This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

真菌病原体における遺伝子の植物宿主のRNAi媒介サイレンシングは、27,43を実証されている、しかし、植物中のマイコトキシン蓄積のRNAi仲介制御の実現可能性を示す何の出版物はありません。葉は地下ポッドの真菌感染時には症状を示さないようピーナッツにおけるこれらの研究のための一つの制限要因は、個々の植物における無アフラトキシン蓄積表現型を評価する方法がないことでした。また、アフラトキシンのない正規分布の蓄積、および化学分析15,16のための大規模なサンプルの必要性は単一の植物の潜在的なRNAi効果の定量化を妨げています。ここで紹介する方法は三通り3 24時間間隔サンプリング（ 表1、 図7）を実行するために5種を使用して、72時間の実験で構成されています。種子の劣らず100 g以上を必要とする典型的なアフラトキシン分析と比較して、私たちの方法はindividuaに特に適しています最初に2つ以下または3ポッドを生産ピーナッツ植物のLトランスジェニックイベント。 アフラトキシン合成のRNA媒介サイレンシングは、遺伝的にアスペルギルス・フラバス と A. を形質転換することにより実証されていますparasiticus。 aflRは Aのアフラトキシン生産の主要な調節因子であるので、 フラバス と A. parasiticus 44,45、それは植物におけるRNA媒介サイレンシングのための興味深い対象となります。しかし、aflRにおける遺伝的変異は、 アスペルギルス種 46の間で示されており、植物宿主で生産するRNAi信号と一致する完全なシーケンスが存在しない場合には、これらの遺伝的変異は、サイレンシングから逃れることができました。したがって、aflRは、ベクトル p5XCAPDにサイレンシングのための目標の一つでしたが、一つだけではありませんでした。 A.に導入aflR遺伝子の逆方向反復フラバス と A.変換によるparasiticusはサイレンシングし、最小限または全くない製品が得られましたアフラトキシン47のイオン（マクドナルドら 、2005B）。また、サイレンシングAFLD遺伝子は、Aに 98％までによってアフラトキシン生産を防止しましたフラバス と A.直接変換48でparasiticus。我々のシステムの成功の確率を高めるために、ピーナッツはAにアフラトキシン産生に関与する5つの遺伝子の逆方向反復断片で形質転換しましたフラバス 。ここでは、アフラトキシン合成経路においていくつかの遺伝子をサイレンシングするためのターゲット、アフラトキシンB 1の90％-100％低いレベルおよびB 2は、ライン 288から72に達成されたことをp5XCAPDを使用して、とに蓄積された百分の60から100まで低いレベルことが示されています半子葉がAで接種した対照と比較してライン288から74、 フラバスは 、7,4を図 。最も重要なのは、この方法は、ライン288から72によってアフラトキシンの蓄積に統計的に有意な差異を検出した288から74 対パラメトリックSTATISを適用することにより、実験を通して制御チック、 図7。小さなサンプルサイズを考えると、それは、これらの実験は、高解像度、より高い性能と比べて3倍の感度を5倍を有しUPLCで分析したアフラトキシンを検出するための強力な方法を使用する必要性を強調することが重要ですHPLC 49。 RNAiの発現は、インサート288から74にのみ24時間のインキュベーションでの未熟子葉（黄色）で検出されました。 RNAiのインサートは、図6、48時間で24時間で288から74の成熟子葉に、または任意の満期のグループにRT-PCRによって検出されなかった。これと同じ現象は他のRNAiトランスジェニックピーナッツ株において観察された（アリアス、RS、2015未発表）、通常のRNAi転写物はわずか24時間で未熟子葉上で検出された場所。 RNAサンプルは、データは、アクチンの発現レベルに対して標準化し、DNAの混入の証拠は観察されなかった、cDNA合成の前にDNアーゼで処理しました。 DNAが試料中に存在していたならば、それはすべき同様に48時間のサンプルで検出されたが、一貫して、それはそうではありませんでしたされています。 35Sプロモーターの制御下の発現は必ずしも一様ではありません。それは、環境条件50、組織や発達段階51,52の種類によって影響を受けることができます。同時に、RNA干渉の経路では、mRNAの崩壊速度およびsiRNAの減衰率が大きく53を変化させることができます 。