This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

وقد تجلى إسكات الجينات في مسببات الأمراض الفطرية 27،43، ولكن النبات المضيف رني بوساطة، لا توجد المنشورات التي تبين جدوى تحكم رني بوساطة من تراكم السموم الفطرية في النباتات. وكان أحد العوامل المحددة لهذه الدراسات في الفول السوداني لعدم وجود طريقة لتقييم تراكم النمط الظاهري عدم الأفلاتوكسين في النباتات الفردية، كما تظهر أوراق أي أعراض على العدوى الفطرية القرون تحت الأرض. وبالإضافة إلى ذلك، وتراكم توزيع يست عادة من السموم الفطرية، والحاجة للحصول على عينات كبيرة للتحليل الكيميائي 15،16 أعاقت القياس الكمي لتأثير رني المحتمل على محطة واحدة. الطريقة المعروضة هنا يتكون من 72 ساعة التجارب باستخدام خمسة بذور لأداء ثلاث عينات 24 ساعة بعد الفترة في ثلاث نسخ (الجدول 1، الشكل 7). مقارنة لتحليل الأفلاتوكسين النموذجية التي تتطلب ما لا يقل عن 100 غرام من البذور، وأسلوبنا هو مناسبة خاصة لindividuaأحداث ل المعدلة وراثيا من النباتات الفول السوداني التي تنتج في البداية لا يزيد عن اثنين أو ثلاثة قرون. وقد تجلى إسكات بوساطة الحمض النووي الريبي التوليف الأفلاتوكسين عن طريق تحويل وراثيا فلافس وA. الطفيلي. منذ aflR غير منظم الرئيسي لإنتاج الأفلاتوكسين في A. فلافس وA. الطفيلي 44،45، فإنه يصبح هدفا للاهتمام لإسكات بوساطة الحمض النووي الريبي في النباتات. ومع ذلك، فقد ثبت الاختلافات الجينية في aflR بين الرشاشيات الأنواع 46، وتلك المتغيرات الجينية يمكن الهروب إسكات إذا لم يكن هناك تسلسل الكمال مطابقة مع الإشارة رني المنتجة في البلد المضيف النبات. وهكذا، كان aflR واحدا من الأهداف لإسكات في ناقلات p5XCAPD، ولكنه لم يكن الوحيد. يكرر مقلوب من الجين aflR أدخلت A. فلافس وA. أدى الطفيلي عن طريق التحول في إسكات والحد الأدنى أو أي منتجأيون من الأفلاتوكسين 47 (ماكدونالد وآخرون، 2005b). أيضا، منع إسكات الجينات aflD إنتاج الأفلاتوكسين بنسبة تصل إلى 98٪ في A. فلافس وA. الطفيلي في التحول المباشر 48. لزيادة احتمال النجاح في نظامنا، تحولت الفول السوداني مع تكرار شظايا مقلوب خمس جينات لها دور في إنتاج الأفلاتوكسين في A. فلافس. هنا يتبين أن استخدام p5XCAPD الذي يستهدف لإسكات جينات عديدة في مسار تخليق الأفلاتوكسين، و 90٪ انخفاض مستويات -100٪ من الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 تحققت في خط 288-72، وانخفاض مستويات 60-100٪ تراكمت في خط 288-74 مقارنة بالمجموعة الضابطة، عندما تم تلقيح النبتات نصف مع A. فلافس، أرقام 4 و 7. والأهم من ذلك، الكشف عن هذه الطريقة فروق ذات دلالة إحصائية في تراكم الأفلاتوكسين من خطوط 288-72، 288-74 مقابل السيطرة في كافة مراحل التجربة من خلال تطبيق statis حدوديالتشنجات اللاإرادية، الشكل (7). ونظرا لصغر حجم العينة، من المهم تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام وسيلة قوية للكشف عن السموم الفطرية، وقد تم تحليل هذه التجارب من قبل UPLC التي لديها ارتفاع القرار، وخمسة أضعاف الأداء العالي وحساسية أعلى ثلاث مرات من HPLC 49. التعبير عن رني إدراج في 288-74 تم الكشف فقط في الفلقات غير الناضجة (الأصفر) في 24 ساعة الحضانة. لم يتم الكشف عن إدراج رني بواسطة RT-PCR على النبتات ناضجة من 288-74 في 24 ساعة، أو على أي مجموعة النضج في 48 ساعة، الشكل (6). وقد لوحظ هذه الظاهرة نفسها في رني خطوط الفول السوداني المعدلة وراثيا أخرى (أرياس، RS، 2015 غير منشورة)، حيث تم الكشف عن عادة النصوص رني فقط على النبتات غير ناضجة في 24 ساعة. وعولج عينات الحمض النووي الريبي مع الدناز قبل التوليف [كدنا، كانت البيانات تطبيع إلى مستوى الأكتين التعبير وأي دليل على تلوث DNA لوحظ. كان ينبغي أن يكون DNA الموجودة في العينات، ينبغي عليهتم الكشف في العينات ساعة 48 أيضا، ولكن باستمرار أن الأمر لم يكن كذلك. التعبير تحت سيطرة 35S-المروج ليست دائما موحدة. يمكن أن تتأثر الظروف البيئية 50، ونوع الأنسجة والمرحلة التنموية 51،52. وفي الوقت نفسه، في مسار التدخل RNA، فإن معدل تسوس مرنا ومعدل تسوس سيرنا يمكن أن تختلف بشكل كبير 53. فمن الممكن أن التدهور السريع للمرنا من خلال آلية التدخل RNA يمكن أن يمنع الكشف عن مرنا في 48 ساعة الحضانة. إذا كان غياب التعبير في 48 ساعة نظرا لانخفاض 35S-المروج