We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
	<li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+spindle+positioning:+cortical+force+generators+in+the+limelight.">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li><li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+divisions,+fate+decisions.">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li><li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly.">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li><li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation.">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li><li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers:+the+role+of+catastrophes.">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li><li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force.">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li><li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles.">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li><li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters.">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li><li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules.">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li><li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos.">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li><li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos.">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li><li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex.">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li><li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans.">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+production+by+disassembling+microtubules.">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li><li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein.">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li><li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae.">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks.">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li><li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations.">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+of+kinesin-5.">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li><li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+function+of+Ase1p:+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins.">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li><li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast.">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules.">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li><li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast.">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone.">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li><li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart.">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li><li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks.">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li><li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division,+meiotic+nuclear+oscillation,+and+cytokinesis+checkpoint+signaling.">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li><li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cortical+Dynein+function.">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li><li>Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+centrosome+isolation+from+cultured+animal+cells.">Method of centrosome isolation from cultured animal cells.</a> Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation.">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells.">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments.">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li><li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis.">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning.">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li><li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast.">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li><li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ووصفت وسائل الجهود الحالية هنا مؤخرا لإعادة مغزل الإنقسامية الأساسية في قطرات مستحلب الماء في النفط. دراسة الجمعية المغزل داخل حدود هندسية يوفر مزايا عديدة. وتوجد آليات التغذية المرتدة هامة بين الأنابيب الدقيقة للمغزل الإنقسامية والقيود الهندسية التي يتم تجميعها. يمكن الأنابيب الدقيقة تولد دفع القوات عندما ينمو إلى الحدود الهندسية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تشريد المغزل الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، وتزايد إلى حاجز مادي يمكن أن تحدث كوارث أنيبيب. أيضا، الجمعية المغزل في هندسة تقتصر يمكن أن يؤدي إلى نضوب التدريجي من المكونات الفردية، مثل تويولين، وهذا بدوره يؤثر بشكل مباشر على معدل النمو أنيبيب 36. وهذه كلها محددات أساسية من الجمعية المغزل، والتي يمكن دراستها باستخدام المقايسات وصفها هنا. المقايسات وصفها هي حساسة جدا لاح تركيز صغيرالامتحانات التنافسية الوطنية من مكونات قطرة. هذا هو الحال بالنسبة لتويولين، حيث الاختلافات الطفيفة تركيز يمكن أن يؤدي إلى إما بطيئة جدا أو سريع جدا النمو أنيبيب. في هذه الحالة، يمكن في كثير من الأحيان لا يزال يتم تصحيح معدلات النمو أنيبيب عن طريق ضبط درجة الحرارة خلال أول دقيقة ~ 30 من هذه التجربة. حساس جدا لتغيرات في تركيز مولدات (القشرية) القوة أيضا الإنقسامية الجمعية المغزل وتحديد المواقع. هذا ومن المرجح أن تعتمد على التركيز والنقاء والنشاط من عناصر النقاء وتحتاج إلى معاير بعناية لكل البروتين المنقى حديثا. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تتم في أماكن التصوير، وهذا يتوقف على طبيعة الفحص بعض المقايضات. في البداية، وارتفاع مستويات قابلة للذوبان dimers تويولين الفلورسنت تجعل من الصعب صورة الأنابيب الدقيقة الفردية. كما الأنابيب الدقيقة تنمو أطول ونفاد تويولين للذوبان ببطء، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء يصبح تدريجيا العالي ويسمح التصوير من individuآل الأنابيب الدقيقة. وعلى النقيض من الاجهزة مع الأنظمة المفتوحة، والحبس هندسي يمنع تبادل جزيئات الفلورسنت ومكونات النظام الأوكسجين زبال داخل الخزان بكميات كبيرة، مما يؤدي إلى تبييض كبير. خاصة لرصد الجمعية المغزل وتحديد المواقع مع مرور الوقت، هو مطلوب منها صورة مع شدة الإضاءة الخافتة، حتى في وجود نظام الأوكسجين زبال قوية. تمكن هذه الطرق إعادة من أسفل إلى أعلى تبسيط الهياكل المغزل تشبه في المختبر. وبالإضافة إلى المكونات قدم هنا، وقد وصفت العديد من العوامل الأخرى للتأثير على تشكيل ثنائي القطب المغزل، وتحديد المواقع، والتوجه لتشكيل، الخ. 3. هذا النظام يمكن توسيع نطاقها لدراسة الآثار الفردية والمشتركة للمولدات قوة إضافية. هامة تسهم في تشكيل المغزل التي هي غائبة حاليا من هذا النظام هي الكروموسومات الإنقسامية. وقد تبين لونين الإنقسامية لتشكيل المغزل المباشر من قبل (1) chromokinesins التي يمكن أن تولد ما يسمى &quot;قوات القطبية طرد&quot; 3، (2) تشكيل التدرج RanGTP من قبل محددة لونين RanGEF RCC1 38، (3) kinetochores التي يمكن أن تتفاعل مع (depolymerizing ) الأنابيب الدقيقة 39 و(4) لونين نفسها، والتي يمكن أن تكون بمثابة ربيع الميكانيكية في الفترات الفاصلة بين الأنابيب الدقيقة معارضة 40. وأخيرا، يقدم النظام المذكور حاليا السيطرة الزمانية والمكانية محدودة على النشاط وتوطين عرض قوة المولدات الكهربائية. في الخلايا، العديد من العوامل الجمعية المغزل توطين لمقصورات محددة أو تنشط في غضون فترة زمنية نافذة مقيدة. ومن الأمثلة الصارخة على نشاط داينين، الذي أثرى تحديدا في الجانب الخلفي من C. ايليجانس خلية واحدة مرحلة الجنين إلى تعزيز غير المتماثلة المواقع المغزل وانقسام الخلايا. في هذا النظام، ونحن حاليا بصدد استكشاف إمكانية محاكاة هذا رالنشاط باستخدام أساليب emporal وغير المتماثلة اقترضت من تقنيات البصريات الوراثية. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو الحال بالنسبة لجيم ايليجانس الجنين والخلايا بجدار الخلية جامدة، والعديد من الخلايا لا محاصرة في الانقسام. وشكل هندسي الحبس يكون له تأثير جوهري على القوى المؤثرة على محور 41. ولذلك سيكون من المهم إعادة الجمعية المغزل وتحديد المواقع في قطرات غير كروية كذلك، وربما باستخدام نظم ميكروفلويديك أكثر تعقيدا التي تتيح تشكيل وتخزين مستحلب قطرات 42،43. وأخيرا، في الأنسجة، خلية خلية وإشارات الخلية الركيزة والتعلق توفر منبهات الخارجية التي يمكن أن تترجم إلى التوجه المغزل توجيهها، إذ أن كثيرا ما لوحظ في الخلايا الظهارية والخلايا الجذعية. لم تؤخذ جميع هذه الجوانب المتخصصة بعين الاعتبار في هذه الدراسة الحالية وربما يوفر التحديات المستقبلية لبناء نحو مزيد في الجسم الحي تشبه reconstitutions من assemb المغزل الإنقساميةلاي وتحديد المواقع.

