stem Cells and Liver Regeneration.</a> Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration:+Alternative+epithelial+pathways.">Liver regeneration: Alternative epithelial pathways.</a> Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).</li><li>Falkowski, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+hepatocyte+'buds'+in+cirrhosis+from+intrabiliary+stem+cells.">Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells.</a> Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).</li><li>Yoon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Cell+Adhesion+Molecule+(EpCAM)+Marks+Hepatocytes+Newly+Derived+from+Stem/Progenitor+Cells+in+Humans.">Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.</a> Hepatology. 53, 964-973 (2011).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213, 286-300 (2007).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Regeneration+after+Partial+Hepatectomy+Critical+Analysis+of+Mechanistic+Dilemmas.">Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas.</a> Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).</li><li>Yanger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+hepatocytes+are+generated+by+self-duplication+rather+than+stem+cell+differentiation.">Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).</li><li>Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+against+a+Stem+Cell+Origin+of+New+Hepatocytes+in+a+Common+Mouse+Model+of+Chronic+Liver+Injury.">Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury.</a> Cell reports. 8, 933-939 (2014).</li><li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+alpha+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish.">Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).</li><li>Goessling, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+mutant+zebrafish+uncover+a+changing+temporal+requirement+for+wnt+signaling+in+liver+development.">APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development.</a> Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).</li><li>Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+growth+in+the+embryo+and+during+liver+regeneration+in+zebrafish+requires+the+cell+cycle+regulator,+uhrf1.">Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-nitrosothiol+signaling+regulates+liver+development+and+improves+outcome+following+toxic+liver+injury.">S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury.</a> Cell reports. 6, 56-69 (2014).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE2-regulated+wnt+signaling+and+N-acetylcysteine+are+synergistically+hepatoprotective+in+zebrafish+acetaminophen+injury.">PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+A+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).</li><li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase.">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li><li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitroreductase-mediated+cell/tissue+ablation+in+zebrafish:+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies.">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).</li><li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish.">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).</li><li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model.">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. , (2014).</li><li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish.">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).</li><li>Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+signals+modulate+hepatocyte+apicobasal+polarization+in+zebrafish.">Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish.</a> Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).</li><li>Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+Notch+signaling+regulate+quiescence,+renewal+and+differentiation+in+pancreatic+endocrine+progenitors.">Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors.</a> Development. 139, 1557-1567 (2012).</li><li>Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+notch+signal+during+zebrafish+intrahepatic+biliary+development.">Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).</li><li>Itoh, T., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+Regeneration+by+Stem/Progenitor+Cells.">Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells.</a> Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).</li><li>Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+cell-specific+ablation+in+zebrafish+using+a+triple+mutant+of+Escherichia+coli+nitroreductase.">Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase.</a> Zebrafish. 11, 85-97 (2014).</li><li>Stueck, A. E., Wanless, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+cirrhosis:+The+maturation+sequence+of+buds+arising+from+hepatocyte+progenitor+cells.">Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells.</a> Hepatology. 58, 235A (2013).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شديدة، ولكن ليس خفيفة، الكبدية الاجتثاث يثير يحركها المرارة تجديد الكبد. لذلك، بعد العلاج Mtz لوفشل، فمن المهم أن تدرس حجم الكبد من اليرقات Mtz لمعاملتهم، والتي يمكن تقييمها من قبل لا يتجزأ CFP مضان من fabp10a: CFP-NTR التحوير. لأن نسبة صغيرة من اليرقات Mtz لمعاملة سيعرض غير ذاب (0-5٪) أو ذاب جزئيا (10-20٪) الأكباد، فمن الضروري لفرز وتحليل فقط اليرقات مع كبد صغير جدا، والتي يدل على الاجتثاث الكبدية الشديد. على الرغم من أن في بروتوكول لدينا، كنا نعامل واليرقات الزرد مع Mtz ل3،5-5 إدارة الشرطة الاتحادية (فترة العلاج 36 ساعة)، مراحل البديلة ومدة العلاج Mtz لمن الممكن أيضا. على سبيل المثال، اليرقات تعامل 5-6 DPF (فترة العلاج 24 ساعة) عرضت أيضا الاجتثاث الكبدية الشديد، على غرار فترة العلاج 36 ساعة المذكورة أعلاه. مجموعتان إضافيتان ولدت بشكل مستقلfabp10a مشابهة: خطوط المعدلة وراثيا NTR وذكرت أيضا على عملية يحركها المرارة تجديد الكبد بعد استئصال الكبدية محددة. في حين أن مجموعة واحدة تعامل مع يرقات Mtz ل6-7 DPF 21، فعلت حتى آخر 3،5-4،5 إدارة الشرطة الاتحادية، التوصل إلى استنتاجات مماثلة (20). لأن كل fabp10a: خط المعدلة وراثيا NTR قد يواجه مستوى مختلف من NTR التعبير، ينبغي تحديد مدة وجرعة من العلاج Mtz لمنفصل لكل من خط المعدلة وراثيا المستخدمة. قد يكون مفيدا أيضا لتوليد خط المعدلة وراثيا مع نسخة محسنة من الجين NTR، الذي إدخال ثلاث طفرات النقطة يؤدي إلى زيادة في النشاط الأنزيمي في 26. هذا المسخ NTR سوف يؤدي إلى حالة الاجتثاث أسرع من النوع البري NTR 26. هذا هو مفيد خاصة عندما البرية من نوع حركية NTR قد تحد من إمكانية كاملة الاجتثاث خلية في المرحلة المطلوبة. منذ مئات يرقاتيمكن الخضوع لفي وقت واحد الكبدية الاجتثاث، وهذا نموذج الكبد إصابة الزرد يمكن تطبيقها على شاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن قمع أو زيادة يحركها المرارة تجديد الكبد. على سبيل المثال، وذلك باستخدام هذا النموذج، تقوم المجموعة شين في معهد جورجيا للتكنولوجيا شاشة الكيميائية وجدت عدة منبهات WNT والخصوم نوتش التي سهلت تجديد الكبد 20. أجرينا أيضا شاشة مقياس كيميائية صغيرة، وحددت عدة مركبات التي يمكن أن قمع تجديد الكبد (SK، TYC، JS، وDS، قيد الإعداد). علامة يحلل في البشر اقترح أن BECS يمكن أن تسهم في خلايا الكبد مجدد في الكبد المريضة 5،6. ذكرت مجموعة الدكتور Wanless &quot;مؤخرا أن نسبة كبيرة من حمة في تليف الكبد تراجعت يبدو أن تستمد من LPCs / BECS في البشر 27، مما يدل على أهمية BEC يحركها تجديد الكبد تليف الكبد في الانحدار. وبالنظر إلى أن BECS أساساالمساهمة في خلايا الكبد تجديد في الزرد نموذج اصابة الكبد هو موضح هنا، فإن هذا النموذج أن يكون أداة لا تقدر بثمن لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء BEC يحركها تجديد الكبد. وفهم هذه الآليات تقديم رؤى هامة في كيفية زيادة تجديد الكبد الفطري في المرضى الذين يعانون من أمراض في الكبد. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع شاشات الكيميائية، قد يكون هذا النموذج الزرد مفيدة في تحديد المخدرات المحتملة التي يمكن أن تسهل تجديد الكبد الفطري في المرضى من البشر.

