الكتاب أشكر جورجيو كرليني للدعم الفني في تطوير بنية الحبس وDOTT. أورنيلا LoBrutto لمراجعة شاملة للمخطوطة. تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج بتمويل من البرنامج الإطاري ال 7 للاتحاد الأوروبي (ICT-FET FP7 / 2007-2013، FET يونغ مخطط المستكشفين) بموجب اتفاقية منحة 284772 BRAIN BOW (www.brainbowproject.eu).

وتمت الموافقة على بروتوكول تجريبي بموجب التشريع الأوروبي رعاية الحيوان (2010/63 / EU)، من قبل وزارة الصحة الإيطالية وفقا للDL 116/1992 وفقا للمبادئ التوجيهية للجامعة جنوى (بروت. N. 13130، مايو 2011). تم بذل كل الجهود للحد من عدد الحيوانات للمشروع والتقليل من معاناتهم. 1. إعداد المواد ويدعم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء قالب لبناء PDMS (بولي ميثيل-Siloxane) القيد عن طريق CNC (الكمبيوتر التحكم العددي) آلة الطحن. ويتحقق هذا العفن في البولي مع الاسطوانة المركزية في تترافلوروإيثيلين (PTFE). هذه المواد يسمح لاستخراج أسهل من القناع مرة واحدة وقد تصلب PDMS. ملاحظة: تصميم القالب تم يؤديها بمساعدة الحاسوب التصميم (CAD) ومن ثم تسليمها إلى آلة طحن CNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المطاط الصناعي PDMS. PDMS هو بوليمر عضوي. وهو يتألف من عنصرينوكيل علاج والبوليمر. مزجها من قبل نسبة حجم 01:10، جزء واحد من وكيل علاج وتسعة أجزاء من البوليمر. وضع هذين العنصرين في طبق بيتري، ويهز إدراج المزيج في فراغ الغرفة لمدة 10 دقيقة للقضاء على فقاعات الهواء. 3 غرام من PDMS كافية لعقبة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء القيد PDMS. إدراج مادة PDMS في أبلى ووضعها في الفرن لمدة 30 دقيقة في 120 درجة مئوية. القيد PDMS ديه على شكل اسطوانة مثالية مع القطر الخارجي والداخلي 22.0 و 3.0 ملم على التوالي وارتفاع 650 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من الطلاء، واثنين من قناع لمنطقة نشطة من المصفوفات الدقيقة الكهربائي (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) عن طريق منتاش تحت stereomicroscope وتعقيم قناع PDMS في الفرن على 120 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم بلي زجاجي دقيق (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة قطر متوسط ​​42.3 ± 1.1 ميكرون) في 70٪ من الإيثانول لمدة 2 ساعة في قارورة المخروطية وتدوير EVريها 30 دقيقة للكشف عن بلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الإيثانول من القارورة وشطف بلي مرتين بالماء المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرط الجزء المركزي من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا محددة بواسطة قناع PDMS (قطر يساوي 3.0 مم) مع 24 ميكرولتر من محلول خليط من بولي-D-ليسين و laminin في 0.05 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف بلي مع بروتينات الالتصاق، Laminin وبولي-D-ليسين في 0.05 ميكروغرام / مل وترك لهم بين عشية وضحاها في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، للحصول على الشبكة العصبية مستقرة وطويلة الأمد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عوامل التصاق كلا من السطح الزجاجي لMEA ومن بلي زجاجي دقيق. نضح ما يقرب من 95٪ من الحل طلاء مع ماصة وتطبيق volume- صغيرة 24μl- من الماء المعقم على سطح MEA. نضح مرة أخرى أكثر من 95٪ من المياه، والسماح للMEA الجافة تحت غطاء محرك السيارة الصفحي لمدة 1 ساعة قبل طلاء الخلايا. ملاحظة: في حالة بلي بدلا من ذلك، نضح طلاءحل وجعل غسل الأولى مع الماء المعقم وثانية واحدة مع المتوسط ​​القاعدية وملحقها مثل B27، من أجل تلطيف سطح الزجاج حيث سيتم مطلي الخلايا العصبية. لا تدع بلي الجافة. تركها في تعليق في مستنبت داخل القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع، عن طريق ماصة -200 μl-، تعليق بلي المعالجة (حوالي 32،000) على طبق من ذهب multiwell مع إدراج غشاء (المسام قطرها 0.4 ميكرون) حيث سيتم تجميع الذاتي تشكيل طبقة موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من الغشاء مع 0.5 مل من المتوسط ​​وضعه في الحاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) حتى الخلايا العصبية على استعداد لتكون مطلية (3.2). </li></ol> 2. تشريح الأجنة وتفكك النسيج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيت الكبار إناث الفئران (200-250 ز) في درجة حرارة ثابتة (22 ± 1 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (50٪) في إطار جدول زمني للضوء الظلام العادي (الضوء على 07:00 حتي 07:00) فيمنشأة الحيوان. ضمان أن المواد الغذائية وهي المياه المتاحة بحرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران الإناث الحوامل بعد 18 يوما من وضع (E18) باستخدام 3٪ الأيزوفلورين. ثم، التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحصين من كل جنين فأر ووضعها في محلول