وأيد هذا العمل من قبل مركز بحوث الصحة والطب الوطني (NHMRC) منحة المشروع إلى RM

جميع الإجراءات التجريبية وصفها هنا امتثلت لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان في نيو ساوث ويلز أستراليا وتم إجراء وفقا الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا لوائح التجارب على الحيوانات. يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات في هذا البروتوكول وفقا لمتطلبات لجنة رعاية الحيوان والأخلاق ذات الصلة. 1. أستيل الكيمو تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط التفاعل أستيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 290 ملغ من Acetylthiocholine يوديد إلى 200 مل من 0.1 M الفوسفات عازلة (PB). الاختلاط مع محرك مغناطيسي في 900 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ملغ من الجلايسين مع التحريك المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ببطء 420 ملغ من كبريتات النحاس لخليط التفاعل مع التحريك المستمر حتى يذوب المنتج تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجلد على الذبيحة (تم الحصول عليها من خلال تقاسم الأنسجة) عن طريق شقوقفي الجلد من الفئران perfused لأو الماوس، واستيعاب الجلد من منطقة الرقبة وتجعله الماضي قدميها. تأكد من أن لفافة تغطي كل العضلات إما إزالتها أو مثقبة بشكل كبير في ضمان التعرض وافرة من الألياف العضلية إلى محلول التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج كامل الجسم أو أحد أعضائه من الاهتمام الى خليط التفاعل واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الذبيحة لمدة 2 دقيقة في الماء المقطر. ملاحظة: في هذه المرحلة، والعضلات يحمل يمكن أن ينظر إلى تلوين الأزرق واللوحات نهاية المحرك (البرلمان الأوروبي)، وبقع بيضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح الذبيحة إلى 10٪ محلول كبريتات الأمونيوم لمدة 3-5 ثانية. ملاحظة: إن الألياف العضلية تتحول بسرعة البني وسوف البرلمان الأوروبي يمكن ملاحظتها كنقاط الأرقط الأسود. إذا حدث رد فعل بسرعة كبيرة جدا، وملطخة ألياف العضلات مظلمة جدا التمييز بين أعضاء البرلمان الأوروبي وألياف العضلات حاول استخدام تركيزات أقل من الأمونيوم حل كبريتيد (على سبيل المثال، 5٪). في وقت رد الفعل للحصول علىعلى النقيض الأمثل بين أعضاء البرلمان الأوروبي وألياف العضلات يختلف من عينة واحدة إلى أخرى. وبالتالي فإنه من الصعب تحديد وقت التعرض المحدد للكاشف. وينبغي رصد رد الفعل بشكل وثيق، وتوقفت عند يعتبر على النقيض كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الذبيحة مرتين، مع الإثارة في الماء المقطر، ويربت بلطف الذبيحة الجافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة كل من النواحي الجانبية وسطي من أطرافهم، وضمان أن أعضاء البرلمان الأوروبي لجميع عضلات الفائدة يتم التقاطها. </li></ol> 2. العضلي الحقن في لوحات السيارات نهاية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بال micropipettes الزجاج مع مجتذب micropipette (استخدام بال micropipettes متدرج مع الغطاسون يوصى). بمساعدة المجهر تشريح، وكسر نصائح من بال micropipettes مع زوج من ملقط مثل أن القطر الداخلي من التجويف من micropipette ما يقرب من 0.5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التأكد من أن جميع الأدوات الجراحية المستخدمة يتم تعقيمها طازجة والعشرينفي منطقة العمليات الجراحية غير المعقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل بال micropipettes مع الفلوري الذهب (5٪ في الماء المقطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل خدر في الحيوان في غرفة الاستقراء مع Isofluorane (4٪ في O 2). تحقق من وجود المنعكس التقويمي وضمان عدم وجوده قبل إزالته من غرفة تحريض. تأمين مخروط الأنف على الخطم من الفئران وتسليم Isofluorane (2٪ في O 2) لصيانة التخدير. قرصة أصابع الحيوان وتلمس بلطف العين الحيوان لضمان أن كلا من انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية غائبة. ملاحظة: يمكن أيضا مزيج من الكيتامين وxylazil أن تستخدم (80 و 10 ملغ / كغ على التوالي، تسليم البريتونى). الكيتامين هو الجدول 8 (&quot;التحكم&quot;) المخدرات والبروتوكولات اللازمة المرتبطة بشراء واستخدام وتخزين والتخلص من المخدرات سيتعين الالتزام بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف العينين أثناء الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق رأطرافهم argeted واستخدام الشاش لمسح منطقة حلق مع ثلاثة الدعك بالتناوب من بالكلورهيكسيدين و 70٪ كحول. نقل الحيوان إلى منطقة العمليات الجراحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان على underpad نظيفة ووضعها بشكل مناسب لضمان سهولة الوصول إلى العضلات المستهدفة (ق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من ملقط مع قبضة الأسنان لرفع الجلد فوق العضلة المستهدفة بعيدا عن العضلات الكامنة وإجراء شق في الجلد مع مقص جراحي. تأكد من أن شق كبير بما فيه الكفاية لفضح تماما العضلات (ق) من الفائدة. ضمان وجود الحد الأدنى من تعطيل لفافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الصور MEP لتبديل عقليا موقع وشكل المنطقة MEP على العضلات (ق). ملاحظة: A شعر علامة غرامة يمكن أن تساعد على إعادة إنتاج المنطقة MEP من صورة على العضلات (ق) من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الحقن متعددة على طول كامل المنطقة MEP (لالفلوري الذهب، 3-4 حقن 1-2 ميكرولتر كل لياليhould معها يكون كافيا). يمسح برفق العضلات (ق) لإزالة أي تسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب طرفي الجلد قطعي قريبة من بعضها البعض مع ملقط كليلة وإغلاق الجرح مع لقطات الجراحية. تسلل 0.1 مل بوبيفاكايين (0.5٪ في الماء) (أو التخدير الموضعي الأخرى) على طول فترة كاملة من الجرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل آلة التخدير قبالة ومراقبة الحيوانات حتى أنه قد تعافت تماما من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار لمدة 14 يوما بين إدارة الحقن داخل العضلات ونضح من الحيوانات. </li></ol> 3. Perfusions <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدارة جرعة قاتلة من حل الصوديوم بنتوباربيتون (على سبيل المثال Lethabarb، 150 ملغ / كلغ) للحيوان عن طريق الحقن داخل الصفاق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن كثب مراقبة الحيوانات حتى يتم التوصل إلى مستوى عميق من التخدير، وهو ما أكدته غياب انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان على ظهرها على لوحة تشريح وضعها فوق perfusioن الحوض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من ملقط مع قبضة الأسنان لرفع الجلد الذي يغطي قاعدة القص. جعل شق الجلد صغير مع زوج من مقص جراحي قوية مباشرة أسفل عظم القص ثم استخدام ملقط لقبضة الغضروف الخنجري من القص. في حين الضغط على الغضروف الخنجري، وتوسيع شق على جانبي تجويف الصدر، من القص إلى الآباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحجاب الحاجز لفضح القلب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 0.ml الهيبارين مباشرة في قمة القلب لمنع تخثر الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قمة للسماح للادراج قنية إلى البطين الأيسر، ومن ثم المشبك بسرعة قنية في مكان مع المعونة من haemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الأذين الأيمن مع زوج من مقص غرامة والبدء فورا مضخة تحوي. يروي مع 0.1 M PB حتى السائل المتدفق من الأذين نقدمه مجانا تقريبا من الدم ولون الكبد يصبح البني الفاتح. ثم، يروي مع المحاليلنشوئها من امتصاص العرق (4٪ في 0.1 M PB) حتى الجسم كله من الحيوان يصبح جامدة. </li></ol></li></ol> 4. الحبل الشوكي العنقي تشريح والتحضير للعلم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الذبيحة على البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد في خط الوسط في الجسم مع مشرط وتعكس ذلك من قاعدة الجمجمة إلى مستوى العظم الحرقفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع طريق وتعكس عضلات مجاورة للفقرة للكشف عن الجانب الظهري للعمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعريف العملية الشائكة العظمية أطلس، والجزء الثاني عنق الرحم (أي، C2)، وإزالته مع زوج من رينجرز الجراحية أو ملقط لتحديد الجذر الظهري المقابلة الكامنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد جذر C2 الصحيح من خلال تلوين مع علامة شعر دائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الفقرات التالية واحدا تلو الآخر، وعلامة على الجذور الظهرية اليمنى بالتناوب مع الألوان (أي، C2، C4، C6، وC8 يمكن أن تكون ملونة باللون الأخضر وC3، C5، C7، T1 يمكن أن يكون العقيدored باللون الأزرق). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إبرة جراحية صغيرة (على سبيل المثال، 30 G إبرة قياس) لبلطف بيرس خلال الجافية يغطي الطرف الأدنى من الحبل الشوكي. مع شطبة من الإبرة مواجهة، رفع الجافية بعيدا عن الحبل بينما تتحرك الإبرة rostrally لإجراء شق طولي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعكس الجافية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع عرضيا الحبل الشوكي إلى كتل واحد أو اثنين من القطاعات بشفرة مشرط جديدة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك شرائح النخاع الشوكي في الموقع، ولكل كتلة، وجعل بعناية علامة إيمانية صغيرة على الجانب الأيسر من كل كتلة مع منتصف الطريق شفرة المشرط بين اثنين من جذور المجاورة. تأكد من أن علامة إيمانية عميقة بما فيه الكفاية من خلال النسيج لتكون مرئية من الناحية البطنية من الكتل. جعل علامة إيمانية في زاوية ما يقرب من 45 درجة مئوية، لافتا سواء الأمامية أو الخلف فيما يتعلق تشريح الحيوان، للمساعدة في توجيه قطاع النسيج بعد تشريح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القطع الفردية في وزجاجات صغيرة علامات واضحة تحتوي على محلول بارافورمالدهيد (4٪ في 0.1 M PB) وترك في RT O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كتل