これは、RNA干渉の機構によるmRNAの急速な分解は、48時間のインキュベーションでのmRNAの検出を妨げている可能性があります。 48時間での発現の欠如が低い35Sプロモーター駆動の転写によるものであったかどうか、またはダイサーによりdsRNAの速い劣化に答えられることを残ります。このように、ハイスループットシークエンシングによって、小さなRNAの検出は、RNAi 54を介して行われているプロセスのより深い洞察を与えるだろう これらの実験です。しかし、RNAサイレンシングは、主にphotosyntから師部を通って、全身に広がるので、（この場合はピーナッツ種子中）ショ糖シンク55にソースを嫌い、アフラトキシン合成のサイレンシングは、RNAiインサートの局所発現せずに種子に発生する可能性があります。多くの研究は、種子中のアフラトキシンの蓄積を防止するために必要な小さな干渉RNA（siRNA）の閾値レベルを決定するために行われていません。これは、RNAiの両方のmRNAの発現は（ 図6）を構成するという事実を強調することが重要であり、アフラトキシンB 1及びB 2（ 図7）の蓄積は、 対未成熟（黄色）に対して異なる結果を示しました。成熟した（茶色）子葉。ピーナッツ植物はつまり、彼らは収穫満期ポッドの範囲、 図2に提示し、不確定な成長を持っている。また、異なる満期グループからの種子は、その化学組成が異なる例えば 、2.4％の未熟種子中のショ糖、および1.9％で同じフィールド条件56,57の下で成熟した種子。したがって、実際のefficiencを理解しますアフラトキシン蓄積のRNA媒介性制御のyは、別途成熟グループを分析することが重要です。 ピーナッツ種子の自然な防衛は種子や環境条件58-61の成熟度に応じて製造された化合物およびそれらの相対的な量の多様性に変化ファイトアレキシンの生産、であり、子葉62に比べて胚において特に高いです。胚はまた、子葉（アリアスRS、未発表）よりもDNAとRNAの両方を、核酸の有意に高い濃度を有します。ピーナッツ種子が成熟するにつれ、その生理学および化学組成の変化が63を発生します。静真菌活性を64とピーナッツ種皮フォーム縮合型タンニンでフェノール系酸化防止剤;タンニンとフェノール化合物のその含有量は、満期65が増加するにつれて、これは、また、35黒黄色成熟段階を反映中果皮の色が明らかです。トンのこのように、存在その抗菌性所与の実験でESTAまたは胚は、制限された真菌の成長を持っているので、のRNAiサイレンシングの効果を過大評価ができ、従って、これらを除去しました。また、種皮および胚の除去は、胚がよりファイトアレキシンとより多くのRNA含量を持つことになります運ぶ半分子葉として、分析のばらつきの原因を制限することができます。 これらの実験における成熟グループと種皮と胚芽を除去することによって分析に加えて、さらにいくつかの観測を指摘することは重要である。結果は最大96時間のインキュベーションのために示されているもののA）は、72以下で使用しないことが推奨されます種子は96時間によって分解を受けるように、一貫性のある結果を得るための時間。およびb）同じシードから半子葉は、ランダムにサンプリングされたものの、完全に独立したサンプルを構成しないのに対し、RT-PCRおよびトランスジェニック事象の中アフラトキシンの蓄積が種子の間の最小変動を示しました。また、正確な真菌の胞子数、接種量2μLのS、および側面に滴下を回避子葉の切断面上の胞子のアプリケーションは、発芽胞子を植物組織にさらされていることを確認してくださいすることが重要です。 図4（下）の最後のフレームに示すように、プレート上に水/寒天を1.5％（w / v）のにする必要があり、より柔らかい寒天は胞子の流出が発生します。制限され、特定のトランスジェニック事象から可用性をシードする必要があり、サンプリングではなく、同様の結果（ すなわち 、 図7）を得た三連の複製で行うことができます。しかし、三連のサンプルは、標準誤差を減らすのに役立ちます。この方法の唯一の制限は、それがアフラトキシン検出/定量化のための高感度システム（UPLC）が必要なことであるが、同時にこれはあまり高感度な方法によってアフラトキシン検出されてはならないRNAiの効果を過大評価の可能性を低減します。 結論として、この方法は、初めて勉強する信頼性の高いアプローチを提供していますアフラトキシンの制御におけるRNAiの効果。一週間以内に全体の作付けシーズンから実験のための時間を削減する、この方法は、途方もなく緩和および/ ​​またはアフラトキシンの排除に向けたRNAi-ピーナッツ/ アスペルギルス pathosystemの研究を加速していきます。