ملحي متوازن الجليد الباردة هانك دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+. في يوم 18 من الحصين التنمية وأنسجة القشرة لينة جدا ولست بحاجة إلى أن تقطع الى قطع صغيرة. مزيد من التفاصيل يمكن الاطلاع على 18،19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الأنسجة في 0.125٪ من حل التربسين / هانك تحتوي على 0.05٪ من الدناز عن 18-20 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل طاف مع ماصة باستور ووقف الهضم الأنزيمي بإضافة المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة مع FBS ويغسل مرة واحدة مع المتوسط ​​مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل. إزالة مرة أخرى على المدى المتوسط ​​مع نقطة باستورETTE وإعادة ملء مرة أخرى مع كمية صغيرة (500 ميكرولتر) من متوسط ​​النمو مع ملحقها، 1٪ L-الجلوتامين، جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل بيليه الأنسجة ميكانيكيا مع ماصة باستور الضيقة حتى تعليق حليبي الخلايا هو واضح. ليس من الضروري أن أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع كمية صغيرة من تعليق الخلية مع متوسط ​​النمو للحصول على الحجم النهائي من 2.0 مل. عد تركيز الخلوية التي تم الحصول عليها مع غرفة عدادة الكريات. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة من 600-700 خلية / ميكروليتر. </li></ol> 3. خلية التصفيحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة حوالي 2000 خلية / ملم 2 على منطقة نشطة للMEA، التي يحددها القيد PDMS لإنشاء شبكة العصبية 2D. ملاحظة: كل الحصين يحتوي على حوالي 5 × 10 5 خلايا (1 × 10 6 لجنين واحد). تشريح 6 الأجنة للحصول على المبلغ الإجمالي لل6 × 106 الخلايا في 2 مل، وتركيز قدر من 3000 خلية / ميكرولتر. تمييع هذا التركيز في 1: 5 من أجل الحصول على تركيز الخلية المطلوبة وصفيحة حول 600-700 خلية / ميكروليتر. إذا كانت المنطقة MEA محدد بواسطة القيد PDMS حوالي 7.065 مم 2، والعدد الكلي للخلايا مطلي 600 خلية / ميكرولتر × 24 ميكرولتر = 14،400 الخلايا، وكثافة الأخيرة من 2038 خلية / ملم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أجهزة MEA في حاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع 160 ميكرولتر من تعليق مع تركيز خلية من خلايا 600-700 / ميكرولتر (حوالي 100،000 الخلايا) على سطح أحادي الطبقة بلي المتمركزة داخل لوحات multiwell لاستكمال خطوة تمهيدية لبناء ثقافة ثلاثية الأبعاد. وضع لوحات multiwell في الحاضنة مع ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية. </li></ol> البناء 4. 3D الشبكة العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6-8 ساعة بعد الطلاء، ونقل تعليق (بلي مع الخلايا العصبية) من لوحات multiwell بعناية فائقة داخل منطقة محددة من قبل القيد PDMS باستخدام ماصة مجموعة لحجم حوالي 30-40 ميكرولتر. بعد كل عملية تحويل، الانتظار لمدة نصف دقيقة، للسماح للبلي في التجمع الذاتي في هيكل مدمج سداسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إيداع جميع الطبقات وعفوية تجميعها، إعادة ملء مع انخفاض كبير حوالي 300 ميكرولتر من المتوسطة الجزء العلوي من منطقة محددة من قبل القيد PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع هيكل 3D بالإضافة إلى MEA في حاضنة (T = 37.0 درجة مئوية، CO 2 = 5٪) لمدة 48 ساعة قبل أن يضيف الحجم النهائي (حوالي 1 مل) من النمو مستنبت مع ملحقها. ملاحظة: النظر في عدد من الخرز على لوحات multiwell مع إدراج غشاء (30000) وعدد من الخرز على طبقة واحدة على الجهاز MEA (6000). ويتكون هيكل 3D الناتجة من 5 طبقات من ميلcrobeads والخلايا. مع الأخذ بعين الاعتبار أن الشبكة العصبية 3D ليست مثالية هندسيا، يمكن أن يتألف هيكل 3D الناتجة من 5-8 طبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم بعد الطلاء، إضافة إلى الحجم النهائي من المتوسط ​​(حوالي 900 ميكرولتر) داخل الحلبة MEA بعناية. الحفاظ على الثقافات 3D في ترطيب CO 2 الغلاف الجوي (5٪) عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 أسابيع. استبدال نصف المتوسط ​​مرة واحدة في الأسبوع. </li></ol> 5. متحد البؤر المجهري شراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح العينات البيولوجية إلى مرحلة المجهر في حامل. ضبط الليزر (الأرجون، 496-555 نانومتر)، وسرعة المسح الضوئي (400 هرتز) الذي لالتقاط الصور، وكسب وتعويض (-0.3٪) من PMT لكل صورة لالتقاط الصحيح مرشح الانبعاثات وعرض النطاق الترددي من أجل لتجنب التشبع وزيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تقارير قسم النتائج والقيم المستخدمة للحصول على الصور من الشكل 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاقتناء ض -stack تسلسل، والتنوبالحادي وتحديد، وقيمة موقف Z من أعلى وأسفل طبقة من العينة، ثم حدد حجم الخطوة إلى جعل عملية الاستحواذ. </li></ol>