مدفوعة النسخ، أو إلى تدهور سريع من الرنا المزدوج الجديلة التي المقامر ينتظر الجواب. وبالتالي، فإن الكشف عن الرنا الصغيرة عالية الإنتاجية تسلسل تعطي فكرة أفضل عن العمليات التي تجري من خلال رني 54 في هذه التجارب. ومع ذلك، منذ RNA إسكات ينتشر بشكل منتظم، وذلك أساسا من خلال اللحاء من photosyntأكره المصادر إلى السكروز المصارف (في هذه الحالة بذور الفول السوداني) 55، يمكن أن يحدث إسكات الأفلاتوكسين التوليف في البذور دون التعبير المحلي للرني إدراج. لا يزال الكثير من الأبحاث إلى أن يتم تحديد مستوى الحد الأدنى من الرنا التدخل الصغيرة (الرناوات siRNAs) اللازمة لمنع تراكم الأفلاتوكسين في البذور. ومن المهم أن نؤكد على حقيقة أن كلا من والتعبير مرنا للرني بناء (الشكل 6)، وأظهر تراكم السموم الفطرية B 1 و B 2 (الشكل 7) نتائج مختلفة عن غير ناضجة (الصفراء) مقابل. ناضجة (البني) النبتات. نباتات الفول السوداني لها النمو غير محدد، أي أنها تقدم عند الحصاد مجموعة من القرون النضج، الشكل 2. وبالإضافة إلى ذلك، والبذور من جماعات النضج المختلفة تختلف في تركيبتها الكيميائية، على سبيل المثال، 2،4٪ سكروز في البذور غير الناضجة، و 1.9٪ في البذور الناضجة تحت نفس الظروف الميدانية 56،57. وهكذا، لفهم الكفاءه الفعليةذ السيطرة بوساطة RNA تراكم الأفلاتوكسين، فمن المهم تحليل مجموعة النضج بشكل منفصل. A دفاع الطبيعي للبذور الفول السوداني هو إنتاج phytoalexins، والتي تختلف في تنوع المركبات المنتجة وكمياتها النسبية تبعا لنضج البذور والظروف البيئية 58-61، وكان أعلى بشكل خاص في الأجنة مقارنة النبتات 62. يكون الأجنة أيضا على تركيزات أعلى بكثير من الأحماض النووية، سواء DNA و RNA من النبتات (أرياس RS، غير منشورة). كما بذور الفول السوداني تنضج، والتغيرات في علم وظائف الأعضاء، والتركيب الكيميائي تحدث 63. مضادات الأكسدة الفينولية في شكل تيستا الفول السوداني العفص مكثف مع نشاط كابح الفطريات 64؛ وهذا هو أيضا واضح في لون ميزوكارب التي تعكس مراحل النضج والأصفر إلى الأسود 35، ومحتواه من العفص والمركبات الفينولية يزيد مع استحقاق 65. وبالتالي، وجود رتهت أو الأجنة في التجربة، نظرا خصائصها المضادة للميكروبات، يمكن أن يقتصر نمو الفطريات، وبالتالي المبالغة في تقدير تأثير رني إسكات، وبالتالي، تم إزالتها. أيضا، إزالة تيستا والأجنة تساعد لحد من مصادر التباين في التحليل، ونصف فلقة الذي يحمل فإن الجنين يكون أكثر phytoalexins والمزيد من المحتوى RNA. بالإضافة إلى تحليل من قبل الجماعات النضج وإزالة تيستا والجنين في هذه التجارب، من المهم أن نشير إلى عدد قليل من أكثر الملاحظات: أ) على الرغم من ظهور نتائج لمدة تصل إلى 96 ساعة الحضانة، فمن المستحسن استخدام ما لا يزيد عن 72 ساعة للحصول على نتائج متسقة، والحصول على تدهور البذور بنسبة 96 ساعة. وب) في حين أن نصف النبتات من نفس البذور، وعلى الرغم من العينة عشوائيا، لا تشكل عينات مستقلة تماما، وأظهر RT-PCR وتراكم الأفلاتوكسين ضمن أحداث المعدلة وراثيا الحد الأدنى الاختلاف بين البذور. أيضا، الاعتماد على الجراثيم الفطرية دقيق، وحجم اللقاحالصورة من 2 ميكرولتر، وتطبيق جراثيم على السطح قطع من النبتات تجنب نازف على جانبي مهمة للتأكد من يتعرضون للجراثيم نبتت إلى الأنسجة النباتية. يجب أن يكون الماء / أجار على لوحات عند 1.5٪ (ث / ت)، ليونة أجار يسبب جريان المياه من الجراثيم كما هو مبين في الإطار الأخير من الشكل 4 (القاع). يجب توافر البذور المعدلة وراثيا عن حدث معين تكون محدودة، ويمكن أن يتم أخذ العينات في نسختين بدلا من ثلاث نسخ الحصول على نتائج مماثلة (أي الشكل 7). ومع ذلك، فإن عينات من ثلاث نسخ يساعد على التقليل من الخطأ المعياري. والقيد الوحيد من هذا الأسلوب هو أنه يتطلب نظام حساسة للغاية (UPLC) للكشف عن الأفلاتوكسين / الكمي، ولكن في نفس الوقت وهذا يقلل من احتمال المبالغة في تقدير تأثير رني أن الأفلاتوكسين لا يتم الكشف عن طريق وسائل أقل حساسية. في الختام، هذا الأسلوب يقدم لأول مرة نهج يمكن الاعتماد عليها لدراسةتأثير رني في السيطرة على السموم الفطرية. تقليل الوقت لتجربة من الموسم الزراعي بأكمله إلى أقل من أسبوع واحد، وهذه الطريقة سوف يتسارع بشكل كبير للبحث عن رني الفول السوداني / الرشاشيات pathosystem نحو التخفيف و / أو القضاء على السموم الفطرية.

