ستساعد طريقة الثقافة المشتركة هذه في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المحيطة بآليات الاتصال بالخلايا وراء تنظيم الخلايا الجذعية الوسطى لداء البلعم الكلي ، وبالتالي إلقاء الضوء على دور MSC في تنظيم المناعة الفطرية. ويمكن تطبيق هذه التقنية في التحليلات عالية الإنتاجية. الجسيمات الحيوية مترافقة مع الأصباغ الحساسة ل درجة الحموضة الفلور فقط في بيئات phagolysosome الحمضية.
وبالتالي، الغسيل والإرواء ضروريان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على مجموعة متنوعة من نماذج الثقافة المشتركة التي تشمل العدلات وغيرها من الخلايا الفرجية. إثبات الإجراء سيكون إيثان شيتكوف، وهو طالب جامعي حاليا في مختبري.
في البداية، لاحظ التقاء الخلايا الجذعية المستزرعة. عندما يتحقق التقاء 70-80٪، يستنشق متوسط النمو من الخلايا المستزرعة في طبق 100 ملليمتر وإضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد أسبيراتينغ برنامج تلفزيوني, إضافة اثنين من ملليلتر من 0.05٪ trypsin EDTA الحل واحتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق.
بعد ثلاث دقائق، تحقق من مفرزة الخلية باستخدام مجهر مقلوب. وإذا لم يتم فصل الخلايا، واحتضان لمدة دقيقة إلى دقيقتين مرة أخرى. مرة واحدة يتم فصل جميع الخلايا، إضافة خمسة ملليلتر من متوسط النمو الطازج إلى لوحة.
بعد شطف لوحة باستخدام خليط تريبسين المتوسطة، واستخدام ماصة المصلية العقيمة لجمع الخلايا في نظيفة، معقمة 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. بعد ذلك ، بيليه أسفل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد قرصنة supernatant، resuspend بيليه الخلية في 10 ملليلتر من متوسط النمو الطازج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
لحساب الخلية، إضافة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر ميكروسينتر الطرد الدقيق التي تحتوي على 30 ميكرولتر من محلول 0.4٪ تريبان الأزرق، ثم إضافة 10 ميكرولتر من الخليط تحت غطاء غرفة عد مقياس الدم. تحت المجهر المقلوب أو برايتفيلد، عد الخلايا غير الملطخة القابلة للحياة باستخدام عدسة هدف 10X وأربع غرف ملليمتر مربع واحد وحساب رقم الخلية كما هو موضح في المخطوطة النصية. استخدم المعادلة C1V1 يساوي C2V2 لتحديد الحجم المطلوب من تعليق الخلايا والمتوسطة الطازجة المطلوبة لإعداد تعليق الخلية بتركيز نهائي من 10 مرات إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.
استخدام micropipetter متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في آبار لوحة 96 جيدا وفقا لتصميم لوحة. استخدام micropipette لإضافة 530 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل واحد من الشريحة الغرفة وفقا لتصميم لوحة واحتضان بين عشية وضحاها. إعداد 10 ملليلتر من وسيط التنشيط التي تحتوي على غاما الإنترفيرون بتركيز 250 نانوغرام لكل ملليلتر لتنشيط خلايا الضامة في طبق واحد 100 ملليمتر.
يستنشق متوسط النمو من ثقافات خلايا الضامة ويشطف الخلايا بخمسة ملليلترات من وسيط التنشيط الخالي من أشعة غاما الإنترفيرون. بعد أسبيراتينغ المتوسطة الشطف في الطبق التجريبي، إضافة 10 ملليلتر من تنشيط المتوسطة تكملها أشعة غاما الإنترفيرون. وفي طبق التحكم، أضف 10 ملليلتر من وسيط التنشيط بدون إنترفيرون غاما، ثم احتضن الخلايا لمدة 16 إلى 24 ساعة.
في نهاية الحضانة ، لإعداد الثقافات المشتركة ، قم بإزالة وسيط التنشيط من خلايا الضامة وإضافة خمسة ملليلترات من وسيط النمو الطازج. استخدام رافع الخلية لكشط بلطف الخلايا وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد ذلك، عد الخلايا باستخدام استبعاد تريبان الأزرق والخلايا الهيموستومترية، تليها إعداد السيطرة وتعامل تعليق خلايا الضامة بتركيز مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر كما هو موضح سابقا للخلايا الجذعية mesenchymal.
يستنشق بلطف المتوسطة من الآبار التجريبية التي تحتوي على الخلايا الجذعية المتوسطة. استخدام micropipette متعددة القنوات لإضافة 100 ميكرولتر من المعالجة وتعليق خلية الضامة التحكم في الآبار التجريبية المناسبة وفقا لتصميم لوحة واحتضان بين عشية وضحاها كما هو موضح. يستنشق بلطف المتوسطة من الشريحة غرفة أربعة جدران تحتوي على الخلايا الجذعية المتوسطة.
استخدام micropipette لإضافة 530 ميكرولتر من تعليق الخلية الضامة إلى الآبار المناسبة وفقا لتصميم واحتضان بين عشية وضحاها. إضافة ملليلتر واحد من الخلايا الحية التصوير المتوسطة إلى القارورة التي تحتوي على ملليغرام واحد من جزيئات Zymosan وجمع خليط الجسيمات المتوسطة في أنبوب زجاج الثقافة. بعد شطف القارورة مع ملليلتر واحد إضافي من محلول التصوير ، قم بنقل وسيط التصوير المشطف في الأنبوب الزجاجي ، ثم أضف ثلاثة ملليلترات من محلول التصوير الإضافي لتحقيق 0.2 ملليغرام لكل تعليق جسيمات Zymosan ملليلتر.
دوامة تعليق Zymosan باستخدام نبضات سريعة لمدة 30 إلى 60 ثانية، ثم استخدام سونيكاتور التحقيق ل sonicate التعليق مع 60 نبضة سريعة. بعد قرصنة الوسط، شطف الآبار التجريبية والآبار الفارغة الكاشفة مع 100 ميكرولتر من محلول تصوير الخلايا الحية. بعد ذلك ، يستنشق محلول تصوير الخلايا الحية من الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق Zymosan.
افتح درج لوحة القارئ الفلوري باستخدام واجهة لوحة اللمس. ضبط لوحة دون غطاء في علبة مع بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا. أغلق الدرج باستخدام لوحة اللمس وانقر على زر القراءة الأخضر في القائمة العلوية.
لإجراء فحص البلعوم ، بعد شطف البئر التجريبي الأول مع 750 ميكرولتر من وسيط التصوير ، أضف 400 ميكرولتر من تعليق Zymosan تاركا الآبار المتبقية في وسط النمو. بعد ذلك ، ضع الشريحة على المرحلة المحتضنة من نظام التصوير. استخدم برنامج التصوير.
حدد خيار برايتفيلد ضمن علامة التبويب تحديد موقع، ثم انقر فوق أيقونة العدسة. مع الهدف 10X في مكان، واستخدام العدسة ومقبض التركيز للتركيز على الخلايا. حدد علامة التبويب الاستحواذ.
افتح القائمة المنسدلة للتجربة وحدد مجموعة من الأطوال الموجية التي تتضمن مرشح EGFP الذي تم تعيينه لاستيعاب 509 نانومتر من الإثارة وأطوال موجية لانبعاثات 533 نانومتر من الصبغة الحساسة لمقياس الحموضة. عندما يتم ترك حوالي دقيقتين على جهاز ضبط الوقت، انقر على رمز 20X في القائمة الهدف لتغيير الهدف إلى 20X، ثم انقر على قائمة القنوات، حدد مرشحات EGFP، وفي قائمة التعرض، تعيين وقت التعرض إلى 400 مللي ثانية للكشف عن الفلوروفوري الأخضر الحساسة لhh، ومن ثم انقر على العيش. بعد ضبط التركيز، انقر على التوقف لإيقاف تشغيل الضوء والتحقق من المربع بجوار الإعداد التجريبي الفاصل الزمني العلوي.
في قائمة إستراتيجية التركيز، حدد التركيز التلقائي للبرامج ومن القائمة المنسدلة، حدد الإعدادات الذكية والأساسية لتقليل وقت التعرض للضوء أثناء تشغيل التركيز التلقائي. في القائمة الفاصل الزمني، قم بتعيين العدد المطلوب من عمليات الاستحواذ إلى 30 إلى 60، ووقت الفاصل الزمني إلى دقيقة واحدة، ثم انقر على زر بدء التجربة لبدء عملية الاستحواذ. تمت دراسة تأثير غاما الإنترفيرون على الثقافة المشتركة.
تظهر النتائج التمثيلية أن الثقافة المشتركة لل الضامة مع الخلايا الجذعية الميكنشيمالية تعزز النشاط البلعوي للكواميرا. يقلل علاج غاما الإنترفيرون من نشاط الضامة. ومع ذلك ، في وجود الخلايا الجذعية mesenchymal ، تم إنقاذ النشاط البلعوي الضام جزئيا.
كثافة الخلايا المثلى حاسمة في هذه الدراسات. وعندما كانت خلايا الضامة مطلية عند مستوى منخفض جدا من الكثافة، لم يتم اكتشاف التغيرات في كثافة الفلورسينس. عندما كانت الخلايا الضامة مطلية بكثافة عالية ، تم رفع كثافة الفلورسينس بسرعة في جميع المجموعات ولم يتم تمييز الاختلافات.
واحدة من أهم الأشياء خلال هذا الإجراء هو التأكد من أن كثافة الخلايا هي الأمثل وأبقى متسقة بين التجارب.