<ol>
	<li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multi-electrode+arrays.">Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays.</a> Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).</li><li>Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+timed+spatiotemporal+patterns+of+neural+activity+in+dissociated+cortical+cultures.">Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures.</a> Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).</li><li>Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectronic+system+for+high-resolution+mapping+of+extracellular+electric+fields+applied+to+brain+slices.">Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).</li><li>Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microdrop+delivery+system+for+neuronal+network+patterning+on+microelectrode+arrays.">An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays.</a> J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).</li><li>Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture.">Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front. Neuroeng. 4, (2011).</li><li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device.">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J. Neural. Eng. 9, (2012).</li><li>Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering+and+biohybridized+microsystems+for+neurobiological+investigation+in+vitro+(Part+1).">Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1).</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Bursting+in+Cortical+Cultures+with+Closed-Loop+Multi-Electrode+Stimulation.">Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation.</a> J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).</li><li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix.">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).</li><li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering:+strategies+for+repair+and+regeneration.">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+stem+and+progenitor+cell+differentiation+into+functional+neuronal+circuits+in+three-dimensional+collagen+gels.">CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels.</a> Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).</li><li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton.">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue En. 13, 473-482 (2007).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+state+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).</li><li>Schuz, A., Palm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+of+neurons+and+synapses+in+the+cerebral+cortex+of+the+mouse.">Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).</li><li>Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloid-guided+assembly+of+oriented+3D+neuronal+networks.">Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks.</a> Nat. Method. 5, 735-740 (2008).</li><li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures:+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology.">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci. Rep. 4, (2014).</li><li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue.">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cell. , (1998).</li><li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+culture,+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+Micro-electrode+arrays+(MEAs).">How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs).</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li><li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications.">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li><li>Crompton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polylysine-functionalised+thermoresponsive+chitosan+hydrogel+for+neural+tissue+engineering.">Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering.</a> Biomaterial. 28, 441-449 (2007).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+engineered+neural+networks+coupled+to+Micro-Electrode+Arrays:+Development+of+an+innovative+in-vitro+experimental+model+for+neurophysiological+studies.">3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies.</a> , 957-960 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

في هذا العمل، وهو تجريبية جديدة في منصة المختبر تتكون من 3D هندستها الثقافات العصبية بالإضافة إلى تم تقديمه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لشبكة الكهربية. وقد تم استخدام بلي كما سقالة للسماح ثمرة التهاب الأعصاب على طول ض -axis مصممة لتكون متكاملة مع M...