ويتعرض ما يقرب من 4.5 مليار شخص مزمن لالأفلاتوكسين 1، والمواد المسببة للسرطان أقوى المعروفة في الطبيعة 2. هذه السموم الفطرية تلوث 25٪ من المحاصيل الغذائية في العالم 3، بما في ذلك الذرة والمنيهوت والأرز والمكسرات والحبوب والتوابل. 4. الأفلاتوكسين سبب التقزم لدى الأطفال 5، يضعف الجهاز المناعي 6، موجودة في 58٪ من الكبد، سرطان في الخزعات الإنسان 7،8، وقتل مئات الاشخاص خلال تفشي الدورية للتسمم أفلاتوكسيني 9،10. الأفلاتوكسين هي السموم الفطرية المستمدة متعدد الكيتيد تنتج عادة عن طريق فلافس وA. الطفيلي. ويتم إنتاج السموم الفطرية B 1 و B 2 بواسطة A. فلافس، في حين A. الطفيلي كما تنتج G 1 و 2 G. ويبين التركيب الكيميائي لهذه المركبات واللوني يظهر انفصالهما قبل UPLC في الشكل 1. </strأونج&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> الشكل 1. الأفلاتوكسين ورني إدراج الأعلى: التركيب الكيميائي (يسار) ومثال اللوني (يمين) من السموم الفطرية المستمدة متعدد الكيتيد الأكثر شيوعا أربعة: B 1، B 2، G 1 و 2 G، التي تنتجها الرشاشيات الطفيلي، A وينتج فلافس B 1 و B 2 القاع: رسم تخطيطي من شظايا الجينات في رني بناء p5XCAPD المستخدمة للتحول الفول السوداني، وأرقام تحت السهام أرقام الانضمام الجينات جزء في فلافس الجينوم الرشاشيات؛ PIV2: إنترون البطاطا. أزواج الأساس؛: BP RT_5X_1 وRT_5X_2: في الوقت الحقيقي مواقع PCR التمهيدي <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الخسائر الاقتصادية في الصادرات بسبب السموم الفطرية في الفول السوداني وحده تتجاوز 450 مليون $ دولار أمريكي اذا حسبت على أساس 4 نانوغرام. ز -1 الحد من الأفلاتوكسين يسمح للاستهلاك البشري في الاتحاد الأوروبي 11. من المعروف أن السموم الفطرية لمدة 60 عاما 12؛ ومع ذلك، على الرغم من وضعت العديد من الممارسات الزراعية للحد من تأثيرها، بما في ذلك تطبيق السلالات الفطرية الأخرى 13،14، لا توجد طريقة ثابت من السيطرة موجودا، والأصناف النباتية المقاومة غير متوفرة. اختبار الأصول الوراثية النباتية لمقاومة السموم الفطرية أمر صعب للغاية، لأنه حتى في ظل ظروف مواتية لغزو الممرض، وتراكم السموم الفطرية لا يمكن التنبؤ بها ولا تتبع التوزيع الطبيعي. وبالتالي، تتطلب عادة التجارب المساحات المنزرعة كبيرة، ومئات من البذور وعينات متعددة من 100-1،700 ز للحد من تقلب من 15،16 البيانات. كان التدخل RNAاكتشف في عام 1998 17؛ وفوائد &quot;إسكات&quot; يجري حاليا بحث في عدد من التطبيقات الجديدة، على سبيل المثال، في العلاجات الإنسان ضد سرطان الثدي النقيلي 18، سرطان الكبد 19، سرطان الدم النخاعي 20، وحماية النباتات من الحشرات والديدان الخيطية 22 21. في النباتات، يمكن أن إشارات تدخل RNA السفر خلية إلى أخرى، مع RNA الصغيرة التدخل (سيرنا) وارتفاع الجزيئي RNA الوزن هي المسؤولة عن الجين posttranscriptional النظامية إسكات 23،24، حتى داخل مسببات الأمراض الفطرية التي هي على اتصال وثيق مع مضيفه مصنع 25. وقد وصفت فعالية رني على إسكات بوساطة مصنع للجينات للفطريات الممرض في عدد قليل من pathosystems النبات، لهذه، والفحص البصري للأعراض في الأجزاء الهوائية للنباتات (يترك) يسمح الكمي المرض، أي oomycete Bremia في الخس 26 ، بوسينيا في القمح <suP&gt; 27 والفيوزاريوم في الموز 28. أصعب بكثير هو تقييم فعالية رني للسيطرة على السموم الفطرية في النباتات، وعلى الأخص السموم الفطرية في الفول السوداني كما تظهر لا يترك أي أعراض للعدوى، وأجهزة غزت (بذور) تحت عدة بوصات من التربة، وحدوث عدوى لا يمكن التنبؤ بها، والكيميائي فقط تحليل يمكن تحديد وجود الأفلاتوكسين. بالإضافة إلى ذلك، كل حدث المعدلة وراثيا في الفول السوداني ينتج عادة عدد قليل من البذور (4-6 في النبات)؛ وبالتالي، الاختبار التقليدي لتراكم سمة عدم الأفلاتوكسين في مؤامرات ميدانية كبيرة ودائم المواسم الزراعية بأكملها، واستخدام المئات من البذور غير ممكن. ووصف طريقة هنا لتحليل في أقل من أسبوع واحد، وبذور الفول السوداني رني لحضور التحوير ولعدم تراكم الأفلاتوكسين سمة، وذلك باستخدام عدد قليل فقط البذور.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

