وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من فاندربيلت ، انجرام السرطان غرانت مركز الدعم (P30 CA068485) ، واستئصال ورم من الدماغ مؤسسة الطفولة والمعاهد الوطنية للصحة (NS042205).

1. الجزئي تشريح الورم الحاملة المخيخ ، تفكك نسيج الورم والتصفيحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرجاعها من الأنسجة الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض موه الرأس وأعراض عصبية نموذجية ، بما في ذلك الشلل الخلفي والفشل في استعادة الموقف عندما انقلبت runted كانت في كثير من الأحيان المرضى نخاعي الفئران الحاملة. لاسترداد أنسجة الورم ، والموت ببطء الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون. فمن المهم عدم القيام خلع عنق الرحم ، وهو الإجراء الذي يولد الضغط في الجمجمة الخلفي ، ويمكن حل وسط الورم سلامة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ قطع الرؤوس على الفور بعد وفاة باستخدام مقص ، وإزالة الشعر والأنسجة العضلية قدر الإمكان عن التصور الجيد للجمجمة. تنظيف السطح من الجمجمة مع Kimwipe غارقة مع الايثانول 95 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص لقطع غرامة فتح على طول خط الوسط من الجمجمة ، وإزالة الأنسجة الجمجمة باستخدام الملقط غرامة ، والنقطة التي يتعرض لها الدماغ كله بما في ذلك الورم الحاملة المخيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن مخيخات من البالغين الأصحاء عرض محددة جيدا نصفي الكرة الأرضية ودودة ، ومخيخات من الفئران الحاملة للورم وغالبا ما تكون موسعة ، غير متبلور مع سطح أملس والأوعية الدموية واضح. باستخدام تقنيات عقيمة ، استرداد ورم مخيخي باستخدام الملقط ومكان في الجليد الباردة PBS دون Mg2 + و 2 + كا. </li></ol> ملاحظة : يتم تعقيم جميع الأدوات في الايثانول 95 ٪ قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكك نسيج الورم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنسجة الورم من برنامج تلفزيوني لAccutase 50 ٪ (المخفف في PBS) التي هي على وشك حجم 4 مرات من نسيج الورم ، واللحم المفروم مع النسيج المقص الغرامة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 دقائق ، وبعد ذلك يخضع الأنسجة pipeting المتكررة مع Pipetman 1 مل عن 3 دقائق إضافية. هذا الأسلوب يجب أن يسفر عن خليط من الخلايا واحد ومجاميع صغيرة الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق الخلوية 3 أضعاف مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز 1000 إلى خلايا بيليه. Resuspend بيليه في خلية جديدة في المتوسط ​​الجذعية العصبية خلية ثقافة والصعود إلى لوحة gelatinized Primaria 60 ملم صحن زراعة الأنسجة. نستخدم الأطباق Primaria لتعزيز المرفق في الطلاء الأولى ؛ قد يكون مطلي المقاطع اللاحقة على أطباق زراعة الأنسجة العادية. </li></ol></li></ol> ملاحظة : أطباق معطف الثقافة بنسبة 0.1 ٪ الجيلاتين لا يقل عن 30 دقيقة. اعداد جديدة من الخلايا الجذعية العصبية تتكون من مستنبت المتوسطة Neurobasal مع الجلوتامين ، القلم بكتيريا ، N2 ، B27 ، EGF الإنسان (25 نانوغرام / مل) ، وجمعية جيل المستقبل الأساسية (25ng / مل). 2. تخصيب اليورانيوم والصيانة والتوسع في الخلايا السرطانية عن طريق ممرات المسلسل نخاعي عادة ما نحصل على العديد من المستعمرات بعد 1 اسبوع من الطلاء الأولي (الشكل 1). يمكن لهذه المستعمرات يمكن فصلها وreplated على أطباق جديدة لتخصيب gelatinized من السكان الخلية السرطانية. التغيير الأول لثقافة جديدة متوسطة ، ثم ببساطة استخدام Pipetman 1 مل ميكانيكيا لفصل المستعمرات تليها pipeting متكررة لمدة 4 دقائق لتسفر عن تعليق الخلوية (أي Accutase الحاجة). الاختيار تحت المجهر للتأكد من أن الخلية كتل كبيرة قد تم فصلها. ثم الاستغناء عن التعليق على الخلية gelatinized أطباق جديدة لزراعة المزيد من وتذهب من خلال نفس الإجراء مقاطع إضافية. تتم إزالة الخلايا السرطانية غير مرتبط ، وخلايا الدم وأنواع الخلايا الأخرى عن طريق إعادة المسلسل التصفيح ، وترك الخلايا السرطانية تعلق في التوسع بسرعة. تغيير الثقافة المتوسطة في اليوم الثاني بعد غرس البذور الأولي ، وبعد ذلك مرة كل يومين. 3. مناعي يلطخ وفحص الخلايا المستزرعة 1. تنمو الخلايا السرطانية على الزجاج coverslips في يوم 1 ، ساترة الزجاج مكان واحد في كل من لوحة 6 - جيدا ، ثم يضاف الجيلاتين 0.1 ٪ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. البذور حوالي 2 10 5 - 4X الخلايا السرطانية لكل مليلتر. وينبغي إرفاق الخلايا بين عشية وضحاها ، والخلايا الجذعية العصبية المتوسطة تغيرت في اليوم 3. يتم تنفيذ تلطيخ يوم 4. 2 تلوين مناعي إزالة الخلايا المتوسطة الثقافة ويغسل مرتين مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني. تحديد الخلايا مع طازجة من صنع PFA 4 ٪ لمدة 15 دقيقة. غسل الخلايا لفترة وجيزة مرتين مع برنامج تلفزيوني وpermeablize مع تريتون 0.3 ٪ (في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا لفترة وجيزة مرتين مع برنامج تلفزيوني وكتلة مع مصل الماعز 10 ٪ لمدة 40 دقيقة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 90 دقيقة ، ثم يغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، لمدة 5 دقائق لكل منهما. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 60 دقيقة ، ثم يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، كل 5 دقائق. جبل coverslips على الشرائح مع 5 مل من الوسط المائي وتصاعد أداء المجهري متحد البؤر. 4. تمايز الخلايا السرطانية ن إزالةeural المتوسطة الخلايا الجذعية وغسل الخلايا لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني مرتين. إضافة متوسطة التمايز في اليوم 1 ، تغيير المتوسطة في يوم (4) وتحديد مستوى التمايز عن طريق تلوين المناعي في يوم 7. المتوسط ​​يتكون من تمايز DMEM ، القلم بكتيريا ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني. 5. ممثل النتائج مورفولوجيا النتائج وبعد العلاج Accutase pipeting المتكررة لطيف ، ينبغي للنسيج الورم يمكن فصلها معظمها في المجاميع والخلايا الصغيرة الخلوية واحد. ويمكن ملاحظة العديد من المستعمرات لا بأس به في أقرب وقت بعد 5 أيام الطلاء الأولي ، كما يتضح من الشكل رقم 1. الخلايا السرطانية التكاثري للغاية وغالبا ما تكون ثنائية القطبية مع ارتفاع نسبة النووية / هيولي. وتعتبر هذه الخلايا عادة يشع من المجاميع الخلوية الصغيرة التي تعلق على سطح gelatinized. وعادة ما تتم إزالة خلايا الدم والصغيرة والدور ، من خلال وسائل الاعلام التغييرات اللاحقة والتصفيح التسلسلي. بعد العديد من المقاطع ، يمكن للمرء الاحتفال وزعت بشكل موحد ، التكاثري Ki67 + الخلايا السرطانية وتلوث قليلا مع أنواع الخلايا الأخرى (الشكل 2). التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية ، والتحليل والتمايز في نسيلي الأنساب متعددة لتحديد ما إذا كانت الخلايا المشتقة من التكاثري نأت ورم مخيخي الخصائص تظهر الأنسجة من الخلايا الجذعية السرطانية ، أجرينا توصيف المزيد من الخلايا الجذعية علامة التعبير ، وقدرة التحليل نسيلي التمايز. وجدنا أن هذه الخلايا السرطانية معزولة للغاية التعبير عن علامات العصبية مثل الخلايا الجذعية وSox2 Nestin (الشكل 3). ونحن من الأنسجة استرجاع SmoM2 - YFP الورم ، وأعرب عن الخلايا السرطانية YFP. تتفق مع دراسة حديثة أن التقارير الأولية أهداب هامة لتطوير مسار نخاعي تعتمد SHH 12 ، SmoM2 - YFP تم التعبير بوضوح المترجمة إلى أهداب من Sox2 + الخلايا السرطانية (الشكل 3). عندما لاحظنا كثافة في نسيلي مطلي من 300 خلية لكل مليلتر من مستنبت ، والتوسع النسيلي من خلية الورم واحد إلى مستعمرة كبيرة (الشكل 4). وعلاوة على ذلك ، كانت هذه الخلايا قادرة على التمايز إلى مختلف أنواع الخلايا العصبية والدبقية عندما مثقف تحت الموالية للتمايز الظروف (الشكل 5). <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. مورفولوجية مستعمرة التكاثري للغاية بعد الطلاء الأولى من الأنسجة نخاعي فصلها. عموما ، فإن دلت على وجود أشكال مستعمرة كبيرة في غضون 5 أيام بعد الغرس الأولي من نسيج الورم فصلها ، وممثل واحد هنا في مجال مشرق. ثنائية القطبية ، وتشع الخلايا ممدود من مجموع الخلية الأساسية الكثيفة. تعلق على الخلايا السرطانية هي ، صغيرة مدورة خلايا الدم الحمراء ، التي استنفدت تدريجيا التصفيح التسلسلي. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مورفولوجيا الخلايا نخاعي أنشأت أكثر من ثلاثة مقاطع. هذه الصورة المشرقة حقل يظهر في مظهر نموذجي للخلايا نخاعي أنشئت بعد العديد من المقاطع. الخلايا تبقى في معظمها ثنائي القطبية مع نسبة النووية / هيولي عالية. نظهر الأسيتيل تلطيخ تويولين من الخلايا السرطانية ، ومعظمها الدراجات كما يتضح من التعبير Ki67 قوية. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. خلايا المنشأ نخاعي التعبير عن علامات العصبية الخلايا الجذعية. SmoM2 - YFP علامات الإعراب عن الخلايا النشطة constitutively SMO ، وبالتالي SHH النشاط الطريق. وأعرب عن خلايا المنشأ خلايا نخاعي خطوط YFP ، ومعظمهم شارك في أعربت مختلف مستويات عالية من العصبية علامات الخلايا الجذعية ، مثل Nestin وSox2. ومن المثير للاهتمام ، اكتشفنا أننا عندما يقوم YFP الكشف عن إشارة مع الحد الأدنى من قوة الليزر خلال الفحص المجهري متحد البؤر ، وتتركز في إشارة YFP أهداب الخلايا + Sox2. هذه الملاحظة بما يتفق مع تقرير حديث أن 12 صفه بالدور الأساسي للأهداب في تطوير مسار نخاعي تعتمد SHH. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الخلايا السرطانية أنشئت الخضوع التوسع نسيلي. بعد تفكك في تعليق خلية واحدة ، كانت مطلية الخلايا السرطانية في الصعود إلى 24 صفيحة جيدا في مناطق ذات كثافة نسيلي من 300 خلية لكل مليلتر من المتوسط ​​الثقافة. في كل بئر احظنا توسيع المستعمرات clonally. هذه السلسلة من الصور تظهر التغييرات الميدانية مشرق نموذجي خلال فترة 10 يوما للثقافة. <img src="/files/ftp_upload/2086/2086fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. تحليلات تمايز الخلايا نخاعي المنشأ. عندما تحول الخلايا السرطانية من EGF / bFGF يحتوي المصل خالية من متوسطة إلى FBS ٪ DMEM/10 ، YFP + الخلايا السرطانية تغيير كبير التشكل ومتباينة في مختلف أنواع الخلايا ، المؤتمر الوطني العراقيluding Tuj1 + أو + NeuN الخلايا العصبية ، الخلايا astroglial GFAP + أو + CNPase oligodendrocytes.

<ol>
	<li>Rossi, A., Caracciolo, V., Russo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+From+Molecular+Pathology+to+Therapy.">Medulloblastoma: From Molecular Pathology to Therapy.</a> Clin Cancer Res. 14 (4), 971-971 (2008).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Neuronal+Precursor+Proliferation+in+the+Cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of Neuronal Precursor Proliferation in the Cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li><li>Dahmane, N., Ruiz, A., Altaba, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3089 (1999).</li><li>Wallace, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje-cell-derived+Sonic+hedgehog+regulates+granule+neuron+precursor+cell+proliferation+in+the+developing+mouse+cerebellum.">Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum.</a> Curr Biol. 9 (8), 445-445 (1999).</li><li>Fan, X., Eberhart, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medullablastoma+Stem+Cells.">Medullablastoma Stem Cells.</a> J Clin Oncol. 26 (17), 2821-2821 (2008).</li><li>Yoon, J. W., Gilbertson, R., Iannaccone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+Role+for+Hedgehog+Pathway+Activation+in+Desmoplastic+Medulloblastoma+by+Identifying+GLI1+Target+Genes.+International+journal+of+cancer.">Defining a Role for Hedgehog Pathway Activation in Desmoplastic Medulloblastoma by Identifying GLI1 Target Genes. International journal of cancer.</a> 124 (1), 109-109 (2009).</li><li>O'Dorisio, M. S., Khanna, G., Bushnell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+anatomic+and+molecularly+targeted+imaging+in+the+diagnosis+and+surveillance+of+embryonal+tumors+of+the+nervous+and+endocrine+systems+in+children.+Review.">Combining anatomic and molecularly targeted imaging in the diagnosis and surveillance of embryonal tumors of the nervous and endocrine systems in children. Review.</a> Cancer metastasis reviews. 27 (4), 665-665 (2008).</li><li>Corcoran, R. B., Bachar Raveh, T., Barakat, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+Growth+Factor+2+Is+Required+for+Progression+to+Advanced+Medulloblastoma+in+patched1+Heterozygous+Mice.">Insulin-like Growth Factor 2 Is Required for Progression to Advanced Medulloblastoma in patched1 Heterozygous Mice.</a> Cancer research. 68 (21), 8788-8788 (2008).</li><li>Gilbertson, R. J., Ellison, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Origins+of+Medulloblastoma+Subtypes.">The Origins of Medulloblastoma Subtypes.</a> Annual review of pathology. 3, 341-341 (2008).</li><li>Ward, R. J., Lee, L., Graham, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+CD15++Cancer+Stem+Cells+in+Patched-1+Deficient+Mouse+Medulloblastoma.">Multipotent CD15+ Cancer Stem Cells in Patched-1 Deficient Mouse Medulloblastoma.</a> Cancer research. 69 (11), 4682-4682 (2009).</li><li>Mao, J., Ligon, K. L., Rakhlin, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Somatic+Mouse+Model+to+Survey+Tumorigenic+Potential+Applied+to+the+Hedgehog+Pathway.">A Novel Somatic Mouse Model to Survey Tumorigenic Potential Applied to the Hedgehog Pathway.</a> Cancer research. 66, 10171-10171 (2006).</li><li>Han, Y. G., Kim, H. J., Dlugosz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development.">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature medicine. 15 (9), 1062-1062 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نحن تصف وسيلة فعالة لعزل ، وإثراء والحفاظ على الخلايا الجذعية من أنسجة الورم نخاعي الأولية التي تم استردادها من الفئران الطافرة مع إشارات نشطة constitutively القنفذ. وجدنا أن واحدة خطوة حاسمة في وضع بنجاح الجذعية السرطانية صحية خط الخلية هو العلاج Accutase المستخدمة أثناء تفك?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Neurobasal medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hEGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0311</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>PHG0023</td>
<td>25ng/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>N2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17502048</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>B27(-RA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12587010</td>
<td>1X</td>
</tr>
<tr>
<td>Accutase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A1110501</td>
<td>50%</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1393</td>
<td> 0.1%</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030081</td>
<td>2mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Primaria dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>087724C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB4343</td>
<td>Mouse, 1:1000</td>
</tr>
<tr>
<td>Nestin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DSHB</td>
<td>rat401</td>
<td>Mouse, 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>YFP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>A11122</td>
<td>Rabbit, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>GFAP antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neuromics</td>
<td>CH22102</td>
<td>Chicken, 1:1000</td>
</tr>
<tr>
<td>Tuj1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T5076</td>
<td>Mouse, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>NeuN antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB377</td>
<td>Mouse, 1:2000</td>
</tr>
<tr>
<td>CNPase antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MAB326</td>
<td>Mouse, 1:1000</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma stem cells

وقد اقترحت أورام المخ لامتلاك عدد قليل من السكان من الخلايا الجذعية التي هي السبب الجذري لتكون الأورام. وقد تم اعتماد المقايسات Neurosphere عموما لدراسة طبيعة الخلايا الجذعية العصبية ، بما في ذلك تلك المستمدة من الأنسجة الطبيعية ورمي. ومع ذلك ، وكميات ملموسة من التمايز وموت الخلية شائعة في neurospheres مثقف بسبب المرجح أن حالة شبه مثالية مثل إمكانية الوصول إلى جميع الخلايا ضمن المجاميع المجال لثقافة المتوسط. يتميز نخاعي ، وأكثرها شيوعا ورم CNS الأطفال ، عن طريق التقدم السريع والميل الى الانتشار على طول محور الدماغ الشوكي كامل مع نتائج سريرية كئيبة. هو ورم نخاعي ظهاري من المخيخ ، وهو ما يمثل 20 ٪ و 40 ٪ من الورم داخل القحف والحفرة الخلفية في مرحلة الطفولة ، على التوالي 1. الآن أنها راسخة بأن SHH يحفز يشير انتشار الخلايا العصبية للدماغ السلائف الحبيبية (CGNPs) خلال التنمية مخيخي 2-4. وربطت دراسات عديدة باستخدام نماذج الماوس ، والذي يتم تنشيط المسار constitutively SHH ، مما يشير SHH مع نخاعي 5-9. وأظهر تقرير صدر مؤخرا أن مجموعة فرعية من الخلايا المشتقة من الفئران نخاعي LacZ Patched1 / + هي الخلايا الجذعية السرطانية ، والتي هي قادرة على بدء والأورام propogating 10. نحن هنا وصف وسيلة فعالة لعزل ، وإثراء والحفاظ على الخلايا الجذعية المشتقة من ورم نماذج الماوس العديد من نخاعي ، مع تنشيط مسار SHH constitutively بسبب طفرة في مملس (11 ، على النحو المشار إليه hereon SmoM2) ، وهو النوع من الاختزال الذي هو أمر حاسم لSHH مسار التنشيط. في كل الأنسجة نخاعي معزولة ، كنا قادرين على إقامة العديد من المستعمرات التكاثري للغاية. يمكن لهذه الخلايا وأعرب بقوة عدة الخلايا الجذعية العصبية علامات مثل Nestin وSox2 ، مقاطع المسلسل الخضوع (أكبر من 20) وكان مولد الرمع. في حين أن هذه الخلايا الجذعية السرطانية مثقف كانت صغيرة نسبيا ، وغالبا ما bipoar النووية مع ارتفاع لنسبة حشوية عند المثقف في ظل ظروف لصالح وقف نمو الخلايا ، التي غيرت بشكل كبير على التشكل ، وسعت العمليات الخلوية متعددة ، بالارض ، وانسحب من دورة الخلية عند التحول إلى خلية مستنبت تستكمل مع مصل بقري جنيني من 10 ٪. الأهم من ذلك ، هذه الخلايا الجذعية السرطانية المختلفة في Tuj1 + أو + NeuN الخلايا العصبية ، والخلايا النجمية GFAP + + CNPase oligodendrocytes ، وبالتالي تسليط الضوء على قوة متعددة. وعلاوة على ذلك ، كانت هذه الخلايا قادرة على التكاثر medulloblastomas الثانوية عند زرعها في الفئران orthotopically المضيف.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

يصف هذا البروتوكول من العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية ورم نخاعي المستمدة من الفئران الطافرة مع سونيك القنفذ مسار النشاط خارج الرحم.

العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية نخاعي

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

isolation-enrichment-and-maintenance-of-medulloblastoma-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Views.  Vanderbilt University. يصف هذا البروتوكول من العزلة ، والإثراء ، وصيانة الخلايا الجذعية ورم نخاعي المستمدة من الفئران الطافرة مع سونيك القنفذ مسار النشاط خارج الرحم.

Video: Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Intracranial Orthotopic Allografting of Medulloblastoma Cells in Immunocompromised Mice

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) as the cell-of-origin for medulloblastoma1-4. However, the diverse clinical presentations of medulloblastoma subtypes in human patients (nodular, desmoplastic, classical and large cell/anaplastic), and the fact that medulloblastoma is found in a subset of human patients with no ectopic expression of CGNP marker5, suggest that the cellular and molecular origins of medulloblastoma are more complex and far from being completely deciphered. Therefore, it is essential to determine whether there is an alternative medulloblastoma tumor cell-of-origin based on which cell-type specific therapeutic modality can be developed. To this end, intracranial orthotopic allografting of genetically marked tumor cell types followed by subsequent analyses of secondary tumor development in recipients will allow determination of the cellular origin of tumor-initiating cells. Here we describe the experimental protocol for intracranial orthotopic allografting of medulloblastoma cells derived from primary tumor tissue, and this procedure can also be used for transplanting cells from established cell lines.

This protocol describes the isolation and dissociation of mouse medulloblastoma tissue, and subsequent allografting of the tumor cells into immunocompromised recipient mice in order to initiate secondary medulloblastoma.

مثلي Allografting داخل الجمجمة من خلايا المناعة لدى الفئران نخاعي

Medulloblastoma is the most common pediatric tumor of the nervous system. A large body of animal studies has focused on cerebellar granule neuron ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

نموذج قابل للتطوير لدراسة آثار إصابة القوة الحادة في سمك الحمار الوحشي البالغ

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and traumatic brain injury (TBI). Zebrafish are an important neuroscience model due to their transparency during development and robust regenerative capabilities following neurotrauma. While various cognitive tests exist in zebrafish, most of the cognitive assessments that are rapid examine non-associative learning. At the same time, associative-learning assays often require multiple days or weeks. Here, we describe a rapid associative-learning test that utilizes an adverse stimulus (electric shock) and requires minimal preparation time. The shuttle box assay, presented here, is simple, ideal for novice investigators, and requires minimal equipment. We demonstrate that, following TBI, this shuttle box test reproducibly assesses cognitive deficit and recovery from young to old zebrafish. Additionally, the assay is adaptable to examine either immediate or delayed memory. We demonstrate that both a single TBI and repeated TBI events negatively affect learning and immediate memory but not delayed memory. We, therefore, conclude that the shuttle box assay reproducibly tracks the progression and recovery of cognitive impairment.

Learning and memory are potent metrics in studying either developmental, disease-dependent, or environmentally induced cognitive impairments. Most cognitive assessments require specialized equipment and extensive time commitments. However, the shuttle box assay is an associative learning tool that utilizes a conventional gel box for rapid and reliable assessment of adult zebrafish cognition.

المكوك مربع المقايسة كأداة التعلم النقابي للتقييم المعرفي في التعلم ودراسات الذاكرة باستخدام حمار وحشي الكبار

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...