في زجاجات نظيفة، وصفت بوضوح يحتوي على محلول السكروز (30٪ في 0.1 M PB) والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة يومين على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح في البرد قوالب وغطوها تجميد الأنسجة المتوسطة. لإعداد النسيجي الطولي، توجيه الكتل مع الجانب الظهري مواجهة واستخدام علامة إيمانية لتوجيه كتلة في البرد قوالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد البرد قوالب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، وقطع مع ناظم البرد في 50 أقسام ميكرومتر سميكة. ملاحظة: المقاطع يمكن تركيبه مباشرة على شرائح المجهر التصاق وتترك لتجف O / N. بدلا من ذلك، المقاطع يمكن طرح في لوحات 48-جيدا مليئة 0.1 M PB والتي شنت في وقت لاحق باستخدام علامة إيمانية لتوجيه أقسام الأنسجة على الشرائح. </li></ol> 5. قطني العمود الفقري المشاركطريق تشريح والتحضير للعلم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الذبيحة على انها الظهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق خط الوسط على طول البطن من الحيوان وإزالة الأحشاء. تشريح خارج عضلات جدار البطن الخلفي لفضح الجانب البطني من العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع القصير الذيلية الأكثر الصدري والمجاورة T13 فقرة لها حيث يخرج الجذر البطني T13 العظام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على التوالي إزالة واحدا تلو الآخر منقاري اثنين أو ثلاثة فقرات لT13 (أي، T12، T11، وإذا لزم الأمر، T10) مع رينجرز الجراحية الدقيقة لمتابعة الجذر البطني T13 حتى نقطة دخوله في الجانب البطني من الحبل البطني و وضع علامة عليه مع علامة شعر دائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من هذه النقطة، كرر نفس الإجراء لتحديد مكان وجود نقاط الدخول جذر بطني لL1، L2، L3، L4، L5، L6 وS1، والتلوين لهم بالتناوب مع الألوان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإجراء نفسه كما هو موضح في القسم 4،5 حتي 4،10 للومشريط تشريح الحبل الشوكي. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model.">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li><li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease.">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li><li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li><li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li><li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression.">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li><li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).</li><li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li><li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1/2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy).">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li><li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice).">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li><li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy.">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li><li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model.">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS.">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li><li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice.">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li><li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., B&#252;eler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2.">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li><li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS.">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li><li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles.">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport.">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+Alternative+energy+for+neuronal+motors.">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li><li>Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study.">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li><li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb:+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin.">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li><li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb.">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li><li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons.">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58 (2013).</li><li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li><li>Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

استهداف العضلي ونقل إلى الوراء لاحق من الجينات المحورة العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α لعلاج تجريبي للحالة العصبية والعضلية ليست استراتيجية جديدة. على سبيل المثال، تم استخدام هذا الأسلوب تسليم تأخير الضمور العضلي العصبي في مراحل مختلفة من تطور الم?...

فقدان السيطرة على حركة الطوعية التي تنتج من الحالات العصبية مثل مرض العصبون الحركي وspinal- وكذلك دوشين ضمور العضلات هو شرط المنهكة التي لديها تأثير دائم عالية وطويلة على الحياة كل يوم من الأفراد المتضررين. على مدى العقد الماضي، الجهود البحثية التي تهدف إلى وقف أو على الأقل تأخير الآثار الضارة لهذه الأمراض العصبية والعضلية وكانت أولوية بالنسبة لكثير من الأطباء والعلماء في جميع أنحاء العالم. وفي هذا الصدد، فإن الجيل الأخير من النماذج الحيوانية التي تحاكي هذه الأمراض العصبية والعضلية دورا أساسيا في الحصول على رؤى أساسية في آليات الفسيولوجية الكامنة وراء تطور وتقدم هذه الشروط 13/01. علاج هذه الأمراض العصبية والعضلية تتطلب الوصول المباشر إلى الحبل الشوكي ويمكن أن يتحقق عن طريق الحقن في النخاع الشوكي 14،15. واستهدفت التطورات الحديثة في مجال العلاج الجيني أيضا العضلات المخططة العليا والأطراف السفلية لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α التي تقع داخل القرن البطني للنخاع الشوكي 1،9-13. ومع ذلك، فقد فشلت هذه الاستراتيجية مرة واحدة واعدة لتحسين نتائج هذه الظروف العصبية. في حين أنه من الإنصاف أن نستنتج أن هذه النتائج السيئة يمكن أن يكون، جزئيا على الأقل، أن يعزى إلى انخفاض فعالية هذه الجينات الواقية، لا يمكن استبعاد فعالية منخفضة من هذه الأساليب توصيل الجينات. لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق المتخصصة التابعة للmyofibres الهيكل العظمي التي يتم تحريكها من قبل المحطات محور عصبي من الألياف الحركية المحيطية الكبيرة القادمة من α الخلايا العصبية الحركية. معا، والنهايات الطرفية الألياف العصبية وأعضاء البرلمان الأوروبي تشكل الوصل العصبي العضلي، أي الموقع حيث يتم تشغيلها النبضات متشابك من قبل الافراج تقدمي من الناقل العصبي، الأستيل كولين. الأهم، والعلاقة بين الألياف العصبية الطرفية وأعضاء البرلمان الأوروبي هي ثنائية المباشرهtional، على الرغم من أن محركات مختلفة هي المسؤولة عن نقل الجزيئات وعضيات نحو وكذلك بعيدا عن العصبية somata 16-18. في ضوء هذه الاعتبارات التشريحية، ويبدو أن أعضاء البرلمان الأوروبي أن تكون الأهداف المفضلة للتسليم ونقل إلى الوراء لاحق من المادة الوراثية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة. في هذا السياق، فإنه ليس من المستغرب أن نجاح العصبون الحركي تنبيغ يعتمد إلى حد كبير على المسافة بين الحقن العضلي من ناقلات فيروسية وأعضاء البرلمان الأوروبي في العضلة 19-20. والمثير للدهشة، ومع ذلك، فإن الموقع الدقيق للمناطق MEP على myofibres من الفئران المخبرية والماوس، وهما نوعا من خيار لنموذج الأمراض العصبية والعضلية، لم تكن متاحة حتى وقت قريب. أنتجنا خرائط شاملة للمنطقة MEP لعدة عضلات forelimb في الفئران والفأر 21-22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أظهرنا تفاصيل تنظيم ص MEPegion لعدة عضلات hindlimb الماوس 23 ونحن في صدد تحليل ملامح البرلمان الأوروبي على hindlimb الفئران. في أيدينا، أعطى الحقن في العضل من استشفاف الوراء الموجهة إلى مناطق MEP بأكملها في هذه العضلات يؤدي إلى الخلايا العصبية الحركية أكثر المسمى التي تغطي قطاعات الحبل الشوكي أكثر مما ذكر سابقا. هنا نقدم البروتوكول الذي تم تطويره على مدى السنوات القليلة الماضية للكشف عن مكان وجود أعضاء البرلمان الأوروبي على السطح الخارجي، وكذلك في جميع أنحاء عمق hindlimb وforelimb العضلات في كل من الفأر والجرذ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

الأمراض التي تؤثر على سلامة الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي هي من بين الحالات العصبية الأكثر إضعافا. على مدى العقود الماضية، وقد وفرت تطوير عدة نماذج حيوانية من هذه الاضطرابات العصبية والعضلية المجتمع العلمي مع سيناريوهات العلاجية المختلفة التي تهدف إلى تأخير أو عكس تطور هذه الشروط. من خلال الاستفادة من آلية الوراء من الخلايا العصبية، واحدة من هذه الطرق كان لاستهداف عضلات الهيكل العظمي لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي المقابلة. على الرغم من مرة واحدة واعدة، وقد أعاق نجاح نهج تسليم هذا الجين من قبل عدد دون المستوى الأمثل من الخلايا العصبية الحركية transduced فقد أظهرت حتى الآن أن تحقق. لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق متخصصة للغاية على الجهاز العضلي والهيكل العظمي التي هي على اتصال مباشر متشابك إلى الحبل الشوكي α الخلايا العصبية الحركية. في هذا الصدد، من المهم أن نلاحظ أنه حتى الآن، والجهود المبذولة لretrogradelyوقدمت الجينات نقل إلى الخلايا العصبية الحركية من دون الإشارة إلى موقع المنطقة MEP في العضلات المستهدفة. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيطة 1) للكشف عن الموقع الدقيق للأعضاء البرلمان الأوروبي على سطح عضلات الهيكل العظمي و2) لاستخدام هذه المعلومات لتوجيه تسليم العضلي واللاحق النقل إلى الوراء الأمثل لاستشفاف الوراء في الخلايا العصبية الحركية. نأمل الاستفادة من نتائج هذه التجارب تتبع في إجراء المزيد من الدراسات إلى التحقيق النقل إلى الوراء من الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الحبل من خلال استهداف أعضاء البرلمان الأوروبي.

أستيل تلطيخ النسيجية يكشف موقع لوحات نهاية المحرك عبر عرض عضلات الشكل 1 يوضح نتائج هذا تلطيخ أجريت على الفئران forelimb كله. ويقترح لتحسين تركيز المحلول كبريتيد الأمونيوم (على سبيل المثال، 5-7٪ بدلا من 10٪)، وكذلك في وقت مغمورة العينة في حل إذا كان تلوين الخلف?...

Watch this Scientific Journal Video about Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons at JoVE.com

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

الحقن في العضل وإلى جانب لوحات السيارات نهاية: نهج المناظير لمكوك الراسمات مباشرة إلى الخلايا العصبية للسيارات

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Video: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

تحديد الخلايا العصبية الحركية خارج الخلية لعضلة حمام سباحة للسيارات في<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

تقنيات الحد الأدنى الغازية لحقن الفئران في العصب البصري

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

التصور من محور الإسقاط نمط من الخلايا العصبية المحرك الجنينية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

النهج بالمنظار اندوناسال ترانس-سفينويدال: الجراحات لاورام الغدد النخامية

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

تتبع نيورواناتوميكال إلى الوراء للخلايا العصبية الحركية فرنك في الفئران

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

تعديل غير الغازية ورسم الخرائط الروبوتية من القشرة الحركية في الدماغ النامية

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

ثلاثي الأبعاد موتور العصب الجهازية جيل

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...