وتشير تقديرات منظمة الأغذية والزراعة التابعة للأمم المتحدة أن 25٪ من المحاصيل الغذائية في العالم ملوثة الأفلاتوكسين. الذي يمثل 100 مليون طن من المواد الغذائية التي يجري تدميرها أو تحويلها إلى الاستهلاك غير البشرية كل عام. الأفلاتوكسين المسرطنة قوية المتراكمة عادة من قبل الفطريات فلافس وA. الطفيلي في الحبوب والمكسرات والمحاصيل الجذرية وغيرها من المنتجات الزراعية. تم استخدام إسكات خمس جينات الأفلاتوكسين التوليف التي تدخل الحمض النووي الريبي (رني) في النباتات الفول السوداني للسيطرة على تراكم الأفلاتوكسين بعد التلقيح مع A. فلافس. في السابق، لم يكن هناك أي طريقة لتحليل فعالية رني في الفول السوداني الفردي الأحداث المعدلة وراثيا، وهذه عادة ما تنتج البذور قليلة، والأساليب التقليدية للتجارب ميدانية كبيرة في ظل ظروف مواتية الأفلاتوكسين وليس خيارا. في هذا المجال، واحتمال العثور على بذور ملوثة بشكل طبيعي في كثير من الأحيان 1/100 إلى 1/1،000. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم توزيع تلوث الافلاتوكسين بشكل موحد. يستخدم أسلوب لدينا عدد قليل من البذور المعدلة وراثيا في الحدث، مع قطع صغيرة معالجتها في الوقت الحقيقي PCR (RT-PCR) أو تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة، وتحليل تراكم الأفلاتوكسين بواسطة فائقة الأداء اللوني السائل (UPLC). خطوط الفول السوداني، معربا عن رني 288-72 و288-74، وأظهر ما يصل إلى الحد 100٪ (p≤0.01) في الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 مقارنة بالمجموعة الضابطة التي تراكمت حتى 14000 نانوغرام. ز -1 الأفلاتوكسين ب 1 عندما تلقيح مع aflatoxigenic A. فلافس. كمرجع، فإن مجموع الحد الأقصى المسموح به من السموم الفطرية للاستهلاك البشري في الولايات المتحدة هو 20 نانوغرام. ز -1. يصف هذا البروتوكول تطبيق مراقبة بوساطة رني من السموم الفطرية في بذور الفول السوداني المعدلة وراثيا وطرق تقييمها. ونحن نعتقد أن تطبيقه في تربية الفول السوداني وغيرها من المحاصيل سوف يجلب التقدم السريع في هذا المجال الهام من العلوموالطب والتغذية البشرية، وسوف تسهم إسهاما كبيرا في الجهود الدولية للسيطرة على السموم الفطرية، والسموم الفطرية المحتملة الأخرى في المحاصيل الغذائية الرئيسية.

وقدم البلازميد p5XCAPD كما مشتق من pCAPD 29، واستخدامه لتحويل نباتات الفول السوداني. هذا ناقلات يحمل يكرر مقلوب من خمسة أجزاء صغيرة، 70-80 سنة مضت كل من الجينات الأفلاتوكسين-توليف A. فلافس مفصولة إنترون (الشكل 1). واستخدمت أجزاء من AFL2G_07224 (aflR)، AFL2G_07223 (aflS أو aflJ)، AFL2G_05027 (الأفلاتوكسين مضخة هروب رأس المال، aflep)، AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1)، وAFL2G_07731 (pes1) للبناء، والأرقام على الشكل 1 تتوافق مع . فلافس الجينوم الشرح في معهد برود، كامبردج، MA، والأدب 42. تم توليده ما مجموعه 99 خطوط الفول السوداني بعد أن يمر في عملية التحول، 50 كانت PCR إيجابية لNPTII الكشف عنها بواسطة STN-PCR، وكانت 33 خطوط PCR بذور الإيجابية والمنتجة. سبعة خطوط إيجابية PCR فقط تم نشر متطابق بسلالة واختبارها من قبل حاضراطريقة ر لتراكم الأفلاتوكسين، وأظهر كل سبعة بين 60٪ و 100٪ تراكم الأفلاتوكسين أقل من السيطرة. نحن هنا تظهر نتائج اثنين من تلك الخطوط سبعة. كأحداث المعدلة وراثيا الفردية عادة ما تنتج البذور قليلة، تم تطوير طريقة لاستخدام الحد الأدنى لعدد البذور في حين لا تزال قادرة على القيام التحليل الإحصائي حدودي. ويرد مخطط لإعداد العينات والإعداد التجريبية في الشكل 5 والجدول 1. على الرغم من أن الجيل الأول من البذور المعدلة وراثيا هو عادة فرداني الزيجوت، فمن المتوقع أن الخلية الى خلية والحركة النظامية من الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا) التي تم إنشاؤها من خلال التدخل RNA يجب منح الأفلاتوكسين التوليف إسكات جميع أنحاء المصنع. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> الرقم 5. مخطط توضيحي لطريقة لتحليل فعالية رني في إسكات </sترونج&gt; الرشاشيات الجينات الأفلاتوكسين التوليف في بذور الفول السوداني. التمثيل البياني للتدفق العمل عند معالجة عينات الفول السوداني للتعبير الجين أو تحليل الأفلاتوكسين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> رني خطوط الفول السوداني 288-72 و288-74 أظهرت وجود صانع اختيار NPTII عند اختبارها من قبل STN-PCR، يتم عرض المقاطع جل في الشكل 6 (أعلى)، تتوفر من المؤلفين بناء على طلب الصور الأصلية. لم يستخدم البلازميد pCAPD كعنصر تحكم التحول لأنه يشفر يكرر مقلوب من اثنين من الجينات الكاميرون (مقاومة الكلورامفينيكول) وCcdB (توكسين) من تأثير غير معروف على النباتات. استخدمت PCR سلبي خط الفول السوداني 288-9 وغيرها التي مرت عملية تجديد وكانت تزرع في نفس الظروف كخطوط رني، كما يخدع سلبيالمحول المتعدد العادي. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . الشكل 6. الكشف عن الجينات والوقت الحقيقي التعبير عن رني إدراج الأعلى: أحادية الأنبوب، كشف متداخلة PCR خطوط الفول السوداني المعدلة وراثيا رني 288-72 و288-74 رني والنباتات إيجابية. الضوابط: W (الماء)، PP (مصنع إيجابي)، MM (مزيج الرئيسي)، ص (البلازميد p5XCAPD)؛ الكسور 02/01 04/01 08/01 16/01 تمثل التخفيفات 2-أضعاف من الحمض النووي القاع: في الوقت الحقيقي PCR الكشف عن التعبير عن رني إدراج (مجموعات التمهيدي: RT_5X_1، RT_5X_2، كما في الشكل 1، على غير ناضجة ( الأصفر) وناضجة (البني) النبتات من خطوط المعدلة وراثيا في 24 و 48hr الحضانة؛ خط رمادي: تمثيل C T = 1. المدرج الإحصائي الوسائل وأشرطة الخطأ القياسية (T) من ثلاث عينات بيولوجيةمع ثلاثة مكررات التقنية. كان الكمي النسبي للرني إدراج تطبيع فيما يتعلق الجينات التدبير المنزلي أكتين بمثابة الرقابة الداخلية والمقارن التعبير حظيرة التحوير تحسب كما هو موضح في 5.2.2 و 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> لاختبار فعالية النبات المضيف رني بوساطة السيطرة المحتملة لتراكم الأفلاتوكسين، طبقت غبيرات المقطوع حديثا من فلافس NRRL 3357 على سطح قطع من النبتات نصف من الذي قد أزيلت الأجنة وتيستا (الأرقام 3، 4). ألف فلافس NRRL 3357، التي تم التسلسل الجينوم، وكان أساسا لتصميم p5XCAPD، يعود الفضل للدكتور القرن في USDA-ARS-NPRL. الغزو الفطرية الناتجة من نصف فلقة بعد 24 و 48 و 72 ساعة على 30 ° C هو المعرض<html> ن في الشكل (4). وقد تم جمع عينات من النبتات نصف الملقحة في 24، 48، 72، 96 ساعة من الحضانة، وتحليلها لأربعة الأفلاتوكسين الرئيسي للB 1، B 2، G 1 و G 2 باستخدام UPLC وأكد LC-MS ؛ يتم عرض النتائج في الشكل (6). تم تحديد تركيزات الأفلاتوكسين باستخدام أسلوب نشرت مع بعض التعديلات 36. في 96 ساعة الحضانة، النبتات تبدأ في التفكك بسبب عدوى فطرية. خط رني 288-72 أظهرت مستويات أقل بكثير من الأفلاتوكسين من السيطرة على جميع مواعيد أخذ العينات في الفلقات غير الناضجة وعلى معظم مواعيد أخذ العينات في الاقتصادات الناضجة. أظهر خط رني 288-74 مستويات أقل بكثير من الأفلاتوكسين في معظم مواعيد أخذ العينات. يشار إلى مستويات من أهمية اختبار توكي مع العلامات النجمية في الرسم في الشكل 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . الرقم 7. الأفلاتوكسين ب 1 و ب 2 في النبتات الفول السوداني نصف بعد الحضانة (24، 48، 72 و 96 ساعة) مع فلافس التحكم: بذور 288-9 سطر غير المعدلة وراثيا. رني: البذور من رني 288-72 ورني 288-74، المعدلة وراثيا لرني p5XCAPD لإسكات خمس جينات الأفلاتوكسين التوليف. (A) الأفلاتوكسين ب 1 في البذور الناضجة (البني)؛ (B) الأفلاتوكسين ب 2 البذور الناضجة. (C) الأفلاتوكسين ب 1 في بذور غير ناضجة (الأصفر) و (D) الأفلاتوكسين ب 2 في البذور غير الناضجة. يتم تمثيل القيم المتوسطة مع ما يوازيها من أشرطة الخطأ القياسية (T) من العينات البيولوجية مكررة. فروق ذات دلالة إحصائية في اختبار توكي *: ص ≤ 0.05 **: P ≤ 0.01، ***: P ≤ 0.001.الصورة: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. أظهر رني 288-72 عموما في كافة مراحل التجربة (24-96 ساعة الحضانة)، و 94٪ انخفاضا -100٪ في الأفلاتوكسين ب 2، و 90٪ انخفاضا -100٪ في الأفلاتوكسين ب 1 مقارنة بالمجموعة الضابطة. أظهر رني 288-74 63٪ تخفيض -100٪ في الأفلاتوكسين ب 2 و 60٪ -100٪ تخفيض في الأفلاتوكسين ب 1، الشكل 7. وترد الاشعال تستخدم لفي الوقت الحقيقي الكشف PCR للتعبير عن إدراج رني في الشكل 1. وقد تم تحليل النبتات الفول السوداني البذور دون الأجنة، لإزالة دفاعاتهم الطبيعية، وتكون قادرة على الكشف عن التأثير المحتمل لرني على المنطقة الأكثر تعرضا لل غزو ​​الفطرية، النبتات. التعبير عن رني الكشف عن إدراج في الفلقات غير الناضجة (الأصفر) من خط 288-74 قبل التمهيدي تعيين RT_5X_1 كان أربعة أضعاف على مدى C T </sوكانت يو بي&gt; = 1 عتبة السيطرة السلبية، والتمهيدي تعيين RT_5X_2 19 أضعاف فوق عتبة، في كل 24 ساعة الحضانة. لا يقل عن ثلاثة من أصل خمسة أجزاء متتالية الجينات المستخدمة في التحول الفول السوداني، 5027، 7223 و 7228 (aflep، aflS / aflJ، وaflC / pksA، على التوالي) تم الكشف عنها بواسطة RT-PCR (الشكل 1، 6). لم يتم الكشف عن التعبير عن رني إدراج في النبتات ناضجة في 24 ساعة، أو على النبتات ناضجة أو غير ناضجة في 48 حضانة ساعة، الشكل 6 (القاع). <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> الفول السوداني الخط </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> وقت أخذ العينات </td><td colspan="3" style="width:192px;"> عينات لRT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> عينات للتحليل الأفلاتوكسين (تلقيح) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nبني مصفر من البذور </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (غير الملقحة) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> مندوب 1 </td><td style="width:64px;"> مندوب 2 </td><td style="width:64px;"> مندوب 3 </td><td style="width:64px;"> مندوب 1 </td><td style="width:64px;"> مندوب 2 </td><td style="width:64px;"> مندوب 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> رني (أصفر) </td><td style="width:64px;"> 24 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdعلى غرار = &quot;العرض: 64px؛&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> التحكم </td><td style="width:64px;"> 24 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (أصفر) </td><td style="width:64px;"> 48 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 ساعة </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. مثال على الإعداد عينة صغيرة لتحليل التعبير الجيني وتراكم الأفلاتوكسين في بذور الفول السوداني رني. تحليل كامل التعبير والسموم الفطرية لمجموعة النضج واحد (أي.، الأصفر)، مع ثلاثة أوقات لأخذ العينات (24 و 48 و 72 ساعة) ، في ثلاث نسخ، يتطلب 4،5 البذور، كل رقم واحد في الجدول يمثل نصف فلقة.

Watch this Scientific Journal Video about RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem at JoVE.c

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

ونحن لشرح طريقة لتحليل السموم الفطرية والتعبير التحوير في بذور الفول السوداني التي تحتوي على إشارات RNA للتدخل لإسكات الجينات الأفلاتوكسين التوليف في الفطر فلافس. لم يتم الإبلاغ عن السيطرة بوساطة رني من السموم الفطرية في النباتات سابقا.

تحكم بوساطة رني من الأفلاتوكسين في الفول السوداني: طريقة لتحليل الإنتاج السموم الفطرية والتعبير التحوير في الفول السوداني /<em&gt; الرشاشيات</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

rnai-mediated-control-aflatoxins-peanut-method-to-analyze-mycotoxin

Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

20.8K Views.  United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service.  ونحن لشرح طريقة لتحليل السموم الفطرية والتعبير التحوير في بذور الفول السوداني التي تحتوي على إشارات RNA للتدخل لإسكات الجينات الأفلاتوكسين التوليف في الفطر فلافس. لم يتم الإبلاغ عن السيطرة بوساطة رني من السموم الفطرية في النباتا?...

Video: RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

تحسين إعدادات غاز المداخن في تعزيز نمو الطحالب في Photobioreactors عبر المحاكاة الحاسوبية

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

عابر التعبير الجيني في التبغ باستخدام الجمعية جيبسون وجين غون

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

والجدول Gusseted Thermogradient لتنظيم درجة الحرارة التربة لتقييم نمو النبات ومراقبة العمليات التربة

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric chemistry and climate. The complex production mechanisms and reaction pathways make this a challenging research topic. To address these issues, an environmental chamber, providing enough residence time and close-to-ambient concentrations of precursors for secondary organic materials, is needed. The Harvard Environmental Chamber (HEC) was built to serve this need, simulating the production of gas and particle phase species from volatile organic compounds (VOCs). The HEC has a volume of 4.7 m3 and a mean residence time of 3.4 h under typical operating conditions. It is operated as a completely mixed flow reactor (CMFR), providing the possibility of indefinite steady-state operation across days for sample collection and data analysis. The operation procedures are described in detail in this article. Several types of instrumentation are used to characterize the produced gas and particles. A High-Resolution Time-of-Fight Aerosol Mass Spectrometer (HR-ToF-AMS) is used to characterize particles. A Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometer (PTR-MS) is used for gaseous analysis. Example results are presented to show the use of the environmental chamber in a wide variety of applications related to the physicochemical properties and reaction mechanisms of organic atmospheric particulate matter.

This paper describes operation procedures for the Harvard Environmental Chamber (HEC) and related instrumentation for measuring gaseous and particle species. The environmental chamber is used to produce and study secondary organic species produced from the organic precursors, especially related to atmospheric organic particulate matter.

قياس الجسيمات العضوية في قاعة جامعة هارفارد البيئية والإنتاج

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

اختبار الإصابة بالنبات: الرش والجرح بوساطة التلقيح بمسببات الأمراض النباتية رمادية ماجنابورثي

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

تقييم قدرات إزالة الجسيمات من شجرة يترك

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform across ecological zones. To best protect public and veterinary health from these insects, the environmental limitations of pesticides need to be investigated to inform effective use of the most appropriate pesticide formulations and techniques. We have developed a research program to evaluate combinations of pesticides, pesticide application equipment, and application techniques in hot-arid desert, hot-humid tropical, warm and cool temperate, and urban locations to derive pesticide use guidelines specific to target insect and environment. To these ends we designed a system of protocols to support efficient, cost-effective, portable, and standardized evaluation of a diverse range of pesticides and equipment across multiple environments. At the core of these protocols is the use of an array of small cages with colony-reared sentinel mosquitoes (adults and immatures) and sand flies (adults), strategically arranged in natural habitats and exposed to pesticide spray. Spatial and temporal patterns of pesticide efficacy are derived from percent mortality in sentinel cages, then mapped and visualized in a geographic information system. Maps of sentinel mortality data may be statistically compared to evaluate relative efficacy of a pesticide across multiple environments, or to study multiple pesticides in a single environment. Protocols may be modified to accommodate a variety of scenarios, including, for example, the vertical orientation of sentinels in canopy habitats or simultaneous testing of ground and aerial application methods.

The efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects is not uniform across different ecological zones. Here we present a system of techniques using captive vector insects as sentinels for pesticide efficacy to derive electronic maps supporting the standard evaluation of pesticides across multiple environments.

تصور فعالية المبيدات ضد البعوض ناقل المرض في الحقل

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

تكوين وتحليل التوزيع من بيوايروسولس تحت ظروف بيئية مختلفة

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&amp;#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

ومنصة القياس عن بعد، gravimetric في الوقت الحقيقي فيزيولوجية الظاهري من التفاعلات النباتية والبيئة

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...

Mistletoe Eradicator - A Novel Tool for Simultaneous Mechanical and Chemical Control of Mistletoe

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic and topic associations with various organisms and at the same time acting as biological pirates, exhausting the host trees by stealing water and nutrients via the haustorium. Many crop and timber trees are attacked by mistletoes, for example, dwarf mistletoes parasitize conifers, representatives of genus Tapinanthus target guava, and Phoradendron mistletoe target pecans. Recently, an increasing infestation of the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) in monoculture stands of common walnuts (Juglans regia L.)&#160;was recorded for the first time during 2018 in different regions of Kashmir Valley, India. The common chemical approach based on the spraying of mistletoe exophytes with the growth regulators, ethephon and glyphosate, was not efficient since V. album resprouted in the next vegetation season. Hand pruning of mistletoe was time-consuming, and a polyethylene covering resulted in the localized rotting of host tissues. The most efficient approach to eradicate mistletoe was the use of a novel tool called Mistletoe Eradicator, which allows to use mechanical and chemical means of mistletoe control simultaneously. It consists of a manipulating pole with the terminal pruning saw having a container filled with the growth regulator, from which the liquid slowly drops onto the saw blade through the nozzle. It allows working both from the ground and in the tree canopy. After the targeted application of 5%-10% ethephon or glyphosate to the base of the just pruned V. album stems (stubs), exophyte resprouting was significantly reduced 9 months after the pruning as compared to the only pruned or sprayed exophytes. An alternative variant of Mistletoe Eradicator was constructed in Ukraine filled just with a food color additive to track the liquid dropping and was successfully tested.

The protocol describes an easy-to-handle tool called Mistletoe Eradicator which combines mechanical and chemical approaches and is efficient in the control of mistletoe infestation on the host trees. The manuscript uses the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) as an example.

مزيل الهدال - أداة جديدة للتحكم الميكانيكي والكيميائي المتزامن في الضباب

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic ...