This work was supported in part by grants from NHRI (CS-104-PP-06 to B.L.Y.).

يجب الحصول على الموافقة المستنيرة للمريض كما وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية لاستخدام الخلايا البشرية. 1. الكثافة التدرج عزل الخلايا الطرفية الإنسان الدم وحيدات النوى (PBMCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 مل heparinized الدم كله في أنبوب 50 مل بواسطة ماصة 25 مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا مع 25 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل من Ficoll-Paque التدرج الكثافة في أنبوب جديد 50 مل، وبينما يميل الأنبوب، ببطء شديد وبدقة إضافة في 25 مل من تعليق خلية المخفف على التدرج كثافة حتى لا يكون هناك أي اختلاط الدم الكامل مع التدرج الكثافة، أي، أي اضطراب في واجهة التدرج الدم الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق من الخطوة 1.2 في 400 × ز لمدة 30 إلى 40 دقيقة في درجة الحرارة التي تسيطر يتأرجح دلو الدوار دون الفرامل عند 20 درجة مئوية. ملاحظة: يجب أن تكون ثلاث طبقات متميزة واضح بعد الطرد المركزي: عشره الطبقة العليا يجري البلازما. طبقة واضحة القاع يجري التدرج كثافة Ficoll-Paque. و، طبقة رقيقة الخلوية المتوسطة كونها PBMCs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وتجاهل الطبقة العليا عن طريق الشفط مع ماصة باستور، مع الحرص على عدم تعكير صفو طبقة البيني للخلايا وحيدات النوى (أي الخلايا الليمفاوية، وحيدات، والصفائح الدموية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع بعناية طبقة الخلايا وحيدة النواة هذا مع ماصة 10 مل إلى 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الأنبوب مع 20 مل من برنامج تلفزيوني، وتخلط جيدا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 20 ° C. إزالة طاف تماما بعد الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 10-15 دقيقة في 20 ° C. إزالة طاف تماما بعد الطرد المركزي. ملاحظة: هذه الخطوة إزالة الصفائح الدموية-وهي غير مرغوب فيه داخل PBMCs. ويمكن تكرار هذه الخطوة لضمان إزالة كاملة من الصفائح الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم يكن هناك اختيار فئات معينة من السكان هيالمطلوب، بيليه الخلية resuspend في الكريات البيض المتوسط ​​كاملة (10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ L-الجلوتامين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في المتوسط ​​RPMI-1640) للزراعة بعد إجراء عدد خلايا 16 إلى تعليق 1 مل من المتوسطة في 10 7 PBMCs قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol> 2. وضع العلامات المغناطيسي للسكان كريات بيضاء (انتقل إلى الخطوة 4 إذا لم اختيار فئات معينة من السكان غير مطلوب) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي PBMC تعليق في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلية resuspend في 80 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من حبات مغناطيسية محددة (أي CD14 حبات مغناطيسية لعزل حيدات، CD4 حبات مغناطيسية لعزل الخلايا الليمفاوية T) في 10 7 مجموع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 مل من برنامج تلفزيوني في 10 7 خلايا لغسل، وأجهزة الطرد المركزيفي 300 × ز لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف تماما و resuspend ما يصل الى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. </li></ol> 3. اختيار المغناطيسي المجموعات السكانية الفرعية خلايا الدم البيضاء ملاحظة: هي مجموعة متنوعة من فواصل حبة المغناطيسي والأعمدة المتوفرة لعزل السكان معين من كريات الدم البيضاء التي كتبها علامة سطح الخلية من عدد من الشركات المصنعة. العزلة يمكن أن يكون عن طريق الانتقاء إيجابية على أساس واحد أو عدد قليل من علامات إيجابية أو عن طريق الانتقاء السلبية بعد استنفاد السكان غير المرغوب فيها. ويرد أدناه A النهج العام لأداء اختيار الإيجابية باستخدام علامة واحدة (أي CD4 لاللمفاويات التائية المساعدة، أو CD14 للحيدات). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وفاصل المغناطيسي رئيس بما في ذلك العمود الفصل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الأنبوب الذي يحتوي على عينة من PBMCs المسمى. تقديم اثنين من 15 مل أنابيب الطرد المركزي لجمع وunlabel المسمى إيجابيالكسور الخلية الطبعه، بعد تعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الزنزانة رقم 15 و resuspend الكريات البيض مختارة بشكل إيجابي (أي الخلايا الليمفاوية T + CD4 أو CD14 + الخلايا) في الكريات البيض المتوسط ​​كاملة، وذلك باستخدام 1 مل من المتوسط ​​في 10 7 الخلايا. </li></ol> 4. CFSE تلطيخ الكريات البيض لتقييم انتشار ملاحظة: تم CFSE تستخدم على نطاق واسع في التحقيقات المناعية، على حد سواء في والمجراة في الدراسات المختبرية. وقد تم تحسين بروتوكول لدينا للدراسة في المختبر من MSC / PBMC (أو الكريات البيض الأخرى) التفاعلات. في حين أن الخطوات العامة تشارك في إجراء CFSE في المختبر وضع العلامات متشابهة، قد تكون هناك اختلافات في جرعة محددة وتوقيت بروتوكول 14. قد يكون هذا نتيجة لعدد من العوامل، أي نوع من الخلايا المحددة المستخدمة، أرقام الهواتف المحمولة المستخدمة والتي يمكن أن تؤثر على الأرجح شدة إشارة الفلورسنت CFSE. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل CFSE الأوراق المالية (10 ملم) في برنامج تلفزيوني لتركيز العمل المطلوب من 10 ميكرومتر (حل CFSE يعملون). إعداد 10 7 الخلايا (أي PBMCs أو خلايا T) لوضع العلامات مع الحل CFSE في العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة للحصول على بيليه خلية ونضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا برفق في 1 مل من قبل تحسنت الحل (37 ° C) CFSE في العمل واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليغسل الزائد CFSE، وتمييع تعليق الخلية مع 10x (من حيث الحجم) من precooled (4 ° C) RPMI المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS. الرواسب الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. غسل بيليه الخلية في هذه الطريقة مرتين أكثر من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي والاعتماد الزنزانة رقم 15. و resuspend 10 7 خلايا (إما PBMCs أو خلايا T) في 1 مل الكريات البيض prewarmed المتوسطة كاملة جديدة. </li></ol> 5. المشارك ثقافة Mالمنبوذة مع الكريات البيضاء وتنشيط الكريات البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة MSC المتوسطة كاملة (10٪ FBS (pretested للنمو الأمثل MSC)، 1٪ L-الجلوتامين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في DMEM منخفض المتوسطة الجلوكوز) إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجان الدائمة البذور في 50000 الخلايا في 1 مل من MSC المتوسطة كاملة في 24 لوحات جيدا (كثافة MSC: 25،000 خلية / سم 2) لمرفق O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية، مما يسمح للخلايا الجذعية لتصل إلى 80٪ التقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة، واستنادا إلى الأرقام MSC المصنفة، إضافة PBMCs CFSE المسمى (المسمى يرجى السابق الرجوع إلى بروتوكول الخطوة 4 أعلاه) إلى اللجان الدائمة مثقف (المصنف في اليوم السابق في 24 لوحات جيدة) في 1 مل من الكريات البيض المتوسط ​​الكامل في 01:10 (نسبة الخلايا) نسبة ثقافة مشتركة من اللجان الدائمة لPBMCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة راصة دموية نباتية mitogen (PHA)، منشط الكريات البيض غير محددة، إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل في الحجم الكلي لل1 مل الكريات البيض المتوسط ​​كاملة لكل بئر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البديلةاعل، لتحفيز لتنشيط الخلايا الليمفاوية T على وجه التحديد: استخدام ألفا CD3 / 28 بلي وإضافة إلى الخلية يومين شارك في الثقافة للحصول على نسبة الخلايا اللمفاوية حبة ل-T من 1: 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسيطرة سلبية، لوحة 500،000 PBMCs / جيد (أو مجموعة سكانية محددة المستجيب الكريات البيض؛ كثافة الخلية: 250،000 الكريات البيض / سم 2) في 24 لوحة جيدا مع 1 مل الكريات البيض المتوسط ​​كاملة فقط؛ من أجل السيطرة الإيجابية، بالإضافة إلى تصفيح نفس العدد من PBMCs / جيدا، إضافة PHA إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على 3 واليوم 5TH التجربة شارك في الثقافة، وتقييم انتشار الكريات البيض CFSE المسمى (توضع في أنابيب ذهابا والقاع) عن طريق تحليل تدفق cytometric 17 مع 488 نانومتر الإثارة وانبعاث الفلاتر المناسبة للفلوريسئين. ملاحظة: يمكن أيضا جواني تلطيخ خلوى لتحليل تدفق cytometric أن يؤديها لهذه الكريات البيض المسمى CFSE في هذه المرحلة لتقييم التغيرات في الكريات البيض خلوى الشخصي التعبير موdulated من قبل اللجان الدائمة. منذ يتم تقييم CFSE مع مناسبا لتصفية فلوريسئين، والأجسام المضادة مختارة لتقييم حاجة مختلف السيتوكينات لتصريفها إلى fluorochromes غير فلوريسئين أو الطيف مماثل (أي فيكوإيريترين، peridinin البروتين الكلوروفيل مجمع (PerCP)). </li></ol> اختيار حبة-المستجيب قمع الفحص المغناطيسي، MSC التي يسببها المناعية الكريات البيضاء في المنشط CFSE المسمى خلايا CD4 + T المستجيب: 6. التغيير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجان الدائمة البذور في 250،000 الخلايا في 3 مل من MSC المتوسطة كاملة في 6 لوحات جيدة (كثافة MSC: 25،000 خلية / سم 2) لمرفق O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية، مما يسمح للخلايا الجذعية لتصل إلى 80٪ التقاء. 3 ما لا يقل عن 6 لوحات جيدا ضرورية لضمان ما يكفي من PBMCs-MSC cocultured لاختيار حيوانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة، وإضافة PBMCs فصل كما في الخطوة 1 ولكن في 6 لوحات جيدة عند 2.5 × 10 6 خلايا / جيد (كثافة الخلية: 250،000 جنيهukocytes / سم 2) مع 3 مل من الكريات البيض المتوسط ​​كاملة. شارك في ثقافة ل48-72 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المغناطيسية حبة اختيار سكانية محددة من الكريات البيضاء المناعية التي يسببها MSC (أي CD14 + الخلايا) حسب أقسام 2-3. ملاحظات: جواني تلطيخ خلوى لتحليل تدفق cytometric لا يمكن أن يؤديها في هذه المرحلة لتقييم التغيرات في الكريات البيض خلوى الشخصي التعبير، أي التعبير عن انترلوكين 10-كما منظم من قبل اللجان الدائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خلايا CD4 + T خيفي الناتجة حسب أقسام 2-4 في 24 لوحات جيدا CFSE المسمى في 1 مل من الكريات البيض كاملة (كثافة الخلايا التائية: 250000 خلية / سم 2) متوسطة إلى الكريات البيض مختارة حبة MSC التي يسببها في نسب مختلفة ، أي 01:10، 1: 5، 1: 2، و 1: 1 (خلية إلى أخرى) النسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحفيز خلايا CD4 + T، إضافة α-CD3 / 28 بلي مترافق للحصول على نسبة حبة الى خلية من 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لسيطرة سلبية، لوحة 500000 خلايا CD4 + T / جيد في (كثافة الخلايا التائية: 250000 خلية / سم 2) لوحة 24-جيدا مع 1 مل الكريات البيض المتوسط ​​كاملة فقط؛ من أجل السيطرة الإيجابية، بالإضافة إلى تصفيح نفس عدد الخلايا CD4 + T / جيد، إضافة CD3 ألفا / 28 بلي مترافق للحصول على نسبة حبة الى خلية من 1: 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 3 الثالثة والثقافة المشتركة، وتقييم انتشار CFSE المسمى خلايا CD4 + T (توضع في أنابيب ذهابا وأسفل) من خلال تدفق تحليل cytometric 16 مع 488 نانومتر الإثارة وانبعاث الفلاتر المناسبة للفلوريسئين. </li></ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursor+cells+of+mechanocytes.">Precursor cells of mechanocytes.</a> Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li><li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues.">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li><li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).</li><li>Yen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+cells+from+human+term+placenta.">Isolation of multipotent cells from human term placenta.</a> Stem Cells. 23, 3-9 (2005).</li><li>Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitor+cells+in+human+umbilical+cord+blood.">Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.</a> Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).</li><li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo.">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).</li><li>Chang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placenta-derived+multipotent+cells+exhibit+immunosuppressive+properties+that+are+enhanced+in+the+presence+of+interferon-gamma.">Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma.</a> Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).</li><li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease.">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).</li><li>Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+properties+of+human+adult+and+fetal+multipotent+mesenchymal+stem+cells.">Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).</li><li>Muul, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+proliferative+responses+of+cultured+lymphocytes.">Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes.</a> Curr Protoc Immunol. , (2011).</li><li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester.">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li><li>Chen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+immunomodulatory+monocytes+by+human+mesenchymal+stem+cell-derived+hepatocyte+growth+factor+through+ERK1/2.">Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2.</a> J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).</li><li>Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I., Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UNIT+18.8+Immune+cell+phenotyping+using+flow+cytometry.">UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry.</a> Curr Protoc Toxicol. , 18.8.1-18.8.24 (2005).</li><li>Phelan, M. C., Lawler, G., Robinson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APPENDIX+3A+Cell+counting.">APPENDIX 3A Cell counting.</a> Curr Protoc Cytom. , A.3A.1-A.3A.4 (2001).</li><li>Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunomodulatory+capacity+of+mesenchymal+stem+cells.">The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.</a> Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).</li><li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+for+treatment+of+steroid-resistant,+severe,+acute+graft-versus-host+disease:+a+phase+II+study.">Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study.</a> Lancet. 371, 1579-1586 (2008).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants:+a+randomized+controlled+trial.">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307, 1169-1177 (2012).</li><li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+inhibit+and+stimulate+mixed+lymphocyte+cultures+and+mitogenic+responses+independently+of+the+major+histocompatibility+complex.">Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.</a> Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+in+vitro+impairs+the+immunosuppressive+activity+of+mesenchymal+stem+cells+on+T+cells.">Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells.</a> Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties?.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?.</a> Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).</li><li>Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2+accumulation+mediates+differentiation+capacity+alteration,+but+not+proliferative+decline,+in+senescent+human+fetal+mesenchymal+stem+cells.">H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Increasingly, the immunomodulatory properties of MSCs are being translated into clinical use more rapidly than the multilineage capacity of these stem cells18-20. Thus, co-culture techniques of MSCs with leukocytes and assays to evaluate immune function are important to further delineate the specific mechanisms involved in these properties for optimizing effective therapeutic application. 
One of the most critical technical aspects for success in these assays is having adequate PBMC...

الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) هي الأسلاف الجسدية التي يمكن أن تفرق في الأنساب أرومية متوسطة مجاور للمحور من العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية و1-4، وكذلك لبضع الأنساب extramesodermal 5. عزله للمرة الأولى من نخاع العظام الكبار، والآن تم العثور على هذه الأسلاف multilineage في العديد من الأنسجة 6-8، وبشكل غير متوقع، تبين أن لها خصائص المناعية القوية التي تظهر قابلية عالية للالتطبيق السريري 12/09. وبنشاط يجري التحقيق آليات مفصلة المشاركة في الآثار المناعية للتطبيق الفعلي على الكيانات المرض محددة. واحدة من أكثر الطرق مباشرة لتقييم المناعة هو من خلال تقييم لقمع المستجيب الكريات البيض انتشار 13. معظم الكريات البيض المستجيب مثل الخلايا الليمفاوية T وحيدات تتكاثر غير عادي عندما حفز أو تفعيلها. وظيفة المناعية يمكن تقييمها عندما قمعويشهد انتشار الأسلحة النووية. تقليديا، وقد تم تقييم انتشار المستجيب الكريات البيض من خلال الكشف عن [3 H] ثيميدين إدراجها في الحمض النووي. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب كبيرة بسبب المخاوف من الإشعاع والتخلص منها بعد استخدامها، وكذلك المعدات المعقدة اللازمة. في حين أن هناك فحوصات غير المشعة لتقييم تكاثر الخلايا، واستر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE) مقايسة له مزايا أخرى مثل السماح لتحديد السكان الخلوي محددة، وهو أمر مفيد خاصة في التجارب الثقافة المشتركة التي تشمل أنواع خلايا متعددة. CFSE هو صبغة الفلورسنت الخلوية التي يمكن تقييمها من خلال تحليل تدفق cytometric. كما تنقسم الخلايا، وانخفضت شدة هذه التسمية الخلوية نسبيا. وهذا يتيح ليس فقط تحديد تكاثر الخلايا بشكل عام ولكنه يسمح أيضا لتقييم لعدد من الانقسامات الخلوية يصل إلى 8 الانقسامات قبل أن يصبح مضان الصعب ديتإلخ ضد إشارة الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن استقرار CFSE الفلورسنت يسمح لفي الجسم الحي تتبع الخلايا المسمى مثل هذه أن الخلايا يمكن تصور ما يصل إلى عدة أشهر 14. ويمكن أيضا أن تختلف هذا الاختبار لتقييم أنواع معينة من الكريات البيض المستجيب أو وظيفة المناعية لفئات معينة من السكان للجنة السلامة البحرية التي يسببها الكريات البيض، مثل المناعية كما انترلوكين 10 (IL-10) إنتاج CD14 + حيدات 15 عن طريق أداء المغناطيسي حبة علامة السطح اختيار السكان خلية من الفائدة قبل أو بعد ثقافة مشتركة حسب الاقتضاء. يصف بروتوكول لدينا فحص أساسي لتقييم الآثار المناعية من اللجان الدائمة على الكريات البيض المستجيب (الرسم البياني في الشكل 1)، والاختلاف على هذا الاختبار الأساسي لتقييم MSC الناجم عن المناعة الكريات البيض على خيفي CD4 + المستجيب الخلايا اللمفية تي (الرسم البياني أظهرت في الشكل 4).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:259px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:121px;">71-7167-00 AG</td>
			<td style="width:549px;">Density grandient for isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">V12883</td>
			<td>Cellular label for detection of cell division</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Phytoagglutinin (PHA)</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td>L8902</td>
			<td>Activation of human PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:276px;">Dynabeads Human T-Activator CD3/28</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">111.32D</td>
			<td style="width:549px;">Activation of human T lymphocytes, e.g. CD4+ T cells, CD8+ T cells,etc.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">autoMACS&#8482; Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">autoMACS&#8482; Separator</td>
			<td>Magnetic based cell separator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">autoMACS&#174; Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>separation columns</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:276px;">CD14 microbeads, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td style="width:549px;">For positive selection of CD14+ human monocytes and macrophages from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">CD4 microbeads, human&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-045-101</td>
			<td style="width:549px;">For positive selection of CD4+ human T lymphocytes from PBMCs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">11875</td>
			<td>Human PBMC/leukocyte culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">DMEM, Low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:121px;">11885</td>
			<td style="width:549px;">Human mesenchymal stem cell (MSC) culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Supplementation for MSC complete medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:259px;">Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplementation for PBMC/leukocyte and MSC complete medium</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:276px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:259px;">1) Hyclone, for MSC culture&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 2) Life Technologies, for all other cells (i.e. PBMCs, specific leukocyte populations)</td>
			<td style="width:121px;">1) SH30070.03M 2) 10091-148</td>
			<td>Pre-test lots for support of MSC in vitro culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td>COR3524</td>
			<td>Co-culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">430291</td>
			<td>Isolation PBMCs from whole blood by Ficoll-Paque PLUS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">15 mL centrifuge tube&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:121px;">430766</td>
			<td>Collection of the labeled and unlabeled cell fractions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Round-bottom tubes</td>
			<td style="width:259px;">BD Falcon&#160;</td>
			<td style="width:121px;">352008</td>
			<td>Collection of cells for flow cytometric analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the immunomodulatory properties of human mesenchymal stem cells (mscs)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of immune-related diseases. Mechanisms involved are increasingly being elucidated and in this article, we describe the basic experiment to assess MSC immunomodulation by assaying for suppression of effector leukocyte proliferation. Representing activation, leukocyte proliferation can be assessed by a number of techniques, and we describe in this protocol the use of the fluorescent cellular dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) to label leukocytes with subsequent flow cytometric analyses. This technique can not only assess proliferation without radioactivity, but also the number of cell divisions that have occurred as well as allowing for identification of the specific population of proliferating cells and intracellular cytokine/factor expression. Moreover, the assay can be tailored to evaluate specific populations of effector leukocytes by magnetic bead surface marker selection of single peripheral blood mononuclear cell populations prior to co-culture with MSCs. The flexibility of this co-culture assay is useful for investigating cellular interactions between MSCs and leukocytes.

الرقم 1 يدل على مخطط شامل للتجربة، ويوضح الشكل (2) ومظهر مختلف الظروف ثقافة الخلية كما تصور من قبل على النقيض من المرحلة مقلوب المجهر. اللجان الدائمة هي خلايا ملتصقة مع الأرومة الليفية، مورفولوجيا المغزل على شكل، في حين PBMCs وكريات الدم البيضاء هي الخلايا غير ملت...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs at JoVE.com

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

تظهر الخصائص المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) ذات الصلة على نحو متزايد عن التطبيق السريري. باستخدام نظام المشاركة في ثقافة اللجان الدائمة والكريات البيض في الدم الطرفية ملطخة مسبقا مع صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE)، وصفنا التقييم في المختبر من MSC المناعة على انتشار المستجيب الكريات البيض ومجموعات سكانية فرعية محددة.

تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

assessment-immunomodulatory-properties-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

12.1K Views.  National Health Research Institutes (NHRI).  تظهر الخصائص المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) ذات الصلة على نحو متزايد عن التطبيق السريري. باستخدام نظام المشاركة في ثقافة اللجان الدائمة والكريات البيض في الدم الطرفية ملطخة مسبقا مع صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE)، وصفنا 

Video: Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells MSCs

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, transmission of antibiotic resistant bacteria between animals and humans, and the high cost of treating infections.
In this study, we disclose a new strategy that may be effective in preventing implant-associated infection based on the potential antimicrobial properties of platelet-rich plasma (PRP). Due to its well-studied properties for promoting healing, PRP (a biological product) has been increasingly used for clinical applications including orthopaedic surgeries, periodontal and oral surgeries, maxillofacial surgeries, plastic surgeries, sports medicine, etc.
PRP could be an advanced alternative to conventional antibiotic treatments in preventing implant-associated infections. The use of PRP may be advantageous compared to conventional antibiotic treatments since PRP is less likely to induce antibiotic resistance and PRP's antimicrobial and healing-promoting properties may have a synergistic effect on infection prevention. It is well known that pathogens and human cells are racing for implant surfaces, and PRP's properties of promoting healing could improve human cell attachment thereby reducing the odds for infection. In addition, PRP is inherently biocompatible, and safe and free from the risk of transmissible diseases.
For our study, we have selected several clinical bacterial strains that are commonly found in orthopaedic infections and examined whether PRP has in vitro antimicrobial properties against these bacteria. We have prepared PRP using a twice centrifugation approach which allows the same platelet concentration to be obtained for all samples. We have achieved consistent antimicrobial findings and found that PRP has strong in vitro antimicrobial properties against bacteria like methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Group A Streptococcus, and Neisseria gonorrhoeae. Therefore, the use of PRP may have the potential to prevent infection and to reduce the need for costly post-operative treatment of implant-associated infections.

PRP as a New Approach to Prevent Infection: Preparation and In vitro Antimicrobial Properties of PRP

Implant-associated infection is a significant clinical complication. This study describes an approach using platelet-rich plasma (PRP) to prevent implant-associated infections, presents the protocol for preparing PRP with constant platelet concentration, and reports the newly identified antimicrobial properties of PRP and related protocols for examining such antimicrobial properties in vitro.

بي ار بي كنهج جديد للوقاية من العدوى: إعداد و<em&gt; في المختبر</em&gt; الخصائص المضادة للميكروبات من PRP

Implant-associated infection is becoming more and more challenging to the healthcare industry worldwide due to increasing antibiotic resistance, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode larvae of the genus Trichinella. The most important sources of human infections worldwide are game meat and pork or pork products. In many countries, the prevention of human trichinellosis is based on the identification of infected animals by means of the artificial digestion of muscle samples from susceptible animal carcasses.
There are several methods based on the digestion of meat but the magnetic stirrer method is considered the gold standard. This method allows the detection of Trichinella larvae by microscopy after the enzymatic digestion of muscle samples and subsequent filtration and sedimentation steps. Although this method does not require special and expensive equipment, internal controls cannot be used. Therefore, stringent quality management should be applied throughout the test. The aim of the present work is to provide detailed handling instructions and critical control points of the method to analysts, based on the experience of the European Union Reference Laboratory for Parasites and the National Reference Laboratory of Germany for Trichinella.

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

The prevention of human trichinellosis in many countries worldwide is based on the laboratory examination of muscle samples from susceptible animals by methods of digestion, of which the magnetic stirrer method is considered the gold standard.

الطريقة النمام المغناطيسي للكشف عن<em&gt; الخيطيات</em&gt; يرقات في عينات العضلات

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

التمايز المستحث للخلايا الشبيهة بالخلايا M في الطبقات الأحادية المعوية اللفائفية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...