في المختبر ثنائية الأبعاد (2D) الشبكات العصبية بالإضافة إلى مايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) arethe نموذج تجريبي الذهب القياسية المعتمدة لدراسة التفاعل بين الديناميات العصبية والربط الأساسي. خلال تطوير وإعادة الخلايا العصبية الشبكات المعقدة التي تعرض جيدا definedspatio-temporalpatternsof النشاط 1،2 (أي رشقات نارية، رشقات نارية الشبكة، والنشاط ارتفاعه عشوائي). الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسجل النشاط الكهربية من العديد من المواقع (من عشرات الآلاف من الميكروية)، والسماح لتحقيق مفصل لديناميات أعرب على مستوى الشبكة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الثقافات فصلها يجعل المحتملة التي لتصميم الشبكات الهندسية. فمن الأسهل للفهم بهذه الطريقة العلاقات الوظيفية بين النشاط الكهربية تسجيلها والمعلمات من تنظيم الشبكة مثل كثافة الخلية 3، ودرجة نمطية 4،5، وجود غير متجانسة البوب ​​العصبيةulations 6، وما إلى ذلك، تقوم كل الدراسات في المختبر على خلايا المستزرعة نأت على 2D الشبكات العصبية. هذا النهج يؤدي إلى التبسيط فيما يتعلق (في جوهرها 3-الأبعاد، 3D) نظام في الجسم الحي: (ط) في 2D هي بالارض نموذج، somata والنمو الأقماع وثمرة المحاور-التشعبات لا يمكن أن تنتشر في كل الاتجاهات 7. (ب) نمطية 2D في المختبر شبكات المعرض ديناميات الكهربية التي تهيمن عليها تنفجر نشاط يشمل معظم الخلايا العصبية للشبكة 8. مؤخرا، تم وضع حلول مختلفة للسماح للبناء في المختبر فصل 3D الشبكات العصبية. تتكون فكرة مشتركة في خلق سقالة حيث يمكن للخلايا العصبية تنمو بطريقة 3D. لا يمكن أن تتحقق هذه سقالة مع المواد الهلامية البوليمر والمصفوفات التي يسهل اختراقها الصلبة 13/09. من خلال استغلال الخواص الميكانيكية للبوليمرات، فمن الممكن تضمين الخلايا داخل تساهياكل البريد عن طريق تحديد كتلة موحدة من الثقافات 3D من neurospheres 11. الميزة الرئيسية لهذا النهج هي ملك الميكانيكية الصارمة للneurospheres 9،12. ومع ذلك، فإن هذه المواد المسامية محدودة، وأنها لا نضمن هجرة الخلايا داخل المصفوفة. للتغلب على هذا العائق، حلا ممكنا يتكون تشريح المصفوفة إلى &#39;وحدة&#39; وحدات في. لسوء الحظ، يمكن أن حجم وشكل تنوع الجسيمات تعوق التعبئة في الهياكل الطبقات العادية. في 7، كولين وزملاء العمل بتصميم بناء الخلايا العصبية 3D تتكون من الخلايا العصبية و / أو النجمية ضمن الخلية سقالة القائم على المصفوفة النشطة بيولوجيا. هذه الأنسجة العصبية المهندسة سمحت في التحقيقات المختبر لدراسة ومعالجة استجابات العصبية الحيوية داخل البيئات الصغرى 3D. يتكون هذا النموذج من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية توزع في جميع أنحاء المصفوفة خارج الخلية (ECM) و / أو السقالات هيدروجيل (500-600 ميكرون سميكة). في هذا التعاونتم العثور على ndition، وبقاء الخلية المثلى (أكبر من 90٪) من خلال طلاء الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائية حول 3750 - 5000 خلية / ملم 3. وتجدر الإشارة إلى أن هذه القيمة كثافة أقل بكثير من واحد في حالة في الجسم الحي، حيث الكثافة خلية من خلايا القشرة مخ الفأر حوالي 90000 خلية / ملم 3 14. للتغلب على هذا القيد Pautot وزملاء العمل 15 حققت 3D في المختبر نظام حيث يتم التحكم في كثافة الخلايا والاتصال بالشبكة تشبه في ظروف الجسم الحي في حين تمكن في الوقت الحقيقي التصوير من الشبكة. عمليا، يقوم هذا الأسلوب على مفهوم فصل الخلايا العصبية مثقف هي قادرة على النمو على بلي السيليكا. توفر هذه الخرز سطح نمو كبيرة بما يكفي لأجسام الخلايا العصبية على الالتزام وarborizations على النمو، وناضجة، تمديد، وتحديد الاتصالات متشابك على الخلايا العصبية الأخرى. هذا الأسلوب يستغل خصائص التجمع العفوي من الخرز فرقت أحادية لFOالطبقات جمهورية مقدونيا 3D صفائف سداسية تحتوي على مجموعات فرعية متميزة من الخلايا العصبية في طبقات مختلفة مع اتصال مقيدة بين الخلايا العصبية في حبات مختلفة. كانت كثافة الخلايا التي تحققت مع هذا الأسلوب عن 75000 خلية / مم 3. في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت طريقة Pautot في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 16: وتظهر النتائج أن النشاط الكهربية 3D يعرض ذخيرة واسعة من الأنشطة من واحد التي أعربت عنها الشبكات 2D. ثقافات ناضجة 3D يحمل ديناميكية معززة فيه كل انفجار شبكة وعشوائي تصاعد النشاط جنبا إلى جنب. وبالمثل، تانغ Schomer وزملاء العمل 17 أدرك سقالة مسامية على البروتين والحرير الذي يحافظ على الثقافة القشرية الأولية في المختبر لعدة أشهر، وسجلت النشاط الكهربية عن طريق التنغستن القطب. في هذا العمل، والإجراءات التجريبية لبناء الشبكات العصبية 3D بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويمكن وصفها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>0.05 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>0.05 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td align="left">0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td>0.05% diluted&#160; in Hanks solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td>2% medium supplent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-2442</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax-I&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G.1272</td>
			<td>5mg/liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)</td>
			<td>Corning Sigma</td>
			<td>481939</td>
			<td>curing agent and the polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Electrode Arrays</td>
			<td>Multi Channel Systems (MCS)</td>
			<td>60MEA200/30-Ti-pr</td>
			<td>MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 &#181;m, respectively; plastic ring without thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead</td>
			<td>Distrilab-Duke Scientific</td>
			<td>9040</td>
			<td>&#160;1gr Glass Part.Size Stds 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Costar Sigma</td>
			<td>CLS 3413</td>
			<td>multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>14175-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>430935-5G</td>
			<td>polytetrafluoroethylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>Wistar Rat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy Upright</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20.0x0.50 WATER objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica HCX APO L U-V-I&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40.0x0.80 WATER objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica HCX APO L U-V-I&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25.0x0.95 WATER objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX IRAPO L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interfacing 3d engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

. في هذا الإجراء التجريبي، لعبت دورا ذات الصلة من قبل بلي التي تحدد سقالة الميكانيكية لنمو الشبكة العصبية 3D أرقام 1A و B عرض الترتيب من بلي (القطر الاسمي من 40 ± 2 ميكرون، شهادة يبلغ متوسط ​​قطر 42.3 ± 1.1 ميكرون) في الطائرة. خصوصية هذه الهياكل هي أن بلي عفويا التجمع ...

Watch this Scientific Journal Video about Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model at JoVE.com

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج تجريبي

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

interfacing-3d-engineered-neuronal-cultures-to-micro-electrode-arrays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

9.9K Views.  University of Genova. In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Video: Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker، نهجا مبتكرا لتحليل الآلي المحرك للعين

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

إجراء لغرس صالحة المنظمة من Microwires للتسجيلات واحدة وحدة في استيقظ، تتصرف الحيوانات

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

العصبية آخر نشر في إعداد الحصين تكشفت مع اختراق الصغرى، والقطب صفيف

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...