الكبد هو عضو التجديدي للغاية. خلال تجديد الكبد، وتجديد خلايا الكبد، والخلايا متني من الكبد، وتستمد من خلايا الكبد موجود مسبقا (يحركها الكبدية تجديد الكبد) أو BECS (يحركها المرارة تجديد الكبد) 1،2. اصابة الكبد عادة ما يتسبب في انتشار خلايا الكبد موجودة من قبل؛ ومع ذلك، عندما تتعرض للخطر الانتشار الكبدية، BECS يمكن أن تسهم في خلايا الكبد 2-4. هذين الوضعين لتجديد الكبد هامة سريريا. على الاستئصال الجراحي لجزء من الكبد البشري (على سبيل المثال، بسبب أورام الكبد أو المتبرعين الأحياء)، خلايا الكبد في الكبد المتبقية تتكاثر لاسترداد كتلة الكبد المفقودة. على النقيض من ذلك، في المرضى الذين يعانون من أمراض في الكبد، وخطر انتشار خلايا الكبد إلى حد كبير، بحيث تظهر BECS أو الخلايا الاولية الكبد (LPCs) للمساهمة في تجديد خلايا الكبد 5،6. نموذج استئصال الكبد الجزئي القوارض 2/3، والذيخلايا الكبد تتكاثر لاسترداد كتلة الكبد المفقودة، ساهمت إلى حد كبير في الفهم الحالي يحركها الكبدية الكبد تجديد 7،8. ومع ذلك، لا يوجد نموذج والقوارض صالح في والتي هي مستمدة أساسا خلايا الكبد تجديد من BECS. على الرغم من أن العديد من النماذج سموم الكبد القوارض أدى إلى تحديد يحركها المرارة الكبد تجديد 2-4، النسب تتبع الدراسات التي أجريت مؤخرا على الفئران تشير إلى مساهمة الحد الأدنى من BECS لتجديد خلايا الكبد في هذه النماذج 9،10. بعض النماذج اصابة الكبد القوارض، بما في ذلك استئصال الكبد الجزئي 11-13 والتي يسببها الأسيتامينوفين تلف الكبد 14،15، تم تطبيقها على الزرد وأدت إلى تحديد جينات جديدة أو مسارات المتورطين في تجديد الكبد. ومع ذلك، مدفوعة الكبدية، ولكن ليس BEC يحركها، يحدث تجديد الكبد في هذه النماذج اصابة الكبد الزرد. ولذلك، فإن نموذج إصابة الكبد الرواية التي BECS تساهم نطاق واسع لregeneratخلايا الكبد جي هو مطلوب من أجل فهم أفضل للBEC يحركها تجديد الكبد. ووصفت الأهداف العامة للنموذج الاجتثاث الكبدية هنا (1) لإنشاء نموذج اصابة الكبد التي BECS المساهمة على نطاق واسع في خلايا الكبد تجديد، و (2) توضيح الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة BEC يحركها تجديد الكبد. افترضنا أن شدة الإصابة تحدد طريقة تجديد الكبد. وبالتالي، توقعنا أن يحركها المرارة تجديد الكبد ستشرع على الإصابة الكبدية الحادة. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بتطوير نموذج إصابة الكبد الزرد عن طريق توليد خط المعدلة وراثيا، تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) s931، التي تعبر عن درجة عالية من Nitroreductase بكتيريا (NTR) تنصهر مع بروتين فلوري سماوي (CFP) تحت fabp10a الكبدية محددة المروج. منذ NTR يحول دواء مساعد غير سامة، ميترونيدازول (Mtz ل)، إلى المخدرات السامة للخلايا، فإنه ablates فقط يقصد NTR-معربا عن الخلايا 16-18، في هذه الحالة، وخلايا الكبد. عن طريق التلاعب في مدة العلاج MTZ، مدى الكبدية الاجتثاث يمكن السيطرة عليها. باستخدام هذا النموذج، ونحن ذكرت مؤخرا ان على فقدان الكبدية الحادة، BECS إعطاء نطاق واسع أدى إلى تجديد خلايا الكبد 19، وهو ما أكده أيضا من قبل اثنين من دراسات أخرى مستقلة 20،21. وبالتالي، مقارنة مع القوارض المذكور ونماذج إصابة الكبد الزرد، لدينا الكبدية نموذج الاجتثاث هو أكثر فائدة لدراسة BEC يحركها تجديد الكبد. يصف هذا البروتوكول إجراءات إجراء التجارب تجديد الكبد باستخدام الزرد نموذج الكبدية الاجتثاث. وهذا النموذج سوف يكون مناسبا لتحديد الآليات الكامنة وراء يحركها المرارة تجديد الكبد وللشاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تقمع أو زيادة تجديد الكبد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td>Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium sulfate dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (Vectashield)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm petri dish&#160;</td>
			<td>Denville Scientific Inc.</td>
			<td>M5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50949071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540-A and 12-542-A</td>
			<td>18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zn-5 (mouse anti-Alcam)</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>zn-5</td>
			<td>1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-Hnf4a</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-6556 (C-19)</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-RFP</td>
			<td>Allele Biotechnology</td>
			<td>ACT-CM-MRRFP10</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson laboratories</td>
			<td>705-605-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21240</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 donkey anti-rat IgG</td>
			<td>Jackson laboratories</td>
			<td>712-165-150</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>S6F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M205FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3 g/L of sea salts &#8216;Instant Ocean&#8217; and 0.5 mM CaSO4 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25.6 g Na2HPO4&#183;7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&#160; Bring to 1 L with distilled water.&#160; Adjust pH 7.&#160; Autoclave for 20 min at 121&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBSDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&#160; Bring to 1 L with distilled water.&#160; Adjust pH 7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hepatocyte-specific ablation in zebrafish to study biliary-driven liver regeneration

الكبد لديه قدرة كبيرة على التجدد. خلايا الكبد، والخلايا متني من الكبد، ويمكن تجديد في واحدة من طريقتين: hepatocyte- أو يحركها المرارة تجديد الكبد. في يحركها الكبدية تجديد الكبد، وتستمد خلايا الكبد تجديد خلايا الكبد من قبل الإيجاد، في حين أنه في يحركها المرارة تجديد، تستمد خلايا الكبد تجديد من الخلايا الظهارية الصفراوية (BECS). ليحركها الكبدية تجديد الكبد، وهناك نماذج القوارض الممتازة التي ساهمت إلى حد كبير في الفهم الحالي لتجديد الكبد. ومع ذلك، لا يوجد نموذج القوارض مثل هذا ليحركها المرارة تجديد الكبد. بلغنا مؤخرا على نموذج اصابة الكبد الزرد التي BECS إعطاء نطاق واسع أدى إلى خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الحادة. في هذا النموذج، وذاب خلايا الكبد بشكل خاص من قبل وسائل pharmacogenetic. هنا نقدم بالتفصيل الطرق لاجتثاث خلايا الكبد وتحليل عملية تجديد الكبد BEC يحركها.هذا النموذج الاجتثاث الكبدية محددة يمكن أن تستخدم أيضا لاكتشاف الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء يحركها المرارة تجديد الكبد. وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب يمكن تطبيقها على شاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد أو قمع تجديد الكبد.

العلاج MTZ لمدة 36 ساعة (A36h، A تقف على الاجتثاث) 3،5-5 إدارة الشرطة الاتحادية خفضت بشكل كبير حجم الكبد (الشكل 1B). بعد Mtz لتبييض، التي تعتبر بداية تجديد الكبد (R)، fabp10a قوية: CFP-NTR وfabp10a: الظهور dsRed التعبير غضون 30 ساعة (الشكل 1B). شبكة الصفراوية داخل الكبد، وفقا لتقييم التعبير عن Alcam التي هي موجودة في غشاء BECS 22، انهارت في البداية ولكن تم إعادة تأسيس في 54 ساعة بعد فشل (R54h) (الشكل 1C). وتشير هذه البيانات إلى أن تجديد الكبد والانتعاش تحدث بسرعة في نموذجنا اصابة الكبد. ويبين الشكل 2 أن خلايا الكبد تجديد مستمدة من BECS. تيراغرام (TP1: H2B-mCherry) خط s939 يعبر عن بروتين أحمر فلوري النووي تحت سيطرة عنصر تحتوي على مواقع 12 RBP-Jĸ ملزمة 23. هذا RESPO الشقيظهر عنصر nsive لدفع التعبير الجيني حصرا في BECS في الكبد (24)؛ ومع ذلك، فمن الممكن أنه يدفع التعبير الجيني في LPCs لأن الشق يشير يرتبط ارتباطا وثيقا LPCs 25. لذلك، هذا خط المعدلة وراثيا يسمح لسهولة اكتشاف من BEC، وربما LPC، نوى. وعلاوة على ذلك، واستقرار الموسع للH2B-mCherry تصاريح انصهار بروتين تتبع النسب على المدى القصير. وأعرب معظم الخلايا H2B-mCherry + في الكبد تجديد في R0h Hnf4α (الشكل 2A)، وهو ما يعبر عنه في خلايا الكبد، ولكن ليس في BECS، في الكبد السيطرة. خلايا الكبد، وفقا لتقييم fabp10a: CFP-NTR التعبير، في R48h لا يزال يحتفظ TP1: H2B-mCherry التعبير (الشكل 2B، والسهام). وتشير هذه البيانات BEC التحول إلى خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الشديدة، وهو ما أكده أيضا عن طريق تتبع نسب دائم 19. <img<html> ALT = &quot;الشكل 1&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 52785 / 52785fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. نموذج اصابة الكبد الزرد. (A) مخطط يوضح فترات العلاج Mtz لوتجديد الكبد. (B) 36 ساعة العلاج Mtz لتقلص إلى حد كبير حجم الكبد وfabp10a: CFP وfabp10a: dsRed مضان في R0h. ومع ذلك، الظهور CFP قوية وdsRed مضان في R30h. تشير الأسهم إلى الكبد (لي). آراء (C) متحد البؤر الإسقاط من الكبد كله immunostained مع الأجسام المضادة المقاومة للAlcam التي وصفت BECS. وقد انهار شبكة الصفراوية داخل الكبد في R0h لكن بسرعة إعادة تأسيس في R54h. المناطق المنقطة الخطوط العريضة الكبد. الحانات النطاق: 100 (B)، 20 (C) ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52785/52785fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> _upload / 52785 / 52785fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. BECS تثير خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الحادة (A) مشاهدة إسقاط متحد البؤر الكبد تظهر Hnf4α (الخضراء) وTP1: H2B-mCherry (أحمر) التعبير في R0h. (B) متحد البؤر واحدة البصرية الصور القسم تظهر fabp10a: CFP-NTR (الرمادي) وTP1: H2B-mCherry (أحمر) التعبير في الكبد. تم الكشف عن mCherry التعبير من خلال مكافحة mCherry المناعية. لاحظ ضعف التعبير mCherry في نوى CFP + خلايا الكبد (السهام). mCherry قوي + الخلايا هي BECS. الحانات النطاق: 20 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52785/52785fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration at JoVE.com

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

تذرية الكبدية محددة في الزرد لدراسة يحركها صفراوية تجديد الكبد

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Google

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

8.5K Views.  University of Pittsburgh. To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Video: Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

الجراحية تذرية الفحص لدراسة التجديد العين في مستورقات

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

التحاليل النسيجية لإصابات الكبد الكحولية الحادة في الزرد

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

أساليب لدراسة التجديد في ستنتور

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

الاستئصال الليزري القائم على المجهر والتجدد في خلايا الحمار الوحشي Interneuromast

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

فحص تجديد العضلات في نماذج حمار وحشي من أمراض العضلات

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

التمايز والتحفيز الميكانيكي للخلايا البطانية المشتقة من hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة الخلايا البطانية المشتقة من hiPSC المزروعة تحت التحفيز الميكانيكي بوساطة السوائل 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.