باستخدام بروتوكولنا ، يمكننا تصور وتقييم كمي لديناميكيات إشارات الإندوسومات والميتوكوندريا داخل المحاور العصبية من الخلايا العصبية الحركية والحسية للفئران الحية المخدرة. هذه الطريقة التي يمكن استخدامها لفهم الفسيولوجيا القاعدية للمحاور العصبية في الجسم الحي والكشف عن آلية مرضية مهمة تقود التنكس العصبي المحيطي في نموذج الفأر للمرض. يمكن استخدام تقنيتنا لتقييم تأثير العلاجات المحتملة مثل العوامل الدوائية والعلاجات الجينية على النقل المحوري في الخلايا العصبية الحركية والحسية الحية.
يمكن استخدام هذه التقنية لتصوير عضيات مختلفة في وقت واحد في محور عصبي محيطي معين ونقل دراسة نماذج الأمراض الحركية وكذلك الشيخوخة. ابدأ الاستعدادات عن طريق سحب ماصة زجاجية متدرجة للحصول على الحقن العضلي الأمثل في العضلات الأصغر. بالنسبة للجراحة ، قم بتأمين ستارة جراحية معقمة على حصيرة حرارية مضبوطة على 37 درجة مئوية ووضع المجهر التشغيلي وتركيزه.
ثم قم بتفريغ جميع الأدوات والأدوات الجراحية المطلوبة كما هو موضح في المخطوطة. عند الانتهاء من الاستعدادات ، انقل الفأر المخدر إلى لسان الحال الموجود في منطقة منفصلة من المساحة الجراحية وتأكد من غياب كل من ردود فعل سحب القرنية والدواسة قبل حلق الفراء من المنطقة الجراحية. ثم قم بإزالة الفراء الحليق من الماوس باستخدام الجانب اللزج من الشريط الجراحي.
بعد ذلك ، ضع الماوس على موازين الوزن لتسجيل الوزن قبل الجراحة. ثم ، استخدم قطعة قطن لتطبيق مواد تشحيم العين ونقل الماوس ولسان الحال إلى المنطقة الجراحية. لحقن الظنبوب الأمامي ، أو عضلة TA ، ضع الماوس على الظهر ومد الطرف الخلفي عند 10 درجات من خط الوسط.
عندما يكون الطرف الخلفي في الموضع الصحيح ، ضع شريطا جراحيا عبر القدم. قم بتعقيم المنطقة المحلوقة باستخدام محلول إيثانول بنسبة 70٪ أو ما يعادله. ارسم الجزء غير السام العامل من محلول الكزاز أو السموم العصبية أو HcT في ماصة زجاجية مسحوبة.
بعد ذلك ، قم بعمل شق صغير فوق العضلات ذات الأهمية في المنطقة التي تتوافق مع مناطق المحرك واللوحة. ثم. اخترق اللفافة الخارجية على العضلات لحقن HcT. اترك الماصة الدقيقة في موضعها لمدة خمس إلى 10 ثوان قبل الانسحاب ببطء.
بعد الحقن ، أغلق الشقوق بغرزة إلى غرزتين. ثم انقل الماوس إلى قفص استرداد معزول تحت الملاحظة لمدة 30 دقيقة. استعد لفضح العصب الوركي عن طريق ترتيب الأدوات والأدوات الجراحية حول المنطقة الجراحية.
قم بإنشاء إسفين عن طريق قطع البارافيلم إلى مستطيل ضيق بعرض سنتيمتر واحد مع طرف بزاوية للمساعدة في عملية التصوير. بمجرد الانتهاء من الاستعدادات ، انقل الماوس إلى لسان حال في المنطقة الجراحية واستخدم الشريط الجراحي لتأمين الرأس إلى لسان الحال. قم بتمديد وتأمين الطرف الخلفي المستهدف عند 45 درجة من خط الوسط باستخدام شريط جراحي.
إذا كانت ردود فعل انسحاب القرنية والدواسة غائبة ، فقم بقطع الجلد الذي يغطي العصب الوركي باستخدام المقص. ثم قم بإزالة عضلة الفخذ ذات الرأسين والعضلات أو النسيج الضام دون الإضرار بالعصب الوركي والأوعية الدموية. عندما يتعرض العصب الوركي السليم بما فيه الكفاية ، ضع محلول ملحي معقم تم تسخينه مسبقا على المنطقة المحيطة بالعصب الوركي لمنع الجفاف.
بعد ذلك ، استخدم ملقط منحني لتعطيل النسيج الضام العميق ووضع إسفين البارافيلم المعد مسبقا تحت العصب. ضع الصوف القطني المنقوع بمحلول ملحي على المنطقة المكشوفة قبل تحريك الماوس فوق حصيرة الحرارة في غرفة الحث المليئة بالأيزوفلوران والأكسجين. للتصوير ، ضع زجاج غطاء 22 × 64 ملم على مرحلة المجهر المخصصة وقم بتأمين موضع زجاج الغطاء بشريط.
بعد تطبيق زيت الغمر على الهدف ، قم بتوصيل مرحلة المجهر بالمجهر المقلوب وارفع ببطء الهدف المغمور بالزيت للاتصال بزجاج الغطاء. عندما يكون الإعداد جاهزا ، قم بتأمين لسان حال التخدير على مرحلة المجهر باستخدام الشريط. ثم ، قم بإزالة الصوف القطني من العصب الوركي ونقل الماوس من غرفة الحث إلى لسان حال مع العصب المكشوف الذي يواجه زجاج الغطاء.
قم بتثبيت رأس الفأر على لسان حاله ، ومع الحفاظ على أدنى مستوى كاف من التخدير ، ارفع الماوس برفق من ذيله لإضافة محلول ملحي معقم إلى انزلاق الغطاء بالقرب من العصب الوركي المكشوف. بمساعدة المناظير ، حدد موقع العصب الوركي لتحديد النقطة البؤرية المثلى وحدد منطقة الاهتمام التي تحتوي على عضيات محورية متحركة. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى برنامج الكمبيوتر بالنقر فوق الزر "استحواذ" وتحديد مجال اهتمام.
استخدم التكبير/التصغير الرقمي للحصول على تكبير 80 ضعفا وتدوير المساحة المحددة لتصور المحاور أفقيا انقر فوق المربع المناطق وحدد منطقة مستطيلة الاهتمام. في وضع الاستحواذ، اضبط حجم الإطار على الحد الأدنى من 1024 × 1024 بكسل وابدأ في اكتساب الفاصل الزمني من 100 إلى 1000 إطار. التقط ما لا يقل عن 10 شحنات متحركة من المحاور الثلاثة لكل ماوس.
في الدراسة ، تم تحقيق وضع العلامات على المحور العصبي الحركي في الجسم الحي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا. لوحظ بروتين الإزهار الأخضر المحسن ، أو تعبير eGFP ، في محاور المحرك الكوليني من ChATitat الحي المخدر. ماوس eGFP.
مع الطريقة البديلة ، تعبير tdTomato في عصب تم استئصاله حديثا من ChAT. تم تحقيق فأر tdTomato دون معالجة الأنسجة الإضافية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد المحاور العصبية عن طريق حقن المقتفيات أو العلامات مثل HcT أو الفيروسات الغدية التي تشفر eGFP في العضلات الهيكلية.
يوضح التحليل التمثيلي سلسلة صور الفاصل الزمني التي تمثل في الجسم الحي النقل المحوري للإشارات endosomes في الخلايا العصبية الحركية الحية ل HB9. فأرة GFP. كان لدى GFP نمط أكثر دقة في HB9.
محاور GFP. تربية ميتو. الفئران CFP مع ChAT.
مكنت الفئران tdTomato من تصور الميتوكوندريا في محاور المحرك. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تحديد عقدة رانفييه. حقن HcT في عضلات ميتو.
سمحت فئران CFP بالتصور المتزامن للإشارات الداخلية والميتوكوندريا داخل نفس المحاور العصبية في الجسم الحي. لوحظت عضيات تتحرك بشكل أمامي ورجعي ، وكذلك عضيات متوقفة. يعد تقليل التخدير أثناء عملية التصوير مفيدا لأنه يمكن أن يحد من تأثير التحف الكبيرة للتنفس ، وبالتالي تبسيط تتبع وتحليل النقل المحوري.
يمكن أن تكون الأعصاب الوركية مفيدة لتحليل الحمض النووي الريبي والبروتين لربط ديناميكيات العضيات بالمكونات الرئيسية لآلات النقل المحورية ، مثل البروتينات الحركية والمحولات الخاصة بالبضائع.