約4.5億人が慢性的にアフラトキシン1、自然2で知られている最も強力な発がん物質にさらされています。これらのマイコトキシンは、トウモロコシ、キャッサバ、米、ナッツ、穀物やスパイスなど世界3に食用作物の25％を汚染する。4。子供5で発育阻害原因アフラトキシン、免疫系6を損ない 、人間の生検7,8における肝細胞癌-の58％に存在し、アフラトキシン中毒症9,10の定期的な大流行時に数百人を殺します。アフラトキシンは、通常、 アスペルギルス・ フラバス と A.によって生成ポリケチド由来のマイコトキシンですparasiticus;アフラトキシンB 1及びB 2は、A によって製造されていますA.一方フラバス 、 parasiticusも 、G 1およびG 2が生成されます。これらの化合物の化学構造およびUPLCによりそれらの分離を示すクロマトグラムを図1に示します。 </strオング&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> 図1. アフラトキシンおよびRNAi トップを 挿入します。化学構造（左）とクロマトグラムの例（右）4つの最も一般的なポリケチド由来のアフラトキシンの： アスペルギルス parasiticusにより産生され、B 1、B 2、G 1、G 2を 、 。。 フラバスは、B 1およびB 2が生成 下：RNAiの中の遺伝子断片の概略はp5XCAPDはピーナッツ変換に使用される構築、矢印の下の数字は、 アスペルギルス・フラバス のゲノム中の遺伝子断片アクセッション番号です。 PIV2：ジャガイモのイントロン。 BP：塩基対; RT_5X_1とRT_5X_2：リアルタイムPCRのプライマー部位は、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 4 NGに基づいて算出した場合ピーナッツ中のアフラトキシンによる輸出の経済的損失だけでは$ 450万ドルを超えています。欧州連合（EU）11で人間の消費のために許可されたアフラトキシンのグラム-1限界。アフラトキシンは、60年12知られています。しかし、多くの農業は他の真菌株13,14の適用を含め、それらの影響を軽減するために開発されたものの、制御の一貫した方法が存在せず、耐性植物品種は使用できません。でも、病原体の侵入のための助けとなる条件下で、マイコトキシン蓄積が予測不可能であり、正規分布に従わないため、アフラトキシンに対する抵抗性試験植物遺伝資源は、特に困難です。このように、実験は通常、種子や100-1,700グラムの複数のサンプルの何百ものデータ15,16のばらつきを低減するために、大規模な植林面積を必要とします。 RNA干渉がありました1998年17で発見されました。そして、「サイレンシング」の利点は、現在、新しいアプリケーションの数で 、例えば、探索されている。、転移性乳癌18、肝臓癌19、骨髄性白血病20、および昆虫21と線虫22に対して植物保護におけるに対するヒトの治療に。植物では、RNA干渉信号も植物宿主25に密着している真菌病原体の内部に、23,24サイレンシング全身転写後遺伝子を担当する低分子干渉RNA（siRNA）および高分子量RNAを、細胞に細胞を移動することができます。レタス26における真菌病原体の遺伝子の植物媒介サイレンシングのRNAiの有効性植物の地上部における症状のこれらの、目視検査（葉）は、疾患の定量化を可能にするために、いくつかの植物pathosystemsに記載されている、 すなわち 、卵菌類Bremia小麦で、 プクキニア <suバナナ28のp&gt; 27とフザリウム 。はるかに難しいが、葉は、（種子）侵略器官は土壌の数インチ下にある感染症の症状を示さないようピーナッツの工場でマイコトキシン、特にアフラトキシンを制御するためのRNAi効果を評価することであり、感染症の発生は予測できない、唯一の化学物質であります分析では、アフラトキシンの存在を決定することができます。また、ピーナッツの各トランスジェニックイベントは、通常、数種子（植物当たり4-6）を生成し;そのため、大規模なフィールドプロットで無アフラトキシン蓄積特性、全体の作付季節を持続し、種子の数百を使用するための伝統的なテストは現実的ではありません。この方法は、わずか数種を使用して、一週間以内で、RNAiのピーナッツ種子導入遺伝子の存在について、および無アフラトキシン蓄積形質について分析するために、ここで説明されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