خلال الانقسام، ويتم تنظيم الكروموسومات من الجينوم تكرارها عند خط الاستواء خلية لضمان التوزيع العادل للالصبغي الشقيقة على الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا. وتوسط المواقع كروموسوم والعزل من قبل تمسكهم ميكروتثبول المغزل القادمة من اثنين جسيم مركزي معارضة. وبالإضافة إلى ضمان توزيع كروموسوم المؤمنين، واتجاه محور الدوران الإنقسامية أيضا يملي انقسام الخلايا طائرة 1. توجه المنسق لانقسام الخلية ضروري خلال مراحل عديدة من التنمية وللتوازن الأنسجة 2. على وجه التحديد، يمكن أن ينظم الإنقسامية المغزل المواقع يؤدي إلى التوزيع غير المتماثل المحتويات الخلوية أو حتى تنتج الخلايا الوليدة من مختلف الأحجام 2. يبدأ الإنقسامية الجمعية المغزل والتوجيه في الطور الأول ومدبرة من قبل تفاعل معقد بين التعاون واستعداء القوى مولدات 3،4. تتكون القوات المتولدة من بسحب ودفع القوات أوراسكوم تليكوم القابضة. هذه القوى تنبع سواء من الاتصالات المغزل مع قشرة الخلية وكذلك من داخل المغزل، ويمكن توليدها عن طريق ديناميات أنيبيب فضلا عن المحركات الجزيئية وlinkers عبر (الشكل 1). القوى التي تدفع يمكن أن تتولد عندما تنمو الأنابيب الدقيقة ضد المنشآت جامدة مثل قشرة الخلية. اعتمادا على مجموع قوة مقاومة المتولدة داخل النظام، وهذا يمكن أن يؤدي إلى إعادة تنظيم المغزل الإنقسامية (القوات منخفضة) أو يؤدي الى التواء أنيبيب أو كارثة (قوات عالية) 5-8. مقدار القوة التي يمكن توليدها عن طريق دفع يعتمد على طول أنيبيب، منذ مدة هو حاسما بشكل قوي في أنيبيب-يرزح 9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأنابيب الدقيقة التي تنشأ من جسيم مركزي واحد يدفع على الجسيم المركزي الآخر، وهو الآلية التي تم اقترح أن يقود الفصل الجسيم المركزي في أوائل الطور 3،10. في الإعلانdition لدفع القوى التي تولدها الأنابيب الدقيقة المتزايد، أنيبيب ينتهي اتصالات مع قشرة الخلية يمكن أن توسط أيضا سحب القوات 11. وقد أظهرت الدراسات من مختبرات متعددة النشاط تسيطر المولدات قوة القشرية مطلوب لتحديد المواقع غير المتماثلة من مغزل الإنقسامية في الجسم الحي 1. من الضروري لهذه التجاذبات غير مترجمة القشرة داينين ​​حشوية (يشار إليها فيما يلي باسم &quot;داينين ​​&#39;)، على حد ناقص أنيبيب موجهة البروتين السيارات 8،12،13. على سبيل المثال، في مهدها الخميرة، والتفاعلات الجانبية للداينين ​​القشرية مع نتيجة شعرية أنيبيب في أنيبيب التي تعتمد على محرك الانزلاق على طول القشرة 14. ومع ذلك، التجاذبات القشرية ويمكن أيضا أن تتولد عن قدرة داينين ​​لتشكيل إرفاق ملفات نهاية إلى depolymerizing الأنابيب الدقيقة 8. الطاقة المتولدة عن انكماش أنيبيب قد تؤدي إلى القوى التي عادة ما تكون لحجم أعلى (~ 50 السندات الإذنية (مرجع 15 </sتصل&gt;)) من القوى التي تولدها البروتينات الحركية الفردية (~ 7-8 السندات الإذنية (المرجع 16)). التعلق نهاية يوم من داينين ​​القشرية إلى الأنابيب الدقيقة depolymerizing يعزز المواقع المغزل في مهدها الخميرة 17 و C. ايليجانس 13. سواء على حد سواء انزلاق تعتمد على المحركات وأنيبيب التحلل مدفوعة التجاذبات القشرية أن تتعاون أو لا يجتمعان في الجسم الحي هو في المجهول الحالي. بالإضافة إلى القوى التي تدفع أنيبيب والتجاذبات القشرية بوساطة داينين، يتم التحكم المواقع الجسيم المركزي من داخل المغزل الإنقسامية من قبل العديد من البروتينات الأخرى. كينيسين 5 المحركات، وعلى سبيل المثال، كما توجد tetramers التي يمكن عبور الارتباط الأنابيب الدقيقة بين القطبين التوازي، مما أدى إلى جيل من القوات انزلاق نحو الخارج 