فإن الكتاب أن نعترف الدكتور إسحاق زامبرانو والموظفين في العين بنك مانشستر مستشفى العيون لتوريد أنسجة العين المانحة البشري، والسيد بيت ووكر كلية مرفق علوم الحياة الأنسجة للصور H &amp; E الملون. شكر خاص يذهب إلى السيد روجر ميدوز لمساعدته مع المجهري. مجلس القضاء الأعلى هو المستفيد من مجلس البحوث الطبية زمالة التنمية (MRC) الوظيفي (MR / K024418 / 1) والكتاب كما يقر تمويل البحوث التي أجريت مؤخرا غيرها من MRC (G0900538 وK004441)، الكفاح من أجل البصر (1866) وجمعية البقعي.

تم الحصول على أنسجة العين البشرية افقت لأغراض البحث من رويال بنك العيون مانشستر مستشفى العين بعد إزالة القرنية للزرع. كان استخدام الأنسجة البشرية لأغراض البحث وفقا للقانون الأنسجة البشرية (2004) المبادئ التوجيهية، وبموافقة لجنة أخلاقيات البحوث الجامعية (المرجع 11305). 1. إثراء غشاء بروك الجامع ل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف مساحة عمل حول وتحت المجهر تشريح مع 1٪ مطهر (ت / ت) ثم يمسح أسفل مع 70٪ (ت / ت) الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان يلي لتسليم: واحد مشرط المتاح الجديد، وهما كاشطات معقمة الخلية (التي يشيع استخدامها في زراعة الأنسجة) وثلاثة أزواج من ملاقط (المدرجة هنا كما A، B، C و، انظر قائمة المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العالم العين إلى المتاح بتري طبق، والإبقاء على غطاء لاستخدامها لاحقا. باستخدام مشرط المتاح جديد، وإزالة أي العصب البصري المتبقية، والتي قد تتداخل مع خلق مو شقةالاتحاد الوطني للعمال النسيج. بعد ذلك، جعل أربعة شقوق زمنية متساوية بصرف النظر لإنشاء أربعة أجزاء، إذا الشروع في جزء 3 (إثراء غشاء البقعي بروك) لا قطع طريق منطقة البقعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن الشقوق تمتد من خلال عمق كامل للأنسجة العين - من الشبكية العصبي الحسي الأعمق (NSR)، من خلال المشيمية والصلبة (بياض العين). مواصلة شق على طول الطريق الجولة العين من هامش فنجان العين في العصب البصري. وهذا سوف يسمح فنجان العين إلى بالارض خارج (انظر الشكل 1B). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد رباعي واحد من فنجان العين بالارض باستخدام الملقط A (لمنع انفصال المشيمية)، استخدم أكبر منتاش B لقبضة NSR الزجاجي والأسباب الكامنة وسحب هذا النسيج بعيدا عن الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) ابتداء من المحيط، والانتقال نحو المركز من فنجان العين فتح ومن ثم إلى الجانب الآخر. عادة، ولكن ليس دائما على حد سواء زجاجي وNSR فصل واحد. استخدام scalpeل لاستئصال أي NSR المتبقية الراسية في القرص البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى، في حين عقد رباعي واحد من الأنسجة في مكانها باستخدام الملقط A، استخدام مكشطة خلية العقيمة لطرد بلطف أحادي الطبقة RPE من السطح الداخلي بأكمله من فنجان العين. هذه الخلايا فصل بسهولة ويمكن رؤية كتل البني الداكن كما المصطبغة. شطف مع برنامج تلفزيوني لغسل بلطف الخلايا RPE طردت بعيدا عن فنجان العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، واستخدام الملقط A إلى تقشر بلطف المغطي الأنسجة الحمراء الداكنة (التي تضم كلا غشاء بروك والمشيمية) من جميع الأرباع العين 4. وضع الأنسجة استئصاله في طبق نظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حافة بالارض من مكشطة خلية واحدة لعقد الأنسجة رفعه في المكان، استخدام مكشطة الثانية لكشط بلطف الأنسجة. تحويل الأنسجة مرارا وتكرار، وإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الزائدة ممكن. في نهاية المطاف، فإن غشاء شفاف يبقى: هذا هو غشاء بروك المخصب بصورة فجة. استخدام المجهر تشريح في ما لا يقل عن 20X التكبيرضروري في المساعدة على إزالة المشيمية وإثراء غشاء بروك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة باستور، وشطف لفترة وجيزة غشاء بروك مع الماء عالى النقاء لإزالة المشيمية المتبقية والدم قبل وضع الغشاء في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق غشاء بروك المخصب في حوالي 1 مل من الماء عالى النقاء ودوامة لفترة وجيزة (حوالي 15 ثانية) لمساعدة ليز أي مسألة الخلوية تلويث (انظر الشكل 2). الطرد المركزي العينة في 500 x ج لمدة 30 ثانية لتكوير الغشاء ونضح من طاف. ملاحظة: الغشاء المتبقية المخصب بروك جاهز الآن للذوبان (كما هو موضح في القسم 2 أدناه) أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. </li></ol> 2. ذوبان للغشاء والغربية وصمة عار تحليل الجامع المخصب بروك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج البروتين من التخصيب غشاء بروك عن طريق غمر النسيج في 500 ميكرولتر 8 M اورعصام لمدة 6 ساعة على RT في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات solubilized أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة لتكوير أي موضوع خارج الخلية المتبقية. إزالة طاف ونقلها إلى 3500 دا MWCO غشاء غسيل الكلى، ثم وضع العينة في 1 لتر من برنامج تلفزيوني لdialyse لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، إضافة 40 ميكرولتر من الخرز البروتين العزلة، وتناوب عينة / مزيج حبة (20 دورة في الدقيقة على خلاط الدورية) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الخرز. إزالة طاف وإذابة البروتين بد أن الخرز في 30 ميكرولتر 2X العازلة تحميل عينة (65.8 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 2.1٪ SDS، 26.3٪ (ث / ت) الجلسرين، 0.01٪ برموفينول الأزرق، 3٪ β المركابتويثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير حبات المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل طاف التي تحتوي على بروتينات صدر يوم إلى ما قبل الصب SDS-هلام الصفحة التدرج (انظر قائمة المواد) للفصل البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور العصابات البروتين منفصلة باستخدام بروتوكول تلطيخ المشترك، على سبيل المثال، Coomassie الأزرق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وباختصار، إضافة 20 مل من وصمة عار الزرقاء الرائعة (0.1٪ الزرقاء الرائعة (ث / ت)، 50٪ الميثانول، 10٪ حامض الخليك الجليدي، 40٪ ماء) إلى هلام، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT مع الإثارة لطيف . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الحل تلطيخ وغسل هلام ملطخة الماء منزوع الأيونات حتى يتم تقليل تلوين الخلفية بما فيه الكفاية للسماح للبروتين الملون الفرقة التصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، فصل نقل العصابات البروتين لنتروسليلوز لتحليل الغربي، كما هو موضح أدناه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل فصل العصابات البروتين على غشاء النيتروسليلوز في 80 أمبير لمدة 2.5 ساعة باستخدام جهاز نقل شبه الجافة في المخزن نقل (25 ملي تريس، 192 ملي جليكاين، 10٪ [ت / ت] الميثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الغشاء في 10 مل PBS، 10٪ (ث / ت) الحليب، و 0.02٪ (ث / ت) BSA لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية قبل عشربالإضافة إلى ذلك (ه) من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة للكشف عن البروتين. ملاحظة: وكمثال على ذلك هنا، ويبين الشكل 3C لطخة مناعية التمثيلي solubilised غشاء بروك من ثلاث جهات مانحة منفصلة سبرت لمنظم من سلسلة مكملة، مثل عامل H البروتين 1 (FHL-1). </li></ol> 3. إثراء غشاء البقعي بروك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 1،1-1،3 كما هو موضح سابقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن NSR لا يزال قائما، حدد موقع تلون نقري الأصفر الذي يمثل منطقة البقعة المركزية (انظر الشكل 4). باستخدام معقم 6 ملم خزعة لكمة، وضعه فوق المنطقة نقيرية وخفض بشدة في أن البقعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على لكمة خزعة في المكان، وجعل شق منفصل مع مشرط من على حافة فنجان العين إلى حافة شفرة خزعة لكمة، ومن ثم استخدام الملقط B، قشر بعيدا للمادة العين المحيطة لتحقيق خزعة نظيفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط C، وإزالة6 مم القرص من نسيج لكمة ومكان على نظيفة بتري غطاء الطبق. وضع غطاء طبق بتري وكمة البقعي تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القرص NSR رقيقة (التحقق من الأصفر نقري تلطيخ للاستدلال دقة خزعة). استخدام مكشطة الخلية معقمة لإزالة بلطف الخلايا RPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين القرص البقعي عن طريق الصلبة باستخدام نصائح من الملقط A، وقشر ببطء قبالة المشيمية ومجمع غشاء بروك باستخدام الملقط C. مرة أخرى، واستخدام مكشطة خلية لإزالة المشيمية غير المرغوب فيها والنظر الدم من غشاء بروك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غشاء البقعي بروك في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتعليق في 1 مل عالى النقاء المياه. دوامة لفترة وجيزة (حوالي 15 ثانية) لمساعدة ليز أي مسألة الخلوية تلوث. الطرد المركزي العينة في 500 x ج لمدة 30 ثانية لتكوير الغشاء ونضح من طاف. ملاحظة: يمكن الآن للغشاء بروك المخصب معزولة عن البقعة أن تستخدم لالبروتينalysis باستخدام بروتوكولات الهضم المفضلة للمستخدم. </li></ol>

<ol>
	<li>Coleman, H. R., Chan, C. -. C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 372, 1835-1845 (2008).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Coleman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life:+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures.">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+haplotype+in+the+complement+regulatory+gene+factor+H+(HF1/CFH)+predisposes+individuals+to+age-related+macular+degeneration.">A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).</li><li>Klein, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+in+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 385-389 (2005).</li><li>Haines, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch&#8217;s+membrane.">The dynamic nature of Bruch&#8217;s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch&#8217;s+membrane:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch&#8217;s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li><li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

نحن هنا وصف إثراء غشاء بروك لمزيد من التحليل السماح التحليلات اللاحقة بما في ذلك النشاف الغربي 11، مطياف الكتلة وخصائص انتشار غشاء بروك الاستفادة تعديل Ussing غرف 11،14. وتشمل الخطوات الحاسمة أ) تجريف شامل وغسل السطح الداخلي للعين لإزالة جميع RPE الخلايا ب) تجريف المتكررة ودقيق للالمشيمية الكامنة دون التسبب في بروك في التفكك وج) غسل في بروخ رفعه في الماء عالى النقاء لضمان تحلل الخلايا المتبقية. وعلاوة على ذلك، إذا غشاء بروك المخصب هو لاستخدامها لتحليل البروتين، واستخراج البروتين عن طريق العلاج اليوريا هو الأكثر فعالية في كسر هذا النسيج مرونة بالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل تجانس الميكانيكية. الأنسجة من غشاء المخصب بروك يشير لا يتم إزالة ECM من المشيماء الشعيرية. هذا هو أن تكون السابقينيتم تشكيل pected والطبقة الخارجية من غشاء pentilaminar بروك التي المشيماء الشعيرية البطانية الأغشية الطابق السفلي الخلية. والواقع أنه قد يكون من المفيد أن ECM من المشيماء الشعيرية يبقى كما تحدث تغييرات في هذا في AMD بما في ذلك ترسب تكملة محطة مجمع مجمع / هجوم غشاء (MAC) 15. وتجدر الإشارة إلى أن للتحليل النسيجي مفصل لغشاء بروك، وهيكلها سيتم الحفاظ على أفضل إذا مقطوع في وجود الصلبة، المشيمية، وغشاء بروك. والواقع أن الأنسجة المعروضة في الشكل 2 يهدف فقط للتدليل على درجة تخصيب الناتجة عن تقنية الموضحة في هذه المخطوطة. إثراء البقعي في بروخ يتطلب تشريح دقيق للفنجان العين، وضمان أن NSR وخصوصا النقرة لا تلف. خلاف ذلك تحديد وبالتالي عزل البقعة ليست ممكنة. سلامة TISSUالبريد مهم أيضا في هذه العملية، وبالتالي فمن المستحسن أن العينات تحت 48 ساعة مرة بعد الوفاة استخدامها. درجة التخصيب المطلوبة تتراوح ما بين الجهات المانحة ويمكن أن تتأثر سن المانحة، والوقت بعد الوفاة، ووجود أي أمراض العين. استخدام مصطلح المخصب متعمد في الاعتراف جود قيود على هذه التقنية، وهذا هو أن &quot;تنقية&quot; أو &quot;العزلة&quot; غشاء بروك استخدام هذا الأسلوب هو ببساطة غير ممكن. في الواقع، بالنظر إلى أن ECM من المشيماء الشعيرية يندمج غشاء بروك هناك فصل كامل غير ممكن. فهم التغيرات البيوكيميائية للأنسجة العين منها أمر أساسي في فهم تطور المرض العين. هذا تخصيب فريد من غشاء بروك يسهل هذا الفهم. الدراسات الجارية تحقق في بروتيوم من البقعي المخصب غشاء بروك باستخدام مطياف الكتلة في مراحل مختلفة من AMDوفي العينات القادمة من الموضوعات مع الأنماط المختلفة لتحسين فهم علم الأمراض الجزيئي للAMD. إذا تم استخدام تقنية الموضحة هنا لتحديد بنجاح FHL-1 كمنظم لتكملة السائد في غشاء 11 و مزيد من الدراسات بروك على غشاء المخصب بروك من المرجح أن يؤدي إلى المزيد من الأفكار الجديدة في علم الأمراض الجزيئي للAMD.

استخدام ما بعد الوفاة أنسجة العين البشرية في مجال البحث في طب العيون هو مصدرا قيما لفهم المرض والتسبب في العين. جعلت تحليل العينين المانحة الإنسان مساهمات هامة لالمميزين الآليات التي تقوم عليها، الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، والذي هو السبب الرئيسي للعمى في العالم الغربي 1. على الصعيد العالمي، وحسابات AMD لحوالي 8.7٪ من مجموع العمى ومع شيخوخة السكان على نحو متزايد، ومن المتوقع أن تؤثر على 196 مليون شخص بحلول النتائج 2020 2. AMD في فقدان الرؤية المركزية، ولها تأثير عميق على الاستقلال المريض ونوعية الحياة 3. يتميز AMD في وقت مبكر من تشكيل براريق شفافة ويمكن ان يتطور الى ضمور الجغرافي (يشار إليها أحيانا باسم &quot;الجاف&quot; AMD)، أو اتساع الأوعية الدموية المشيمية (كما يشار إلى حديث التوعي أو &quot;الرطب&quot; AMD). بينما لمكافحة VEGF الحقن يمكن أن تستقر أو تحسين الرؤية في التوعية المستحدثة AMD هو أناليست علاجية، وفي الوقت الحاضر، لا يوجد علاج لضمور الجغرافي. بينما ثبت بعض المتغيرات الجينية لتعديل خطر AMD 4-8، لا يعرف الكثير عن كيفية تأثير هذه المتغيرات على البقعة على مستوى الكيمياء الحيوية. موقع مهم في AMD المرضية هو غشاء بروك. وقد وفرت شكل براريق شفافة داخل هذا الهيكل والدراسات المختلفة دليل على تفعيل مكمل في وحول غشاء بروك في AMD 9. غشاء بروك هو ورقة من المصفوفة خارج الخلية الذي يفصل بين الشبكية الصبغية الطلائية (RPE) الخلايا من المشيمية، وحوالي 4 ميكرون سميكة. يندمج غشاء بروك في المشيماء الشعيرية، وطبقة من المشيمية التي تحتوي على الشعيرات الدموية منوفذة والخارجية لهذا هي طبقات تحتوي على الأوعية الدموية الكبيرة 10 (الشكل 1A). غشاء بروك هو ورقة pentilaminar من خارجمصفوفة الخلوية (ECM)، وهذه المنهجية تفاصيل كيفية عزل غشاء بروك، جنبا إلى جنب مع ECM من المشيماء الشعيرية الأساسية (المشار إليه التخصيب غشاء بروك)، وهو decellularized إلى حد كبير وخالية من خلايا الدم الحمراء. ثم تم استخدام غشاء المخصب بروك لغرب النشاف والأنسجة التجارب. وعلاوة على ذلك، وصفت منهجية لتخصيب غشاء بروك فقط من منطقة البقعة من العين، والتي سوف تكون ذات أهمية خاصة لتلك التي تحقق في الجوانب الحيوية من AMD.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

الضمور البقعي (AMD) المرتبطة بالعمر هو السبب الرئيسي لضعف البصر في العالم المتقدم. المرض يظهر نفسه من خلال تدمير مركز الشبكية، وتسمى البقعة، مما أدى إلى فقدان الرؤية المركزية. يتميز AMD في وقت مبكر من وجود آفات صفراء صغيرة تسمى براريق شفافة لينة يمكن أن تقدم على أواخر AMD مثل ضمور الجغرافي (تجف AMD) أو neovascularisation (AMD الرطب). على الرغم من التغيرات السريرية وصفا جيدا، وفهم التأثيرات الجينية على منح خطر AMD هي الحصول على أي وقت مضى أكثر تفصيلا، منطقة واحدة تفتقر تقدما كبيرا هو فهم العواقب البيوكيميائية من المخاطر الجينية. ويرجع هذا جزئيا إلى صعوبات في فهم الكيمياء الحيوية للغشاء بروك، مصفوفة خارج الخلية رقيقة جدا أن تعمل كمصفاة البيولوجي من المواد في إمدادات الدم وسقالة الذي الشبكية الصبغية الطلائية (RPE) أحادي الطبقة خلية يقيم هذا. براريق شفافة ومكتب إدارة السجلات داخل غشاء بروك وجودهم يعطل تدفق المغذيات إلى الخلايا RPE. فقط من خلال التحقيق في تكوين البروتين من الغشاء بروك، بل وكيف تتفاعل البروتينات الأخرى مع ذلك، يمكن أن يأمل الباحثون لكشف الآليات البيوكيميائية التي تعزز تشكيل براريق شفافة، وتطوير AMD وفقدان الرؤية لاحقة. تفاصيل هذه الورقة منهجيات لتخصيب إما الغشاء كله بروك، أو فقط من منطقة البقعة، بحيث يمكن استخدامها لتحليل الكيمياء الحيوية المصب، وإعطاء أمثلة عن كيف أن هذا بدأ يتغير بالفعل فهم الكيمياء الحيوية غشاء بروك.

بروتوكول المذكورة أعلاه لتنتج إثراء النتائج غشاء بروك في عزلة غشاء بروك، وECM من المشيماء الشعيرية ويزيل معظم الخلايا / الحطام الخلوي بما في ذلك جميع RPE (الشكل 2). غسل غشاء بروك المخصب في الماء هو خطوة رئيسية في أي الناشر الخلايا المشيمية المتبقية. الضغوط التي تمارس خلال تخريد المشيمية يبدو أن ضغط بعض من عدد قليل من نوى الخلايا المتبقية في المنطقة التي تعرف بأنها غشاء بروك (الشكل 2B). وsolubilisation غشاء المخصب بروك يسمح للتحليل المصب من محتواه من البروتين. فصل العصابات البروتين من solubilised التخصيب غشاء بروك باستخدام 4-12٪ هلام التدرج SDS-PAGE، في حين ليست مفيدة في حد ذاتها لتحديد محتوى البروتين، لا تبرهن على قدرة هذه التقنية للحد من تلوث بروتينات الدم التي عالبريد غير ملزمة على وجه التحديد (الشكل 3B). في هذا الصدد، واحدة الغائب ملحوظ من تشغيل جل البروتين هي الفرقة كبيرة من ألبومين المصل البشري (~ 66 كيلو دالتون) التي قد تجعل ذلك اللاحقة الغربية النشاف من الصعب تفسير: التحليل النسيجي للغشاء المخصب بروك هو مبين في الشكل 2 أيضا الدعم هذه. في الواقع، كجزء من العمل الموصوفة سابقا 11، solubilised جرى التحقيق غشاء بروك من مجموعة من الجهات المانحة الفردية لعدد من البروتينات باستخدام أجسام مضادة محددة عن طريق ويسترن النشاف (الشكل 3C). في حالة المعروضة هنا، والأجسام المضادة (وهو ما يسمى OX23) 12 موجه ضد 155 كيلو دالتون منظم الحصانة الفطرية، ودعا عامل مكمل H (FH)، واستخدمت وأثبتت وجود انخفاض الفرقة الوزن الجزيئي في عينات غشاء بروك من ثلاثة منفصلة الجهات المانحة (الشكل 3C). هذا تحولت فيما بعد إلى أن تكون عاملا مثل H البروتين 1 (FHL-1)، وهو بروتين 49 كيلو دالتون المتعلقة FH والناشئة عن الاختلاف لصق من نفس الجين 13. FHL-1 يبدو أن الرئيس الحالي المنظم مكملا في غشاء بروك 11. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> الشكل 1. تشريح العين البشرية وإثراء غشاء بروك. (A) غشاء بروك هو حاجز المصفوفة خارج الخلية. تحتوي المشيمية طبقة من الشعيرات الدموية منوفذة أن دمج باستمرار في غشاء بروك (تسمى المشيماء الشعيرية) وهذه تفصل بقية المشيمية (التي تحتوي على الأوعية الدموية الكبيرة) من الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) أحادي الطبقة الخلية، والتي تدعم من الناحية الفسيولوجية للخلايا مستقبلة للضوء الشبكية العصبي الحسي (NSR). (ب) أربعة شقوق في فنجان العين البشرية وجعل السماح لها ليتم فتحه لخلق جبل مسطح. الويمكن إزالة الجسم الزجاجي باستخدام الملقط. وNSR قد تؤتي ثمارها مع الجسم الزجاجي ولكن يمكن أيضا إزالتها مع ملاقط. يتم استخدام مكشطة خلية لإزالة طبقة الخلايا RPE من غشاء بروك في حين انها لا تزال ترتكز على المشيمية والصلبة. مجمع غشاء / المشيمية بروك يمكن مقشر بعيدا عن الصلبة واستخدام مكشطة خلية جديدة، يمكن إزالة المشيمية الخارجي. A غسل النهائي في الماء عالى النقاء lyses أي مسألة الخلوية المتبقية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> الشكل 2. الأنسجة من غشاء بروك والأقسام المشيمية. H &amp; E الملون قبل (A) وبعد (B) كشط بعيدا الهياكل المشيمية الخارجي من غشاء بروك والغسيل في وا عالى النقاءثالثا لتوليد إثراء غشاء بروك. تمثل الحانات نطاق 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> الشكل 3. Solubilisation من غشاء المخصب بروك لتحليل محتوى البروتين. (A) البروتين يمكن استخراجها من غشاء المخصب بروك التي يحتضنها في 8 M اليوريا لمدة 6 ساعة على RT، قبل أن dialysed ضد برنامج تلفزيوني. لتحليل الغربي، والبروتينات من كامل ديالة غشاء بروك يمكن عزلها باستخدام الخرز البروتين العزلة ومزال من قبل الغليان مع laemmli خفض العازلة تحميل عينة (B) ممثل Coomassie الأزرق الملون هلام SDS-PAGE، والتي تبين على حد سواء أنيق والمخففة solubilised غشاء بروك (BM) باستخدام طريقة د. escribed في (A) (C) لطخة غربية تمثيلية من solubilised غشاء بروك من 3 جهات مانحة فردية (الممرات 1-3). بحثها عن عامل مثل H البروتين 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> الرقم 4. عزل غشاء المخصب بروك من البقعة. منطقة البقعة في شبكية العين هي منطقة 5 ملم التي يمكن تحديدها بسهولة من قبل صفرة النقرة الفوقية، وقربها من القرص البصري المجاور. استخدام النقرة كدليل، وضع 6 ملم خزعة لكمة على العين البشرية التي شنت شقة لاستئصال 6 مم البقعة كتلة الأنسجة. إزالة NSR المغطي وكشط الخلايا RPE من البقعة رفعه. مجمع غشاء / المشيمية بروك المتبقية في وسعها لن تكون مقشر بعيدا عن الصلبة وكشط جيدا لإزالة المشيمية، ليز المتبقية المواد الخلوية من قبل الغطس في الماء عالى النقاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes at JoVE.com

Enrichment of Bruch&#039;s Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

إثراء غشاء بروك من عيون المانحة الإنسان

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

11.9K Views.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Video: Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

الاشتقاق الثقافات السحايا الرقيقة يزدرع من تشريح الجهات المانحة الدماغ البشري

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

وضع البروتوكول المكرر لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية ترانس-سكليرال سوبريتينال في عيون الفئران

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

عزل من الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة المخ البشري الطازج

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular pressure (IOP) which&#160;can identify various pathogenic paradigms related to the glaucoma pathogenesis. Ex vivo human anterior segment perfusion organ culture models have previously been successfully utilized and applied as effective technologies for the discovery of glaucoma pathogenesis and testing of therapeutics. Preclinical drug screening and research performed on ex vivo human organ systems can be more translatable to clinical research. This article describes in detail the generation and operation of a novel ex vivo human translaminar pressure model called the translaminar autonomous system (TAS). The TAS model can independently regulate ICP and IOP using human donor posterior segments. The model allows for studying pathogenesis in a preclinical manner. It can reduce the use of living animals in ophthalmic research. In contrast to in vitro experimental models, optic nerve head (ONH) tissue structure, complexity, and integrity can also be maintained within the ex vivo TAS model.

We describe and detail the use of the translaminar autonomous system. This system utilizes the human posterior segment to independently regulate the pressure inside the segment (intraocular) and surrounding the optic nerve (intracranial) to generate a translaminar pressure gradient that mimics features of glaucomatous optic neuropathy.

نموذج النظام المستقل عبرلامينار لتعديل الضغط داخل العين وداخل الجمجمة في الأجزاء الخلفية للمانحين البشريين

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

الحصول على ميكروجليا الإنسان من أنسجة الدماغ البشري الكبار

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

التصوير متعدد الوسائط القائم على OCT لعيون المتبرعين البشريين لأبحاث AMD

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging could add prognostic value to laboratory findings. In this work, ex vivo OCT and MMI were applied to human donor eyes prior to retinal tissue sectioning. The eyes were recovered from non-diabetic white donors aged &#8805;80 years old, with a death-to-preservation time (DtoP) of &#8804;6 h. The globes were recovered on-site, scored with an 18 mm trephine to facilitate cornea removal, and immersed in buffered 4% paraformaldehyde. Color fundus images were acquired after anterior segment removal with a dissecting scope and an SLR camera using trans-, epi-, and flash illumination at three magnifications. The globes were placed in a buffer within a custom-designed chamber with a 60 diopter lens. They were imaged with spectral domain OCT (30&#176; macula cube, 30 &#181;m spacing, averaging = 25), near-infrared reflectance, 488 nm autofluorescence, and 787 nm autofluorescence. The AMD eyes showed a change in the retinal pigment epithelium (RPE), with drusen or subretinal drusenoid deposits (SDDs), with or without neovascularization, and without evidence of other causes. Between June 2016 and September 2017, 94 right eyes and 90 left eyes were recovered (DtoP: 3.9 &plusmn; 1.0 h). Of the 184 eyes, 40.2% had AMD, including early intermediate (22.8%), atrophic (7.6%), and neovascular (9.8%) AMD, and 39.7% had unremarkable maculas. Drusen, SDDs, hyper-reflective foci, atrophy, and fibrovascular scars were identified using OCT. Artifacts included tissue opacification, detachments (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystic change, an undulating RPE, and mechanical damage. To guide the cryo-sectioning, OCT volumes were used to find the fovea and optic nerve head landmarks and specific pathologies. The ex vivo volumes were registered with the in vivo volumes by selecting the reference function for eye tracking. The ex vivo visibility of the pathology seen in vivo depends on the preservation quality. Within 16 months, 75 rapid DtoP donor eyes at all stages of AMD were recovered and staged using clinical MMI methods.

تسليط الضوء على المؤلف: التصوير متعدد الوسائط القائم على Ex Vivo OCT لعيون المتبرعين البشريين للبحث في التنكس البقعي المرتبط بالعمر  

Laboratory assays can leverage prognostic value from the longitudinal optical coherence tomography (OCT)-based multimodal imaging of age-related macular degeneration (AMD). Human donor eyes with and without AMD are imaged using OCT, color, near-infrared reflectance scanning laser ophthalmoscopy, and autofluorescence at two excitation wavelengths prior to tissue sectioning.

إكس فيفو التصوير متعدد الوسائط القائم على OCT لعيون المتبرعين البشريين للبحث في التنكس البقعي المرتبط بالعمر

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...