国連食糧農業機関は、世界の食糧作物の25％がアフラトキシンに汚染されていると推定しています。それは毎年の非ヒトの消費に破壊されたり流用されている食品の億トンを表します。アフラトキシンは、通常、穀類、ナッツ、根菜類や他の農産物におけるカビアスペルギルス・ フラバス と A. parasiticusにより蓄積された強力な発癌物質です。ピーナッツ植物におけるRNA干渉（RNAi）による5アフラトキシン合成遺伝子のサイレンシングは 、Aを接種した後アフラトキシンの蓄積を制御するために使用されましたフラバス 。以前は、何の方法は、これらは通常、いくつかの種子を生産するように、個々のピーナッツトランスジェニック事象においてRNAiの有効性を分析するために存在しなかった、とアフラトキシン導く条件下で大規模なフィールド実験の伝統的な方法は、オプションではありませんでした。フィールドに、自然に汚染種を発見する確率は1/1にしばしば1/100また000は、アフラトキシン汚染が均一に分布されていません。我々の方法は、リアルタイムPCR（RT-PCR）のために処理小片または小RNAシークエンシングを用いて、トランスジェニック事象当たり数種を使用し、超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）によってアフラトキシン蓄積の分析のために。 RNAiの発現ピーナッツライン288から72と288から74には、14,000 NGまで蓄積し、対照と比較してアフラトキシンB 1が100％削減（p≤0.01）とB 2に現れた。グラム-1アフラトキシンB 1のアフラトキシン生産A.を接種フラバス 。参考までに、米国では、人間の消費の許容アフラトキシンの最大合計は、20 ngのです。G -1。このプロトコルは、トランスジェニックピーナッツの種子とその評価方法におけるアフラトキシンのRNAi仲介制御の適用を説明しています。私たちは、ピーナッツや他の作物の育種への応用は、科学のこの重要な分野で急速な進歩をもたらすと考えています、医学、ヒトの栄養は、大幅主要食用作物​​でアフラトキシン、および潜在的に他のマイコトキシンを制御するために、国際的な取り組みに貢献していきます。

プラスミドp5XCAPDはpCAPD 29の誘導体としてなされたものであり、ピーナッツ植物を形質転換するためにそれを使用しました。このベクターは、Aのアフラトキシン合成遺伝子の5小さな断片の逆方向反復、70〜80塩基対のそれぞれを、運びますイントロン（ 図1）によって分離フラバス 。 AFL2G_07224（aflR）、AFL2G_07223（AFLSまたはaflJ）、AFL2G_05027（アフラトキシン排出ポンプ、aflep）、AFL2G_07228（AFLC / pksA / pksL1）、およびAFL2G_07731（PES1）は構造物に使用された、 図1相当の数のフラグメントに。 BROAD研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、および文献42でフラバスのゲノムアノテーション。 99ピーナッツ行の合計は、変換プロセスを経て再生させた、50は、PCRは、STN-PCRによって検出NPTII陽性であった、と33行がPCR陽性と生産種子でした。のみ7 PCR陽性ラインがクローン増殖とPRESENによって試験しましたアフラトキシンの蓄積のためのT法は、すべての7の間には、コントロールよりも60％と100％未満アフラトキシンの蓄積を示しました。ここでは、それらの7行の2の結果を示します。個々のトランスジェニック事象は、通常、いくつかの種子を生産するように、この方法は、依然としてパラメトリック統計解析を行うことができながら、種子数の最小値を使用するために開発されました。試料調製および実験のフローチャートを図5 及び表1に示されている。トランスジェニック種子の最初の世代は、典型的には、ヘミ接合であるが、それが細胞の細胞及び低分子干渉RNA（siRNA）の全身の動きが発生することを期待されていますRNA干渉を介してプラント全体のアフラトキシン合成サイレンシングを与える必要があります。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> 方法の概略 図5 のフローチャートは、サイレンシングにおいてRNAiの有効性を分析します </strong&gt; ピーナッツ種子における アスペルギルス アフラトキシン合成遺伝子 。ワークフローのグラフィック表現遺伝子発現またはアフラトキシン分析のためのピーナッツサンプルを処理する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> RNAiのピーナッツライン288から72と288から74ゲル部分は、図6（上）に示されているSTN-PCRによって試験したとき、NPTII選択可能メーカーの存在を示した、オリジナルの画像は、要求に応じて作成者から入手できます。それは二つの遺伝子には、cmr（クロラムフェニコール耐性）および植物に未知の効果のCCDB（毒素）の逆方向反復をコードしているので、プラスミドpCAPDは、形質転換のコントロールとして使用されませんでした。 PCRネガティブピーナッツライン288から9と再生プロセスを経て、RNAiのラインと同じ条件で増殖させた他は、負の詐欺として使用しましたトロール。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> トランスジェニックの 図6. 検出とRNAiのリアルタイム表現挿入 トップ ：シングルチューブ、トランスジェニックピーナッツラインのRNAi-288から72およびRNAi-288から74のネストされたPCR検出、陽性植物。コントロール：W（水）、PP（正の植物）、MM（マスターミックス）、P（プラスミドp5XCAPD）。画分を1/2〜1/4〜1/8 1/16 DNAの2倍希釈を表す下 ：（未熟で、 図1のようRT_5X_1、RT_5X_2：RNAiの発現のリアルタイムPCR検出は、（プライマーセットを挿入しますイエロー）、24および48時間のインキュベーションでのトランスジェニック系統の（茶色）子葉を成熟;灰色の線：C T = 1ヒストグラムが3生物学的サンプルの平均および標準誤差バー（T）を表します3つの技術の反復で。 RNAiのインサートの相対的な定量化は、内部統制と5.2.2と5.3で説明したように計算された導入遺伝子の比較倍式としてハウスキーピング遺伝子アクチンに関して標準化した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> アフラトキシン蓄積の植物宿主のRNAi媒介電位制御の有効性を試験するために、 アスペルギルス・ フラバス NRRL 3357の新たに採取した分生子は、胚および種皮を除去した半子葉の切断面に塗布した（ 図3、図4）。ゲノムが配列決定され、p5XCAPDを設計するための基礎となったされたA. フラバスの NRRL 3357は、親切にUSDA-ARS-NPRL博士ホーンにより提供されました。 30℃で24、48および72時間後の半子葉の結果として真菌の侵入はショーです<html> nは、図4に。接種半子葉のサンプルは、72、48、24で収集したインキュベーションの96時間、およびLC-MSによって主4アフラトキシンB 1、B 2、G 1及びG 2 UPLCを使用するために分析し、確認されました; 結果を図6に示す 。アフラトキシン濃度は変更36で公開された方法を用いて決定しました。 96時間のインキュベーションでは、子葉が原因真菌感染症の崩壊を開始します。 RNAiのライン288から72には、未熟子葉内のすべてのサンプリング日における成熟したものの中で最もサンプリング日における対照よりもアフラトキシンの有意に低いレベルを示しました。 RNAiのライン288から74には、ほとんどのサンプリング日のアフラトキシンの有意に低いレベルを示しました。 Tukeyの検定の有意のレベルは、図7のグラフにアスタリスクで示されています。 <html> g7.jpg &quot;/&gt; アスペルギルス・フラバス とのインキュベーション（24、48、72および96時間）の後半分ピーナッツ子葉図 7. アフラトキシンB 1 およびB 2コントロール：。288から9非トランスジェニックラインの種子; RNAi：RNAiを288から72およびRNAi-288から74、RNAiのp5XCAPDためのトランスジェニックからの種子は5アフラトキシン合成遺伝子を沈黙させます。 （A）成熟種子中のアフラトキシンB 1（ブラウン）。 （B）アフラトキシンB 2成熟種子。未熟種子中の（C）未熟種子中のアフラトキシンB 1（黄色）と（D）アフラトキシンB 2。重複した生物学的サンプルの対応する標準エラーバー（T）との平均値を表しています。統計的に有意な差Tukeyの検定*：0.05≤P、**：P≤0.01、***：P≤0.001。S：//www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 全体的に、RNAiを288から72には、コントロールと比較した実験（24〜96時間のインキュベーション）、アフラトキシンB 2の 94％-100％の減少、及びアフラトキシンB 1が90％-100％の減少を通じて示しました。 RNAiを288から74には、アフラトキシンB 1、 図7のアフラトキシンB 2、60％-100％の減少で63％-100％の減少を示しました。 RNAiの挿入物の発現のリアルタイムPCR検出のために使用したプライマーは、図1に示されている。ピーナッツ種子の子葉は、それらの自然の防御を除去し、最もにさらされる領域にRNAiの潜在的影響を検出することができるように、胚ずに分析しました真菌の侵入、子葉。挿入RT_5X_1をプライマーセットによってライン288から74の未熟子葉（黄色）で検出されたRNAiの発現は、C Tの上に4倍でした</sUB&gt; = 1ネガティブコントロールのしきい値、およびRT_5X_2をプライマーセットによっては、すべての24時間のインキュベーションで、しきい値を超えて19倍でした。ピーナッツ変換に使用される5つの連続した遺伝子断片のうち、少なくとも3、5027、7223および7228（それぞれaflep、AFLS / aflJ、及びAFLC / pksAは、）、RT-PCR（ 図1,6）によって検出しました。 RNAiのインサートの発現は24時間で、または48時間のインキュベーション、 図6（下）での成熟または未熟子葉の成熟した子葉では検出されませんでした。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> ピーナッツライン </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> サンプリングの時間 </td><td colspan="3" style="width:192px;"> RT-PCR用のサンプル </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> アフラトキシン分析用サンプル（接種） </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> N種子のアンバー</td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> （非接種） </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;">担当者1 </td><td style="width:64px;">担当者2 </td><td style="width:64px;">担当者3 </td><td style="width:64px;">担当者1 </td><td style="width:64px;">担当者2 </td><td style="width:64px;">担当者3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> RNAiの（黄色） </td><td style="width:64px;"> 24時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdスタイル= &quot;幅：64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;">制御</td><td style="width:64px;"> 24時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> （黄） </td><td style="width:64px;"> 48時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72時間</td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> 表2。 小サンプルのセットアップの例は、RNAiピーナッツ種子における遺伝子発現とアフラトキシンの蓄積を分析した。完全な発現の解析と1満期グループのアフラトキシンを（ すなわち、黄色）、3サンプリング時間（24、48および72時間）で、三連で、4.5種子を必要とする、テーブル内の各ナンバーワンは半分子葉を表します。