18-20. ويلزم أعضاء الأسرة المحرك كينيسين-5 للفصل الجسيم المركزي والجمعية المغزل القطبين في جميع حقيقيات النوى درس، باستثناء C. ايليجانس<html> (إعادة النظر في المرجع 21). وعلاوة على ذلك، ومن المعروف إنتشاري linkers العرضية للأسرة / PRC1 Ase1 أيضا إلى توطين لتداخل المناطق أنيبيب من الأنابيب الدقيقة بين القطبين في المجراة في المختبر 22-27. القوى التي تولدها التوسع مدفوعة Ase1 للتداخل أنيبيب-منطقة كبيرة بما يكفي لموازنة كينيسين 14 بوساطة القوات انزلاق في المختبر 28،29. في الخلايا، مطلوب Ase1 / PRC1 لتشكيل مستقر للتداخل المناطق أنيبيب في midzone المغزل 25-27،30، مما يشير إلى أن القوى التي تولدها إنتشاري linkers عبر يمكن أن يساهم إلى حد كبير في تنظيم المغزل. وأخيرا، قوات من لونين الإنقسامية وkinetochores تؤثر الجمعية المغزل الإنقسامية وتحديد المواقع من خلال مختلف مسارات 3. وبما أن هذه العناصر ليست جزءا من المقايسات إعادة الموصوفة هنا، أنها لن تناقش بالتفصيل. jove_content &quot;&gt; نظريات مختلفة موجودة على كيفية المكونات والقوى الجزيئية المختلفة المذكورة أعلاه تتعاون في التجمع المغزل وتحديد المواقع، لكننا لا نزال بعيدين عن فهم الكمي. وبالإضافة إلى التجارب في الخلايا الحية، في التجارب المختبرية مع مكونات النقاء توفر قوية الطريق للمساعدة في تحقيق هذا الهدف، وهنا نقدم دليل البصرية إلى صيغة معدلة وموسعة من الطرق التي نشرت مؤخرا (روث وآخرون. 31)، التي يتم فيها إعادة تشكيل مغزل الأساسية في قطرات مستحلب الماء في النفط، بدءا من أقل عدد ممكن من المكونات. وباستخدام تقنيات الموائع الدقيقة، يتم إنشاء قطرات كروية مع الأحجام التي يمكن مقارنتها مع الخلايا الإنقسامية. وضمن هذه القطرات، جسيم مركزي النقاء وتويولين يمكن الجمع بين لدراسة ديناميات أستر أنيبيب، وقوة جيل وأستر-أستر التفاعلات. بواسطة إدخال القشرية (مثل داينين) وبين القطبية (مثل كينيسين 5 / Ase1) قوة المولدات الكهربائية، ونحنإعادة تشكيل هياكل مثل مغزل تزداد تعقيدا أن تبدأ اشبه الوضع في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Preparation of microfluidic chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask (Photomask on film substrate)</td>
			<td>Selba S.A. Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &#60;1-0-0&#62; 10-20 &#937;-cm, 500-550&#956;m, SSP, w/2 flats)</td>
			<td>WRS Materials</td>
			<td>4P0SSP-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Polos</td>
			<td>SPIN150I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td>
			<td>Lubribond</td>
			<td>9481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona treater</td>
			<td>Electro-technic products</td>
			<td>BD-20ACV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Microfluidic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant (Span80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>M2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>24x60mm, thickness 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26x76mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>135840/135841/135843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>PMIRB&#160;</td>
			<td>Any inverted brightfield would suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controler</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-FLEX-4C-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubing</td>
			<td>Cluzeau Info. Labo, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td>
			<td>VWR, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Reconstituting spindle formation and positioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-dithioltheitol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (Guanosine-&#39;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#954;-casein (&#954;-casein from bovine serum milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>CLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Introducing spindle-assembly factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (Adenosine-&#39;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &#8805; 97% (enzymatic))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

<html> الأساليب المعروضة في الأقسام السابقة تسمح إعادة تشكيل هياكل مثل مغزل مع زيادة تعقيد استخدام الحبس هندسي قطرات مستحلب الماء في النفط. يصف هذا القسم نتائج ممثلة التي تثبت نوعيا قدرة هذه المقايسات. خلال الانقسام، عندما يتم تجميعها المغزل القطبين، وخلايا تعتقل لتشكيل المجالات التي يبلغ قطرها حوالي 15 ميكرون، وقياس للخلايا البشرية. يوفر هذه الخاصية شكل الخلية الإنقسامية حدود الهندسي أن كلا من يقيد وتوجه حجم المغزل والتوجه 35،36. تقنيات الموائع الدقيقة، وتوفير مستوى من الحبس هندسي يشبه بدقة الوضع لوحظ في الخلايا الحية وبالتالي يسمح اعادة الاعمار من أسفل إلى أعلى مغزل الإنقسامية في المختبر. الصفحة = &quot;1&quot;&gt; زهور النجمة أنيبيب هي في حد ذاتها بالفعل قادرة على سلوك معقد عندما يقتصر النمو أنيبيب من الحدود الهندسية. كما تنمو الأنابيب الدقيقة، القوى التي تدفع الناتجة عن دمج dimers تويولين جديدة بالسيارة من جسيم مركزي اثنين على طرفي نقيض من قطرات مستحلب. في البداية، جسيم مركزي منتشر بحرية داخل حجم يقتصر (الشكل 4A، اللوحة اليسرى). بعد حوالي 20-30 دقيقة، تصبح الأنابيب الدقيقة الأولى نشر مرئية والجسيم المركزي يصبح مقيدا كما تنمو الأنابيب الدقيقة ضد القشرة في كل الاتجاهات. زهور النجمة مع الأنابيب الدقيقة من طول متوسط ​​(حوالي 50٪ من القطر قطرة) يمكن (sterically) تتنافر آخر، مع ميكروتثبول دفع بعضهم ضد البعض الآخر، وجسيم مركزي الأخرى والقشرة. وهذا يؤدي إلى &quot;القطبين&quot; ترتيب المغزل مثل نموذجي مع اثنين من جسيم مركزي معارضة بعضها البعض (الشكل 4A، لوحة المتوسطة). عندما تنمو الأنابيب الدقيقة أطول من ~ 50٪ من الحبرية-ديامتر، وجسيم مركزي الحصول على دفع المزيد للحدود معارضة من الحبرية، مع الأنابيب الدقيقة تنمو على طول القشرة الحبرية (الشكل 4A، اللوحة اليمنى). من المهم أن نلاحظ أن معدلات النمو أنيبيب في هذه المقايسات حساسة جدا لدرجة الحرارة و-تركيزات تويولين. وبالتالي فإن هذه المعايير تؤثر بقوة على الوقت الذي لوحظ التنوي لأول مرة، وعندما يتم التوصل إلى مواقف أستر ثابتة للدولة. في الخلايا، يتم إنشاء التجاذبات القشرية من خلال تشكيل إرفاق ملفات الحاملة بين أنيبيب بالإضافة إلى الغايات وداينين ​​المرتبطة القشرة. في الخلايا الحيوانية، هذه الجمعية يعتمد على مجمع Gαi / LGN / نوما، التي تستهدف غشاء البلازما عبر myristoylation N-محطة من Gαi 1. في هذه المقايسات إعادة، يتم تجاوز شرط مجمع Gαi / LGN / نوما من قبل اقتران مباشرة داينين ​​إلى الدهون المعقدة البيروكسيديز من خلالتشكيل المجمعات البيوتين streptavidin البيوتين. هذه السندات هي مستقرة نسبيا (K D ~ 10 -14 م) 37 وتشكل بسرعة (عادة في غضون 10 دقيقة بعد تشكيل مستحلب قطرات، قبل أن يصبح أنيبيب التنوي واضح) (الشكل 4B). في ظل وجود داينين ​​القشرية، جسيم مركزي عادة تحتفظ موقف أكثر مركزية، في حين أنه في حالة عدم وجود داينين، يتم دفع جسيم مركزي إلى جانبي القشرة الحبرية (الشكل 4C). نحن السبب في هذا هو نتيجة لاثنين من الآثار، التي منع ومواجهة القوى أنيبيب دفع. (1) داينين ​​تشجع بصورة مباشرة الكوارث أنيبيب، مما يحد من طول أنيبيب ومنع الإفراط في التواء أنيبيب، و (2) التجاذبات القشرية يؤدي إلى القوات تمركز صافي على زهور النجمة الفردية 8، التي مواجهة قوى التنافر أستر-أستر. وإنتشاري عبر رابط Ase1 يدفع و<html> orces التي تميل إلى زيادة المنطقة متداخلة من الأنابيب الدقيقة لمكافحة موازية 29. واتساقا مع ذلك، في ظل وجود Ase1 (وغياب داينين) تم العثور على جسيم مركزي قريبة من بعضها البعض مع Ase1 توطين لالمجمعة الأنابيب الدقيقة بين القطبين (الشكل 4D). دفع أفراد الأسرة كينيسين 5 الفصل الجسيم المركزي من خلال توفير القوى التي تدفع من داخل المغزل (انظر المقدمة). في ظل وجود Cut7 (وS. pombe كينيسين 5 ortholog)، يتم دفع جسيم مركزي لطرفي نقيض من قطرات مستحلب، حتى في وجود Ase1 (الشكل 4E). من خلال الجمع بين مولدات قوة القشرية وبين القطبية، ومستوى التعقيد يمكن زيادة أخرى في هذه التجارب، مما يؤدي في النهاية إلى فهم شامل للثنائي القطب التجمع الإنقسامية المغزل. ووصف كمي مفصل لهذه النتائج ستكون متاحة في المستقبل (روث وآخرون، مخطوطة في الإعداد). <html> ف together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; بالإضافة إلى مراقبة موقف جسيم مركزي في لحظات محددة في الوقت المناسب، والمتعلقة سلوكهم لأطوال المرصودة من الأنابيب الدقيقة، ويمكن الحصول على معلومات قيمة من خلال اتباع عملية تحديد المواقع على مرة. عن طريق الحد من التعرض مرات وشدة الليزر، فمن الممكن الآن لمتابعة المواقع أستر على فترات دقيقة 2 لا يقل عن 1 ساعة مع التبييض فقط ~ 30٪. وهذا يسمح للرصد التجمع أستر وتحديد المواقع من جسيم مركزي نشرها بحرية (0 دقيقة) عبر المركزية (12 دقيقة) لزهور النجمة اللامركزية (36 دقيقة، وأكثر من ذلك) (الشكل 5C). هذا يسهل دراسة كل من سلوك ثابت للدولة وحركية الجمعية المغزل. من خلال الجمع بين قطرات مع محتويات مختلفة في نفس العينة، هو، على سبيل المثال، من الممكن مقارنة مباشرة الجسيم المركزي المواقع والجمعية المغزل حركية في قطرات مع وبدون مولدات قوة القشرية (الشكل 5B). : المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig1.jpg" /> الشكل 1: القوى المؤثرة على الميتوزى المغزل عدة جزيئات تولد قوة تعمل على الأنابيب الدقيقة للمغزل الإنقسامية لتشجيع تكوين المغزل وتحديد المواقع. الأنابيب الدقيقة التي تنمو في القشرة خلية توليد قوة دفع على الجسيم المركزي. داينين ​​القشرية (الأرجواني) يلتقط الأنابيب الدقيقة depolymerizing ويولد قوة سحب على جسيم مركزي. داخل المغزل، وتوفر كينيسين 5 البروتينات المحرك / Cut7 قوة الانزلاق إلى الخارج على الأنابيب الدقيقة لمكافحة موازية، في حين عبر linkers للأسرة PRC1 / Ase1 تخلق معارضة الخارج قوة انزلاق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> الشكل 2: ميكروفلويديك تصميم رقاقة (A) تصميم 4 بوصة الضوئية الرئيسية التي تحتوي على 4 رقائق ميكروفلويديك. (ب) تمثيل مفصل من شريحة واحدة. رقائق تحتوي على قناة منفذ واحد وثلاث قنوات مدخل تليها الغبار فلتر. مدخل قناة 1 تحتوي على مرحلة والمياه، قناة 2 الدهون / النفط المرحلة وقناة 3 يمكن استخدامها لتمييع قطرات شكلت مع دهن إضافية / نفط المرحلة. (ج) تمثيل مفصل من تقاطع فيها الدهون / النفط مرحلة (قادمة من أعلى وأسفل) تجتمع مع الماء مرحلة (قادمة من اليسار). عند تقاطع، وقطرات تشكيل وتتدفق نحو قناة مخرج على اليمين. (د) تمثيل مفصل من الغبار فلتر مع 2 ميكرون القنوات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> الشكل (3): منهجية تشكيل المياه في والنفط المستحلب القطرة (A) رقاقة ميكروفلويديك والأنابيب على microfluidics على المجهر مشرق الميدان. كلا يتم توصيل أنابيب الماء والدهون / النفط المرحلة إلى مداخل رقاقة 1 و 2 على التوالي. (ب) القيود المفروضة على رقاقة على microfluidics حيث تلبية الماء والدهون /-مراحل النفط. عن طريق تغيير الضغوط، حجم قطرات يمكن السيطرة عليها. (ج) تصميم خلايا تدفق المغلفة PDMS. بعد تحميل قطرات في خلية تدفق، وتغلق فيه نهايات مفتوحة مع Valap إضافية. (د) رسم تخطيطي للتشكيل الحبرية. وتستخدم قطرات لتغليف جسيم مركزي، تويولين والمكونات الإضافية المطلوبة لتشكيل المغزل الإنقسامية. (E) رسم تخطيطي للاستهداف القشرية-داينين. ويستهدف البيروكسيديز (بيو) داينين ​​إلى الدهون المعقدة البيروكسيديز من خلال streptavidin (STRP). <aأ href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; الهدف = &quot;_ فارغة&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> الشكل 4: النتائج التمثيلية للمغزل Reconstitutions مع زيادة التعقيد (A) توقعات كثافة القصوى من قطرات تحتوي على اثنين من جسيم مركزي تظهر أمثلة من الأنابيب الدقيقة قصيرة ومتوسطة وطويلة. وتصور جسيم مركزي والأنابيب الدقيقة من خلال إضافة 10٪ HiLyte-488 المسمى تويولين. الحانات النطاق = 10 ميكرون. (ب) توطين-GFP البيوتين-داينين-TMR في غياب (- يسار) وجود (+، يمين) من streptavidin (STRP). تحديد المواقع (C) أنيبيب أستر في غياب (- يسار) أو وجود (+، يمين) من القشرية GFP-البيوتين-داينين-TMR. (D) أنيبيب أستر (اللوحة اليسرى، غرامالتابعين) لتحديد المواقع في وجود Ase1 (لوحة المتوسطة والأحمر). (E) أنيبيب أستر (اللوحة اليسرى، الأخضر) لتحديد المواقع في وجود Ase1 وCut7 (كينيسين 5) (لوحة المتوسطة والأحمر). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> الرقم 5: التصوير أستر المواقع حيوية في المختبر (A) تصميم كوب PDMS الذي يسمح التصوير قطرة لمدة تصل إلى عدة ساعة. (ب) توليد وتخزين والتصوير من قطرات (المنقولة) التي تحتوي على محتويات مختلفة، ويتضح من غياب (يسار) إدراج (يمين) من ديكستران فلوري (اليكسا 647). (C) وصور طائرة واحدة من 60 دقيقة مرور الزمن (2 فترات دقيقة) مأخوذة من ض المكدس (2 ميكرون مسافات) من الإعلانroplet يحتوي على جسيم مركزي واحد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets at JoVE.com

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

إعادة تشكيل الأساسي الميتوزى المغازل في كروية مستحلب قطرات

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Video: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

عنوان تغليف الخلية عن طريق الرذاذ

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

موسع في فيفو الحيوانات الصغيرة التصوير بالرنين المغناطيسي وMRS : الإجراءات التجريبية الأساسية

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

دراسة حاجز الميتوزى بواسطة يوضح الحيوي Kinetochore السلوك البروتين والحركة كروموسوم في المعيشة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الجنين المخلوي

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.