המחברים מודים ג&#39;ורג&#39;יו Carlini לתמיכה הטכנית בפיתוח מבנה הכליאה וdott. Ornella LoBrutto לתיקון היסודי של כתב היד. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית מסגרת ה -7 של האיחוד האירופי (ICT-FET FP7 / 2,007-2,013, FET צעיר מגלי ערכה) תחת 284,772 BOW BRAIN הסכם מענק (www.brainbowproject.eu).

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הטיפול בבעלי חיים האירופי החקיקה (2010/63 / האיחוד האירופי), על ידי משרד בריאות האיטלקי בהתאם לDL 116/1992 ובהנחיות של אוניברסיטת גנואה (Prot. נ 13,130, מאי 2011). כל המאמצים שנעשו כדי להפחית את מספר בעלי החיים לפרויקט וכדי למזער את סבלם. 1. הכנת חומרים ותומכים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות העובש לבנות PDMS האילוץ (פולי-דימתיל-siloxane) באמצעות מכונת כרסום CNC (מחשב נומרית בקרה). כגון עובש מתממש בפוליקרבונט עם הצילינדר המרכזי בpolytetrafluoroethylene (PTFE). חומר זה מאפשר מיצוי קל של המסכה פעם PDMS הקשיח. הערה: העיצוב של העובש שבוצעה על ידי בעזרת מחשב-עיצוב (CAD) ולאחר מכן מועברת למכונת כרסום CNC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אלסטומר PDMS. PDMS הוא פולימר אורגני. הוא מורכב משני אלמנטים, סוכן ריפוי ופולימר. לערבב אותם על ידי יחס נפח של 1:10, חלק אחד של סוכן ריפוי ותשעה חלקים של פולימר. לשים את שני המרכיבים בצלחת פטרי, לנער ולהכניס את התערובת בתא הוואקום במשך 10 דקות כדי למנוע בועות אוויר. 3 גרם של PDMS מספיקים לאילוץ אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות את אילוץ PDMS. הכנס את חומר PDMS לתוך להרקב והכנסתי אותו לתנור למשך 30 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. יש אילוץ PDMS הצורה של גליל אידיאלי עם קוטר חיצוני ופנימי של 22.0 ו -3.0 מ&quot;מ, בהתאמה וגובה של 650 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הציפוי, זוג המסכה לאזור הפעיל של מערכי מיקרו-אלקטרודה (MEAs) באמצעות פינצטה תחת סטראו ולעקר את מסכת PDMS בתנור על 120 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את microbeads הזכוכית (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע של 42.3 מוסמך ± 1.1 מיקרומטר) באתנול 70% לשעה 2 בבקבוקון חרוטי ולסובב EVery 30 דקות כדי לחשוף את כל microbeads. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון אתנול מהבקבוקון ולשטוף microbeads שתי פעמים עם מים מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנות חלק משטח MEA המופרד על ידי מסכת PDMS (קוטר שווה ל 3.0 מ&quot;מ) עם 24 μl של פתרון המעורב של פולי-D-ליזין וLaminin ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל microbeads עם חלבוני הדבקה, Laminin ופולי-D-ליזין ב0.05 מיקרוגרם / מיליליטר ולהשאיר אותם לילה בחממה על 37 מעלות צלזיוס, להשיג ברשת עצבית יציבה וארוכה טווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את גורמי ההידבקות הן ממשטח הזכוכית של MEA ומmicrobeads הזכוכית. לשאוב כ -95% מפתרון הציפוי עם טפטפת ולהחיל volume- קטן 24μl- של מים סטריליים על פני השטח MEA. לשאוב שוב יותר מ -95% מהמים ולתת יבשים MEA מתחת למכסת המנוע למינרית עבור שעה 1 לפני ציפוי התאים. הערה: במקרה של microbeads במקום, לשאוב את הציפויפתרון ולעשות כביסה ראשונה עם מים מעוקרים ואחד שני עם המדיום הבסיסי והתוספת שלה כגון B27, כדי להתנות את משטח הזכוכית שבו נוירונים יהיו מצופים. אל תתנו microbeads יבש. להשאיר אותם בהשעיה במדיום התרבות בתוך הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ, באמצעות פיפטה -200 μl-, ההשעיה של microbeads טופל (כ 32,000) על צלחת multiwell עם הוספת קרום (קוטר נקבובית 0.4 מיקרומטר) שבו הם יהיו עצמיים להרכיב יוצרי שכבה אחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא היטב בכל הקרום עם 0.5 מיליליטר של מדיום ולשים אותו בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) עד נוירונים מוכנים להיות מצופה (3.2). </li></ol> 2. Dissection של עוברים ודיסוציאציה של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות בוגרות בית נקבה (200-250 גרם) בטמפרטורה קבועה (C 22 ± 1 °) ולחות היחסית (50%) בלוח זמני אור הכהה רגיל (אור-על 07:00-19:00) במתקן בעלי חיים. ודא שמזון ומים זמינים באופן חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי נקבת עכברוש הריון לאחר 18 ימים של פיתוח (E18) באמצעות 3% isoflurane. לאחר מכן, להקריב בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר hippocampi מכל עובר חולדה ולהכניס אותם לתוך הפתרון של קרח הקר האנק המאוזן מלח ללא Ca 2 + וMg 2 +. ביום 18 בהיפוקמפוס פיתוח ורקמות קליפה רכים מאוד ולא צריכים לחתוך לחתיכות קטנות. ניתן למצוא פרטים נוספים 18,19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הרקמה ב0.125% מהפתרון של טריפסין / האנק מכיל 0.05% מDNAse ל18-20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון supernatant עם טפטפת פסטר ולעצור את העיכול אנזימטי על ידי הוספה בינונית עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום עם FBS ולשטוף פעם אחת עם המדיום עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. הסר שוב בינוני עם PIP פסטרette ולמלא אותו שוב עם כמות קטנה (500 μl) של מדיום גידול עם התוספת שלו, 1% L- גלוטמין, גנטמיצין 10 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את גלולה הרקמה מכאנית עם פיפטה פסטר צרה עד השעיה חלבית של תאים היא לכאורה. אין צורך לצנטריפוגה ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנפח הקטן של השעיה תא עם מדיום הגידול להשיג נפח סופי של 2.0 מיליליטר. לספור את הריכוז הסלולרי שהושג עם תא hemocytometer. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי של 600-700 תאים / μl. </li></ol> 3. תא ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט בצפיפות של כ -2,000 תאים / מ&quot;מ 2 על האזור הפעיל של MEA, שהוגדרו על ידי אילוץ PDMS ליצור רשת עצבית 2D. הערה: כל ההיפוקמפוס מכיל כ 5 x 10 5 תאים, (1 x 10 6 לעובר יחיד). לנתח 6 עוברים כדי לקבל סכום כולל של 6 x 106 תאים 2 מיליליטר, וריכוז משוער של 3,000 תאים / μl. לדלל ריכוז זה ב 1: 5 על מנת לקבל ריכוז התא הרצוי וצלחת על 600-700 תאים / μl. אם אזור MEA המופרד על ידי אילוץ PDMS הוא על 7.065 מ&quot;מ 2, והמספר הכולל של תאים מצופים 600 תאים / μl x 24 μl = 14,400 תאים, הצפיפות הסופית של 2,038 תאים / מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכשירי MEA לתוך החממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ 160 μl של ההשעיה עם ריכוז תא של 600-700 תאים / μl (כ -100,000 תאים) על פני השטח של monolayer microbeads ממוקם בתוך צלחות multiwell כדי להשלים את השלב המקדים לבניית התרבות תלת-ממדית. שים את צלחות multiwell בחממה עם CO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> בניית 4. רשת העצבית 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6-8 שעות לאחר הציפוי, להעביר את ההשעיה (microbeads עם הנוירונים) מהצלחות multiwell מאוד בזהירות בתוך השטח המופרד על ידי אילוץ PDMS באמצעות פיפטה נקבעה לנפח של כ 30-40 μl. לאחר כל העברה, לחכות כחצי דק, כדי לאפשר microbeads לעצמי להרכיב במבנה קומפקטי משושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל השכבות מופקדות וספונטאניות התאספו, למלא עם ירידה גדולה של כ -300 μl של מדיום העליון של האזור המופרד על ידי אילוץ PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את מבנה 3D מצמידים את MEA בחממה (T = 37.0 מעלות צלזיוס, CO 2 = 5%) למשך 48 שעות לפני הוספת נפח סופי (כ 1 מיליליטר) של תרבות מדיום גידול עם התוספת שלה. הערה: קחו למשל את המספר הכולל של חרוזים על צלחות multiwell עם הוספת הקרום (30,000) ומספר חרוזים בשכבה אחת על גבי מכשיר MEA (6000). מבנה 3D וכתוצאה מכך מורכב של 5 שכבות של מילcrobeads ותאים. אם ניקח בחשבון שהרשת העצבית 3D היא לא גיאומטרית מושלמת, מבנה 3D וכתוצאה מכך יכול להיות מורכב משכבות 5-8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לאחר ציפוי, להוסיף בזהירות את הנפח הסופי של המדיום (כ -900 μl) בתוך טבעת MEA. לשמור על תרבויות 3D בCO 2 אווירת humidified (5%) על 37 מעלות צלזיוס במשך 4-5 שבועות. להחליף מחצית בינוני פעם בשבוע. </li></ol> 5. מיקרוסקופיה confocal רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הדגימות הביולוגיות לשלב של מיקרוסקופ בבעל. הגדר את הלייזר (ארגון, 496-555 ננומטר), מהירות הסריקה (400 הרץ) שבו לרכוש את התמונה, רווח וקיזוז (0.3%) של PMT עבור כל תמונה כדי ללכוד את מסנן פליטת רוחב פס הנכון וכדי כדי למנוע הרוויה ולהגדיל את יחס האות לרעש. תוצאות סעיף מדווח הערכים שימשו לרכישת התמונות של איור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת z -stack רצף, האשוחרח &#39;בחר, הערך של עמדת z של החלק העליון והשכבה התחתונה של המדגם, ולאחר מכן בחר את גודל צעד כדי להפוך את הרכישה. </li></ol>

<ol>
	<li>Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+stability+and+developmental+changes+in+spontaneous+network+burst+firing+patterns+in+dissociated+rat+cerebral+cortex+cell+cultures+on+multi-electrode+arrays.">Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays.</a> Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).</li><li>Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+timed+spatiotemporal+patterns+of+neural+activity+in+dissociated+cortical+cultures.">Precisely timed spatiotemporal patterns of neural activity in dissociated cortical cultures.</a> Neuroscienc. 148, 294-303 (2007).</li><li>Frey, U., Egert, U., Heer, F., Hafizovic, S., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectronic+system+for+high-resolution+mapping+of+extracellular+electric+fields+applied+to+brain+slices.">Microelectronic system for high-resolution mapping of extracellular electric fields applied to brain slices.</a> Biosens. Bioelectron. 24, 2191-2198 (2009).</li><li>Macis, E., Tedesco, M., Massobrio, P., Raiteri, R., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microdrop+delivery+system+for+neuronal+network+patterning+on+microelectrode+arrays.">An automated microdrop delivery system for neuronal network patterning on microelectrode arrays.</a> J. Neurosci. Meth. 161, 88-95 (2007).</li><li>Kanagasabapathi, T. T., Ciliberti, D., Martinoia, S., Wadman, W. J., Decre, M. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+compartment+neurofluidic+system+for+electrophysiological+measurements+in+physically+segregated+and+functionally+connected+neuronal+cell+culture.">Dual compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture.</a> Front. Neuroeng. 4, (2011).</li><li>Kanagasabapathi, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+connectivity+and+dynamics+of+cortical-thalamic+networks+co-cultured+in+a+dual+compartment+device.">Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device.</a> J. Neural. Eng. 9, (2012).</li><li>Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering+and+biohybridized+microsystems+for+neurobiological+investigation+in+vitro+(Part+1).">Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1).</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 39, 201-240 (2011).</li><li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+Bursting+in+Cortical+Cultures+with+Closed-Loop+Multi-Electrode+Stimulation.">Controlling Bursting in Cortical Cultures with Closed-Loop Multi-Electrode Stimulation.</a> J. Neurosci. 25, 680-688 (2005).</li><li>Shany, B., Vago, R., Baranes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+primary+hippocampal+neuronal+tissue+on+an+aragonite+crystalline+biomatrix.">Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix.</a> Tiss. Eng. 11, 585-596 (2005).</li><li>Schmidt, C. E., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tissue+engineering:+strategies+for+repair+and+regeneration.">Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration.</a> Ann. Rev. Biomed. Eng. 5, 293-347 (2003).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+stem+and+progenitor+cell+differentiation+into+functional+neuronal+circuits+in+three-dimensional+collagen+gels.">CNS stem and progenitor cell differentiation into functional neuronal circuits in three-dimensional collagen gels.</a> Exp. Neurol. 190, 276-288 (2004).</li><li>Baranes, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interconnected+network+of+ganglion-like+neural+cell+spheres+formed+on+hydrozoan+skeleton.">Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton.</a> Tissue En. 13, 473-482 (2007).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+state+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue engineering. Part B, Review. 14, 61-86 (2008).</li><li>Schuz, A., Palm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density+of+neurons+and+synapses+in+the+cerebral+cortex+of+the+mouse.">Density of neurons and synapses in the cerebral cortex of the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 286, 442-455 (1989).</li><li>Pautot, S., Wyart, C., Isacoff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colloid-guided+assembly+of+oriented+3D+neuronal+networks.">Colloid-guided assembly of oriented 3D neuronal networks.</a> Nat. Method. 5, 735-740 (2008).</li><li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures:+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology.">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci. Rep. 4, (2014).</li><li>Tang-Schomer, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+functional+brain-like+cortical+tissue.">Bioengineered functional brain-like cortical tissue.</a> Proc Natl Acad Sci U S. 111, 13811-13816 (2014).</li><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Nerve Cell. , (1998).</li><li>Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+culture,+record+and+stimulate+neuronal+networks+on+Micro-electrode+arrays+(MEAs).">How to culture, record and stimulate neuronal networks on Micro-electrode arrays (MEAs).</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li><li>Jayakumar, R., Prabaharan, M., Nair, S. V., Tamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chitin+and+chitosan+nanofibers+in+biomedical+applications.">Novel chitin and chitosan nanofibers in biomedical applications.</a> Biotech. Adv. 28, 142-150 (2010).</li><li>Crompton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polylysine-functionalised+thermoresponsive+chitosan+hydrogel+for+neural+tissue+engineering.">Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering.</a> Biomaterial. 28, 441-449 (2007).</li><li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+engineered+neural+networks+coupled+to+Micro-Electrode+Arrays:+Development+of+an+innovative+in-vitro+experimental+model+for+neurophysiological+studies.">3D engineered neural networks coupled to Micro-Electrode Arrays: Development of an innovative in-vitro experimental model for neurophysiological studies.</a> , 957-960 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בעבודה זו, ניסוי חדשני בפלטפורמת מבחנה המורכבת מ3D מהונדס תרבויות עצביות מצמידים את MEAs לאלקטרופיזיולוגיה רשת כבר הציג. השימוש בmicrobeads כפיגום לאפשר תולדת דלקת העצבים לאורך -axis z כבר מותאם להיות משולב עם MEA מישוריים. בדרך זו, תוצאות מיקרו-המערכת שהושגו במבחנת<...

ברשתות מבחנה דו-ממדיות (2D) עצביות מצמידים את מיקרו-אלקטרודה מערכים (MEAs) עלה יפה אימץ ללמוד את יחסי הגומלין בין דינמיקה העצבית והקישוריות הבסיסית מודל ניסיוני זהב סטנדרטי. במהלך הפיתוח, נוירונים לשחזר רשתות מורכבות המציגות גם פעילות definedspatio-temporalpatternsof 1,2 (כלומר, התפרצויות, התפרצויות רשת, פעילות spiking אקראית). MEAs להקליט את פעילות אלקטרו מאתרים רבים (בין עשרות לאלפים microelectrodes), המאפשר חקירה מפורטת של הדינמיקה הביעה ברמת הרשת. בנוסף, השימוש בתרבויות ניתק עושה possibile לעצב מהונדסות-רשתות. זה קל יותר להבין בדרך זו את היחסים הפונקציונליים בין פעילות אלקטרו נרשמה והפרמטרים של ארגון הרשת כמו תא צפיפות 3, מידת המודולריות 4,5, נוכחות של פופ העצבי הטרוגנית6 ulations, וכו &#39;עם זאת, כל במבחנה בתאים בתרבית ניתקו מבוססת על רשתות עצביות 2D. גישה זו מובילה לפשטנותן ביחס למערכת בvivo (3 ממדים מהותי, 3D): (i) בקונוסים מודל, somata וצמיחת 2D הם שטוחים ותולדת האקסונים-דנדריטים לא יכול להתפשט לכל הכיוונים 7. (Ii) במבחנה תערוכת רשתות 2D סטריאוטיפית דינמיקת אלקטרו נשלטה על ידי מתפוצץ פעילות הכרוכה ברוב הנוירונים של הרשת 8. לאחרונה, פתרונות שונים פותחו כדי לאפשר הבנייה של במבחנה 3D ניתק רשתות עצביות. הרעיון המשותף מורכב ביצירת פיגום שבו תאי עצב יכולים לגדול בצורה 3D. כגון פיגום יכול להתממש עם ג&#39;לי פולימר ומטריצות נקבוביות מוצקות 9-13. על ידי ניצול התכונות מכאניות של הפולימרים, ניתן להטביע בתוך תאים thesמבני דואר על ידי הגדרת בלוק אחיד של תרבויות 3D של neurospheres 11. התכונה העיקרית של גישה זו היא הרכוש המכני הנוקשה של neurospheres 9,12. עם זאת, חומרים אלה נקבוביות מוגבלים, והם לא מבטיחים נדידת תאים בתוך המטריצה. כדי להתגבר על חסרון זה, פתרון אפשרי מורכב בחיתוך המטריצה ​​לתוך מודולים &#39;יחידה&#39;. למרבה הצער, את מגוון הגודל וצורה של החלקיקים עלול להקשות על האריזה למבנים שכבתיים רגילים. ב -7, קאלן ועמיתים לעבודה שנועדו לבנות עצבי 3D מורכב מתאי עצב ו / או האסטרוציטים בתוך פיגום מבוסס מטריקס ביו. כגון רקמה עצבית מהונדסת אפשרה בחקירות מבחנה ללמוד ולתפעל תגובות נוירו-ביולוגיות בתוך מיקרו-סביבות 3D. מודל זה מורכב מתאי עצב וגליה מופצים ברחבי המטריצה ​​תאית (ECM) ו / או פיגומי הידרוג&#39;ל (500-600 מיקרומטר עבה). בשיתוף זהndition, כדאיות אופטימלית תא (יותר מ 90%) נמצאה על ידי תאי ציפוי בצפיפות סופית של כ 3,750 - 5,000 תאים / מ&quot;מ 3. יש לציין שערך כגון צפיפות נמוך בהרבה מזה שבמצב in vivo, שבו צפיפות התאים בקליפת מוח העכבר היא כ 90,000 תאים / מ&quot;מ 3 14. כדי להתגבר על מגבלה זו Pautot ועמיתים לעבודה 15 הבינו במבחנה מערכת 3D שבו צפיפות תאים וקישוריות לרשת נשלטות להידמות בתנאי vivo תוך שהוא מאפשרים הדמיה של הרשת בזמן אמת. למעשה, שיטה זו מבוססת על הרעיון שניתק נוירונים בתרבית יכולים לגדול על microbeads סיליקה. חרוזים אלה מספקים משטח צמיחה גדול מספיק עבור גופי תא עצביים לדבוק ולarborizations לגדול, בוגר, להאריך, ולהגדיר קשרים סינפטיים לנוירונים אחרים. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה הספונטניות של חרוזים פיזור מונו לFOrm 3D שכבתי מערכי משושים המכילים תת שונה של תאי עצב בשכבות שונות עם קישוריות מוגבלת, בין הנוירונים בחרוזים שונים. צפיפות התאים הושגו בשיטה זו הייתה על 75,000 תאים / מ&quot;מ 3. לאחרונה, יש לנו השיטה מותאמת של Pautot לMEAs 16: התוצאות שהתקבלו מראות כי פעילות אלקטרו 3D מציגה רפרטואר רחב יותר של פעילויות מזו באה לידי ביטוי על ידי רשתות 2D. תרבויות בוגרות 3D תערוכה דינמית משופר שבה שני פרץ הרשת ולהתקיים פעילות ספייק אקראית. באופן דומה, טאנג-Schomer ועמיתים לעבודה 17 הבינו פיגום נקבובי מבוסס חלבון משי אשר שומר תרבות בקליפת המוח עיקרי במבחנה במשך כמה חודשים, ורשמו את פעילות אלקטרו באמצעות אלקטרודה טונגסטן. בעבודה זו, הפרוצדורות לבנות רשתות עצביות 3D מצמידים את MEAs יתואר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>0.05 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>0.05 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25050-014</td>
			<td align="left">0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td>0.05% diluted&#160; in Hanks solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>17504044</td>
			<td>2% medium supplent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F-2442</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax-I&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G.1272</td>
			<td>5mg/liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)</td>
			<td>Corning Sigma</td>
			<td>481939</td>
			<td>curing agent and the polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Electrode Arrays</td>
			<td>Multi Channel Systems (MCS)</td>
			<td>60MEA200/30-Ti-pr</td>
			<td>MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 &#181;m, respectively; plastic ring without thread</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead</td>
			<td>Distrilab-Duke Scientific</td>
			<td>9040</td>
			<td>&#160;1gr Glass Part.Size Stds 40 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell</td>
			<td>Costar Sigma</td>
			<td>CLS 3413</td>
			<td>multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS w\o Ca++ ,Mg++&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>14175-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Buffer Solution&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>430935-5G</td>
			<td>polytetrafluoroethylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>Wistar Rat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy Upright</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5 AOBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20.0x0.50 WATER objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica HCX APO L U-V-I&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40.0x0.80 WATER objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica HCX APO L U-V-I&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25.0x0.95 WATER objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>HCX IRAPO L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interfacing 3d engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

. בהליך ניסיון זה, תפקיד רלוונטי הוא שיחק על ידי microbeads המגדירים את הפיגום המכני לצמיחה של הרשת העצבית 3D איורים תצוגת 1A ו- B ההסדר של microbeads (קוטר נומינלי של 40 ± 2 מיקרומטר; קוטר ממוצע מוסמך של 42.3 ± 1.1 מיקרומטר) במטוס. הייחוד של מבנים כאלה הוא שmicrobeads באופן ס...

Watch this Scientific Journal Video about Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model at JoVE.com

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

התממשקות תרבויות 3D הנדסה עצבית למערכי מיקרו-אלקטרודה: חדשני<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם ניסיוני

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

interfacing-3d-engineered-neuronal-cultures-to-micro-electrode-arrays

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

9.9K Views.  University of Genova. In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Video: Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

הליך השתלת מערכים מאורגנים של Microwires להקלטות יחידה אחת בAwake, מתנהגת בעלי חיים

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

עצבי פעילות הרבייה בהיפוקמפוס הכנה פרש בחודר מיקרו-אלקטרודה Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...