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RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

我々は、真菌アスペルギルス・ フラバスでアフラトキシン合成遺伝子をサイレンシングするためのRNA干渉信号を含むピーナッツ種子でアフラトキシン及び導入遺伝子発現の分析のための方法を実証します。植物におけるマイコトキシンのRNAi媒介性制御は、以前に報告されていません。

ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/<em&gt;アスペルギルス</em&gt; Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

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Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

20.8K ビュー.  United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service. 我々は、真菌アスペルギルス・ フラバスでアフラトキシン合成遺伝子をサイレンシングするためのRNA干渉信号を含むピーナッツ種子でアフラトキシン及び導入遺伝子発現の分析のための方法を実証します。植物におけるマイコトキシンのRNAi媒介性制御は、以前に報告されていません。 

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

計算機シミュレーションを通してフォトバイオリアクターで藻類の成長を促進するために排煙設定を最適化

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

環境学

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

ギブソンアセンブリと遺伝子銃を用いてタバコの一過性の遺伝子発現

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

マチ付きThermogradient表は、植物の成長を評価し、土壌プロセスの監視のための土壌の温度を制御します

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric chemistry and climate. The complex production mechanisms and reaction pathways make this a challenging research topic. To address these issues, an environmental chamber, providing enough residence time and close-to-ambient concentrations of precursors for secondary organic materials, is needed. The Harvard Environmental Chamber (HEC) was built to serve this need, simulating the production of gas and particle phase species from volatile organic compounds (VOCs). The HEC has a volume of 4.7 m3 and a mean residence time of 3.4 h under typical operating conditions. It is operated as a completely mixed flow reactor (CMFR), providing the possibility of indefinite steady-state operation across days for sample collection and data analysis. The operation procedures are described in detail in this article. Several types of instrumentation are used to characterize the produced gas and particles. A High-Resolution Time-of-Fight Aerosol Mass Spectrometer (HR-ToF-AMS) is used to characterize particles. A Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometer (PTR-MS) is used for gaseous analysis. Example results are presented to show the use of the environmental chamber in a wide variety of applications related to the physicochemical properties and reaction mechanisms of organic atmospheric particulate matter.

This paper describes operation procedures for the Harvard Environmental Chamber (HEC) and related instrumentation for measuring gaseous and particle species. The environmental chamber is used to produce and study secondary organic species produced from the organic precursors, especially related to atmospheric organic particulate matter.

生産およびハーバード大学環境チャンバーにおける有機粒子状物質の測定

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

葉の木の粒子状物質の除去能力を評価します。

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform across ecological zones. To best protect public and veterinary health from these insects, the environmental limitations of pesticides need to be investigated to inform effective use of the most appropriate pesticide formulations and techniques. We have developed a research program to evaluate combinations of pesticides, pesticide application equipment, and application techniques in hot-arid desert, hot-humid tropical, warm and cool temperate, and urban locations to derive pesticide use guidelines specific to target insect and environment. To these ends we designed a system of protocols to support efficient, cost-effective, portable, and standardized evaluation of a diverse range of pesticides and equipment across multiple environments. At the core of these protocols is the use of an array of small cages with colony-reared sentinel mosquitoes (adults and immatures) and sand flies (adults), strategically arranged in natural habitats and exposed to pesticide spray. Spatial and temporal patterns of pesticide efficacy are derived from percent mortality in sentinel cages, then mapped and visualized in a geographic information system. Maps of sentinel mortality data may be statistically compared to evaluate relative efficacy of a pesticide across multiple environments, or to study multiple pesticides in a single environment. Protocols may be modified to accommodate a variety of scenarios, including, for example, the vertical orientation of sentinels in canopy habitats or simultaneous testing of ground and aerial application methods.

The efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects is not uniform across different ecological zones. Here we present a system of techniques using captive vector insects as sentinels for pesticide efficacy to derive electronic maps supporting the standard evaluation of pesticides across multiple environments.

フィールドの疾病媒介蚊に対する殺虫剤の効果を可視化します。

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&amp;#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

植物環境相互作用のリアルタイム生理的フェノタイピングのためのテレメトリー、重力測定プラットフォーム

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...

Mistletoe Eradicator - A Novel Tool for Simultaneous Mechanical and Chemical Control of Mistletoe

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic and topic associations with various organisms and at the same time acting as biological pirates, exhausting the host trees by stealing water and nutrients via the haustorium. Many crop and timber trees are attacked by mistletoes, for example, dwarf mistletoes parasitize conifers, representatives of genus Tapinanthus target guava, and Phoradendron mistletoe target pecans. Recently, an increasing infestation of the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) in monoculture stands of common walnuts (Juglans regia L.)&#160;was recorded for the first time during 2018 in different regions of Kashmir Valley, India. The common chemical approach based on the spraying of mistletoe exophytes with the growth regulators, ethephon and glyphosate, was not efficient since V. album resprouted in the next vegetation season. Hand pruning of mistletoe was time-consuming, and a polyethylene covering resulted in the localized rotting of host tissues. The most efficient approach to eradicate mistletoe was the use of a novel tool called Mistletoe Eradicator, which allows to use mechanical and chemical means of mistletoe control simultaneously. It consists of a manipulating pole with the terminal pruning saw having a container filled with the growth regulator, from which the liquid slowly drops onto the saw blade through the nozzle. It allows working both from the ground and in the tree canopy. After the targeted application of 5%-10% ethephon or glyphosate to the base of the just pruned V. album stems (stubs), exophyte resprouting was significantly reduced 9 months after the pruning as compared to the only pruned or sprayed exophytes. An alternative variant of Mistletoe Eradicator was constructed in Ukraine filled just with a food color additive to track the liquid dropping and was successfully tested.

The protocol describes an easy-to-handle tool called Mistletoe Eradicator which combines mechanical and chemical approaches and is efficient in the control of mistletoe infestation on the host trees. The manuscript uses the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) as an example.

ヤドリギ根絶剤 - ヤドリギの機械的および化学的同時制御のための新しいツール

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic ...