We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
	<li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+spindle+positioning:+cortical+force+generators+in+the+limelight.">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li><li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+divisions,+fate+decisions.">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li><li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly.">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li><li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation.">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li><li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers:+the+role+of+catastrophes.">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li><li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force.">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li><li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles.">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li><li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters.">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li><li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules.">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li><li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos.">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li><li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos.">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li><li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex.">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li><li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans.">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li><li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+mitosis+with+cell+polarity:+Molecular+motors+at+the+cell+cortex.">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li><li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+production+by+disassembling+microtubules.">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li><li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein.">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li><li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae.">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks.">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li><li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations.">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5.">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li><li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+functions+of+kinesin-5.">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li><li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+function+of+Ase1p:+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins.">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li><li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast.">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li><li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules.">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li><li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast.">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li><li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps.">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li><li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone.">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li><li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart.">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li><li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks.">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li><li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division,+meiotic+nuclear+oscillation,+and+cytokinesis+checkpoint+signaling.">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li><li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cortical+Dynein+function.">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li><li>Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+centrosome+isolation+from+cultured+animal+cells.">Method of centrosome isolation from cultured animal cells.</a> Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).</li><li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior.">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation.">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li><li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis.">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+and+streptavidin.">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li><li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells.">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li><li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments.">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li><li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis.">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li><li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning.">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li><li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast.">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li><li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

השיטות שתוארו כאן מאמצים אחרונים נוכחיים כדי לשקם צירי mitotic בסיסיים בטיפות אמולסיה מים ב-שמן. לימוד ציר הרכבה בגבולות גיאומטריים מספק יתרונות רבים. מנגנוני משוב חשובים קיימים בין microtubules של ציר mitotic והאילוצים הגיאומטריים שבו הם התאספו. Microtubules יכול ליצור דחף כוחות כאשר הם גדלים לתוך גבולות גיאומטריים, אשר עלול לגרום תזוזת ציר mitotic. בנוסף, גדל לתוך מכשול פיזי יכול לגרום אסונות microtubule. כמו כן, הרכבת ציר בתוך גיאומטריה מוקפת יכולה להוביל דלדול הדרגתי של רכיבים בודדים, כגון טובולין, אשר בתורו משפיע ישירות על צמיחת microtubule שיעור 36. כל אלה הם הגורמים החיוניים של הרכבת ציר, אשר ניתן ללמוד באמצעות המבחנים המתוארים כאן. מבחני המתוארים רגישים מאוד differe ריכוז קטןnces של רכיבי רביב. זהו המקרה עבור טובולין, שבו הבדלי ריכוז קטין יכולים לגרום גם איטית מדי או מהירה מדי צמיחת microtubule. במקרה זה, שיעורי צמיחת microtubule לעתים קרובות יכולים עדיין להיות מתוקנים על ידי התאמת הטמפרטורה במהלך הדקות הראשונות ~ 30 של הניסוי. הרכבה ציר mitotic ומיצוב הוא גם מאוד רגיש לשינויים בריכוז (קליפת המוח) גנרטורים כוח. זה עשוי להיות תלוי ריכוז, טוהר פעילות הרכיבים המטוהרים צריך להיות טיטרציה בזהירות לכל חלבון מטוהרים חדש. בנוסף, פשרות מסוימות צריכות להיעשות במסגרות הדמיה, בהתאם לאופי של assay. בתחילה, רמות גבוהות של הדימרים טובולין פלורסנט מסיסים להקשות microtubules פרט תמונה. כפי microtubules מתארך טובולין מסיס ייגמר לאט, יחס אות לרעש הופך בהדרגה גבוהה ומאפשר ההדמיה של individumicrotubules al. בניגוד setups עם מערכות פתוחות, כליאת הגיאומטריות מונעת חליפין של מולקולות ניאון ורכיבי מערכת נבלות חמצן בתוך מאגר בתפזורת, וכתוצאה מכך ההלבנה משמעותית. במיוחד לניטור ציר הרכבה ומיצוב לאורך זמן, היא נדרשת תמונה עם לעוצמות אור נמוכות, אפילו בנוכחות של מערכת נבלות חמצן חזקה. שיטות אלה מאפשרות הכינון מחדש מלמטה למעלה מבני ציר דמויים פשוטים במבחנה. בנוסף למרכיבים הציגו כאן, גורמים רבים אחרים תוארו להשפיע היווצרות ציר דו קוטבית, מיצוב, נטייה, עיצוב, וכו &#39;3. מערכת זו ניתן להרחיב עוד יותר כדי לחקור את השפעות הפרט בשילוב של גנרטורים כוח נוספים. תורמים חשובים היווצרות ציר שנעדרים כיום ממערכת זו הם הכרומוזומים mitotic. הכרומטין mitotic הוכחהיווצרות ציר ישיר על ידי (1) chromokinesins כי ניתן להפיק מה שמכונה &#39;כוחות-פליטה קוטב&#39; 3, (2) היווצרות של שיפוע RanGTP ידי RCC1 RanGEF הנכנס הכרומטין 38, (3) קינטוכור כי יכול לקיים אינטראקציה עם (depolymerizing microtubules) 39 ו (4) הכרומטין עצמו, שיכול לתפקד כמו קפיץ מכני-בין microtubules מנוגדים 40. לבסוף, המערכת המתוארת כיום מספקת שליטה של ​​זמן ומרחב מוגבלת על הפעילות ולוקליזציה של כוח-גנרטורים הציג. בתאים, גורמי הרכבת ציר רבים למקם את התאים ספציפיים או פעילים תוך זמן-חלון מוגבל. דוגמה בולטת היא הפעילות של dynein, אשר מועשר במיוחד בצד האחורי של ג elegans העובר בשלב אחד התא לקדם מיצוב ציר אסימטרי חלוקת התא. במערכת זו, אנו בוחנים בימים אלה אפשרות מחקה t כזהבאמצעות שיטות של פעילות emporal אסימטרי שהושאל טכניקות אופטו-גנטית. בנוסף, כפי שקורה עבור ג elegans לעובר ותאים עם דופן תא נוקשה, תאים רבים אינם לעגל כלפי מעלה ב מיטוזה. צורת הכליאה הגיאומטרית תהיה השפעה מהותית על הכוחות הפועלים על הציר 41. לכן יהיה חשוב כדי לשקם ציר הרכבה ומיצוב טיפות הלא כדורית כמו גם, באופן פוטנציאלי באמצעות מערכות microfluidic מורכבים יותר, המאפשרים בעיצוב ואחסון של אמולסיה טיפות 42,43. לבסוף, ברקמות, תאים תאים ותא-המצע איתות מצורף לספק רמזים חיצוניים כי ניתן לתרגם אוריינטציה ציר מכוונת, כפי שנצפה לעתים קרובות בתאי אפיתל ותאי גזע. כל היבטים מצומצמים אלה לא נלקחו בחשבון במחקר הנוכחי זה עשוי לספק האתגרים בעתיד לבנות כלפי יותר in vivo-כמו reconstitutions של שנאספו בנוסף ציר mitoticly ומיצוב.

במהלך מיטוזה, הכרומוזומים של הגנום משוכפל מאורגנים בקו המשווה התא כדי להבטיח חלוקה שווה של כרומטידה אחות מעל לתאי הבת שהוקמה זה עתה. מיצוב ובידול כרומוזום מתווכים על ידי זיקתם microtubules ציר שמקורם שני centrosomes המנוגד. בנוסף להבטיח הפצת כרומוזום נאמנת, את הכיוון של ציר mitotic מכתיב גם את חלוקת תא המטוס 1. אורינטציה מתואמת של חלוקת תא חיונית בשלבים רבים של פיתוח עבור הומאוסטזיס רקמות 2. באופן ספציפי, מיקום ציר mitotic מוסדר יכול לגרום החלוקה הסימטרית של תוכן סלולארי או אפילו לייצר תאי בת בגדלים שונים 2. הרכבת וכיוון ציר mitotic מתחילים ב prophase והוא בניצוחו גומלין מורכב בין פעולה וקוממו כוח-גנרטורים 3,4. הכוחות שנוצרו מורכבים בכוחות משיכה ודחיפה oth. כוחות אלה נובעים הם מאנשי קשר ציר עם קליפת התא, כמו גם מתוך הכישור, והוא יכול להיוצר על ידי דינמיקת microtubule כמו גם על ידי מנועים מולקולריים-linkers צלב (איור 1). כוחות דוחפים יכול להיווצר כאשר microtubules לגדול נגד מבנים קשיחים כגון קליפת התא. בהתאם הכח להתנגד הכולל שנוצר במערכת, זה יכול לגרום מחדש של ציר mitotic (כוחות נמוכים) או לעורר קריסת microtubule או אסון (כוחות גבוהים) 5-8. כמות הכח שניתן שנוצרה על ידי דחיפה תלויה באורך microtubule, כיוון שאורך הוא הקובע חזק של microtubule-קריסת 9. בנוסף, microtubules שמקורן centrosome אחד יכול לדחוף כנגד centrosome אחרים, מנגנון אשר הוצע לנהוג הפרדה centrosome ב 3,10 prophase מוקדם. במודעהdition לדחיקת הכוחות שנוצרו על ידי microtubules גדל, microtubule מסתיים פנייה קליפת התא יכול גם לתווך משיכת כוחות 11. מחקרי ממעבדות מרובות הראו כי הפעילות המבוקרת של גנרטורים כוח קליפת מוח נדרשה עבור המיצוב הסימטרי של צירי mitotic in vivo 1. Essential לכוחות המשייכים אלה הוא dynein ציטופלסמית-מקומי הקורטקס (להלן המכונה &quot;dynein &#39;), חלבון מנוע microtubule מינוס סוף מכוון 8,12,13. לדוגמא, ב ניצני שמרים, אינטראקציות לרוחב של dynein קליפת המוח עם תוצאת סריג microtubule ב microtubule מנוע תלוי הזזה לאורך הקורטקס 14. עם זאת, כוחות משיכה קליפת המוח יכול להיווצר גם על ידי היכולת של dynein ליצור התקשרויות-על קץ depolymerizing microtubules 8. האנרגיה שנוצרה על ידי התכווצות microtubule עלולה להוביל כוחות כי הם בדרך כלל בסדר גודל גבוה (~ 50 PN (אסמכתא 15 </sעד&gt;)) מ הכוחות שנוצרו על ידי חלבוני מנוע יחידים (~ 7-8 pN (נ&quot;צ. 16)). מצורף-על סוף dynein קליפת המוח כדי microtubules depolymerizing מקדמת מיצוב ציר בשמרים ניצני 17 ו- C. elegans 13. בין אם הן כוחות משיכה קליפת המוח מונע depolymerization הזזה microtubule תלויי המנוע יכול לשתף פעולה או שייכות לקבוצה אחת בלבד in vivo הוא ידוע כיום. בנוסף לכוחות דוחפים microtubule וכוחות משייכים קליפת מוח בתיווך dynein, מיצוב centrosome נשלט מתוך ציר mitotic ידי חלבונים רבים אחרים. מנועי Kinesin-5, למשל, קיימים כפי tetramers שיכול קשר צולב microtubules interpolar antiparallel, וכתוצאה מכך ההדורה של כוחות זזים כלפי חוץ 18-20. בני משפחת מנוע kinesin-5 נדרשים להפרדת centrosome והרכבה ציר דו קוטבית בכל אאוקריוטים למד, למעט ג elegans<html> (הנסקרת תוך התייחסות 21). יתר על כן,-linkers צלב diffusible משפחת Ase1 / PRC1 ידועים גם למקם חופפים אזורים microtubule של microtubules interpolar in vivo ו במבחנה 22-27. הכוחות שנוצרו על ידי הרחבת מונחת Ase1 של האזור-microtubule החופף הם גדולים מספיק כדי לאזן kinesin-14 כוחות הזזה בתיווך במבחנה 28,29. בתאים, Ase1 / PRC1 נדרש ליצירת יציבה של חופפים אזורים microtubule ב ציר midzone 25-27,30, דבר המצביע על כך הכוחות שנוצרו על ידי-linkers צלב diffusible יכול לתרום באופן משמעותי לארגון כישור. לבסוף, כוחות מן הכרומטין קינטוכור mitotic להשפיע הרכבת ציר mitotic ומיצוב דרך מסלולים שונים 3. מאז רכיבים אלה אינם חלקים מבחני הכינון מחדש המתואר כאן, הם לא יידונו בפירוט. jove_content &quot;&gt; תאוריות שונות קיימים על איך הרכיבים והכוחות המולקולריים השונים המתוארים לעיל פעולת הרכבה ומיצוב ציר, אבל אנחנו עדיין רחוקים מהבנה כמותית. בנוסף ניסויים בתאים חיים, בניסויים במבחנה עם רכיבים מטוהרים לספק עצמה מסלול כדי לעזור להשיג מטרה זו. כאן אנו מציגים מדריך ויזואלי גרסה מותאמת המורחבת של השיטות שפורסמו לאחרונה (Roth et al. 31), שבו צירים בסיסיים מחדש בטיפות אמולסיה מים ב-שמן, מתחיל עם מספר מינימאלי של רכיבים. שימוש בטכניקות microfluidic, טיפות כדור נוצרים עם גדלים כי הם דומים לתאי mitotic. בתוך טיפות אלה, centrosomes ו טובולין מטוהרים ניתן לשלב כדי ללמוד דינמיקת אסטר microtubule, לכפות דור ואינטראקציות-אסטר Aster. By החדרת קליפת המוח (כגון dynein) והבין-קוטבית (כגון kinesin-5 / Ase1) כוח-גנרטורים, אנחנולשקם מבני ציר דמוי ויותר מורכבים שמתחילים להידמות מצב vivo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Preparation of microfluidic chips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &amp;lt;1-0-0&gt;10-20 &amp;Omega;-cm, 500-550 &amp;mu;m, SSP, with 2 flats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&amp;nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Microfluidic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Kartell</td><td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, thickness 1.5</td></tr><tr><td>Glass-slides</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory sealing film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&amp;nbsp;</td><td>Any inverted brightfield would suffice</td></tr><tr><td>Pressure controler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Reconstituting spindle formation and positioning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-&#039;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;kappa;-casein (&amp;kappa;-casein from bovine serum milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Introducing spindle-assembly factors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-&#039;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &amp;ge;97% (enzymatic))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

<html> השיטות שהוצגו בסעיפים הקודמים לאפשר הכינון מחדש של מבנים דמויי כישור עם מורכבות גוברות באמצעות הכליאה הגיאומטרית של טיפות אמולסיה מים ב-שמן. סעיף זה מתאר תוצאות נציגים כי איכותי להדגים את היכולת של מבחנים אלה. במהלך מיטוזה, כאשר הציר דו הקוטבי מורכב, תאים לעגל כלפי מעלה כדי ליצור כדורים בקוטר של כ -15 מיקרומטר, כפי שהיא נמדדת על תאים אנושיים. צורת התא mitotic מאפיין זה מספק גבול גיאומטריות ששני מגביל ומפנה גודל ציר והכיוון 35,36. טכניקות microfluidic, לספק רמה של כליאה גיאומטרית מדויקים דומות המצב נצפה בתאים חיים ולכן מאפשר שחזור מלמטה למעלה צירי mitotic במבחנה. page = &quot;1&quot;&gt; אסתרים microtubule הם בעצמם כבר מסוגלים התנהגות מורכבת כאשר צמיחת microtubule מוגבלת על ידי גבולות גיאומטריים. כפי microtubules לגדול, כוחות דוחפים שנוצר על ידי שילוב של הדימרים טובולין החדש להסיע את שני centrosomes להתנגדות צידי טיפות האמולסיה. בהתחלה, centrosomes לפזר בחופשיות בתוך הנפח המוגבל (איור 4 א, ​​פנל שמאלי). לאחר כ 20-30 דקות, microtubules הראשון להפוך דיפוזיה גלוי centrosome הופך מוגבל כמו microtubules לגדול נגד הקליפה לכל הכיוונים. אסתרים עם microtubules באורך ביניים (בערך 50% מקוטר האגל) יכולים (sterically) דוחים זה את זה אחר, עם microtubules דוחף אחד נגד שני, את centrosomes האחר ואת קליפת המוח. התוצאה היא סדר &#39;דו קוטבי&#39; ציר דמוי טיפוסי עם שני centrosomes מנוגדים אחד (איור 4 א, ​​פנל באמצע) אחרים. כאשר microtubules לגדול יותר מ ~ 50% של רביב-diaמטר, centrosomes לקבל דחף נוסף גבולות מנוגדים של רביב, עם microtubules גדל לאורך הקורטקס האגל (איור 4 א, ​​פנל מימין). חשוב לציין כי שיעורי צמיחת microtubule מבחנים אלה רגישים מאוד הוא טמפרטורה-ריכוזי טובולין. פרמטרים אלו ולכן ישפיעו על הזמן מאוד כאשר התגרענות היא נצפתה לראשונה וכאשר עמדות אסטר יציבות הם הגיעו. בתאים, כוחות משיכת קליפת מוח נוצרים דרך ההיווצרות של קבצים מצורפים נושאת עומס בין microtubule פלוס קצות dynein קשור הקורטקס. בתאים חיים, קשר זה תלוי מורכב Gαi / LGN / נומה, שהוא ממוקד קרום הפלזמה באמצעות N-terminal myristoylation של Gαi 1. מבחני כינון מחדש אלה, הדרישה של מתחם Gαi / LGN / נומה נעקפה על ידי צימוד ישיר dynein שומני biotinylated דרךהיווצרות של מתחמים ביוטין-streptavidin ביוטין. אג&quot;ח אלה הם יציבים יחסית (K D ~ 10 -14 M) 37 ויוצרים במהירות (בדרך כלל בתוך 10 דקות לאחר היווצרות טיפת תחליב, לפני התגרענות microtubule מתברר) (איור 4 ב). בנוכחות dynein קליפת המוח, centrosomes בדרך כלל לשמור על מקום מרכזי יותר, ואילו בהעדר dynein, centrosomes נדחפים לצדדים מנוגדים של קליפת אגל (איור 4C). אנו מסיבה זו היא תוצאה של שתי השפעות, המונעות ולבלום כוחות דוחפים microtubule. (1) dynein ישירות מקדמת אסונות microtubule, ובכך מגבילים אורך microtubule ומניעת קריסה microtubule מופרז, ו- (2) כוחות משיכה קליפת המוח להוביל כוחות המרכוז נטו על אסתרים הפרט 8, אשר מצמצמים את כוחות דחייה אסטר-אסטר. The-מקשר צלב diffusible Ase1 גורם f<html> orces שנוטה להגדיל באזור החופף של microtubules אנטי-מקביל 29. בקנה אחד עם זו, בנוכחות Ase1 (והיעדר dynein) centrosomes נמצאים קרובים זה לזה עם Ase1 ללוקליזציה כדי ארוזות microtubules interpolar (איור 4D). בני משפחת kinesin-5 לנהוג הפרדה centrosome ידי מתן כוחות דוחפים מתוך כישור (ראה מבוא). בנוכחות Cut7 (להלן ortholog kinesin-5 pombe ס), centrosomes נדחפים לצדדים מנוגדים של טיפות האמולסיה, אפילו בנוכחות של Ase1 (איור 4E). על ידי שילוב של גנרטורים כוח קליפת מוח ובין-קוטביים, רמת מורכבות ניתן להגדיל עוד יותר בניסויים אלה, המוביל בסופו של דבר הבנה מקיפה של הרכבת ציר mitotic דו קוטבית. תיאור כמותי מפורט של תוצאות אלה יהיו זמינים בעתיד (Roth et al., כתב היד בהכנה). <html> p-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; בנוסף התבוננות עמדת centrosomes ברגעים קבועים בזמן, והתייחסות התנהגותם אורכי הנצפה של microtubules, ניתן לקבל מידע רב ערך על ידי ביצוע תהליך המיצוב מעל זְמַן. על ידי הפחתת פעמי חשיפה בעוצמות ליזר, ניתן כיום לבצע מיצוב אסטר ב 2 מרווחי דקות לפחות 1 שעה עם רק ~ 30% לבנים. זה מאפשר ניטור של הרכבה אסטר ומיצוב מ centrosomes לשדר באופן חופשי (0 דקות.) באמצעות מרכזי (12 דק &#39;.) כדי אסתרים מבוזרת (36 דקות נוספות) (5 ג איור). זה מקל על המחקר של שתי התנהגות היציבה קינטיקה הרכבת ציר. על ידי שילוב של טיפות עם תוכן שונה באותה המדגם, שזה לא יהיה, למשל, ניתן להשוות ישירות קינטיקה מיצוב ציר הרכבת centrosome בטיפות עם ובלי גנרטורים כוח קליפת מוח (איור 5 ב &#39;). : לשמור-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig1.jpg" /> איור 1: הכוחות הפועלים על ציר mitotic מולקולות מספר מניבות כוח לפעול על microtubules של ציר mitotic לקדם היווצרות ציר ומיצוב.. Microtubules הגדלים לתוך קליפת התא לייצר כוח דוחף את centrosome. dynein קורטיקלי (סגול) לוכדת microtubules depolymerizing ומייצר כוח משיכה על centrosomes. בתוך ציר, Kinesin-5 / Cut7 חלבונים מנוע לספק כוח הזזה כלפי חוץ על microtubules אנטי במקביל, בעוד צולבות linkers משפחת PRC1 / Ase1 ליצור מנוגדים הזזה כוח כלפי חוץ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> איור 2:. Microfluidic שבב עיצוב (א) תכנון photomask 4 אינץ המכיל 4 שבבי microfluidic. (ב) ייצוג מפורט של שבב בודד. צ&#39;יפס מכיל ערוץ לשקע אחד ושלושה ערוצי כניסה ואחריו מסנן אבק. מפרצון ערוץ 1 מכיל את פאזיים מים, ערוץ 2 שומנים / שמן פאזיים והערוץ 3 יכול לשמש כדי לדלל את הטיפין נוצרו עם פאזיים שמן שומנים / נוספים. (ג) ייצוג מפורט של צומת שבו השומנים / שמן פאזיים (מאגף העליון והתחתון) נפגש עם שלב-מים (מאגף שמאל). בצומת, טיפות יהוו וזרימה לכיוון ערוץ לשקע בצד ימין. (ד) ייצוג מפורט של א-מסנן אבק עם 2 מיקרומטר ערוצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> איור 3:. מתודולוגיה מים ב-שמן אמולסיה אגל גיבוש (א) שבב Microfluidic צינורות מיקרופלואידיקה על מיקרוסקופ שדה בהיר. הם מים וצינורות פאזיים שמן שומנים / מחוברי צריכת האוויר של שבב 1 ו -2 בהתאמה. (ב) סייג שבב מיקרופלואידיקה שבו המים ולפגוש שומנים / שמן-שלבים. על ידי שינוי לחצים, גודל הטיפות יכול להיות נשלט. (ג) תכנון זרימת תאי PDMS מצופה. לאחר טעינת הטיפין לתוך תאי הזרימה, הקצוות הפתוחים סגורים עם Valap נוסף. (ד) סכמטי של היווצרות טיפה. טיפות משמשות כדי לתמצת centrosomes, טובולין ומרכיבים נוספים הנדרשים ליצירת ציר mitotic. (E) סכמטי של מיקוד קליפת המוח-dynein. Biotinylated (ביו) dynein מיועד שומנים biotinylated באמצעות streptavidin (Strp). <aיעד href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> איור 4:. נציג תוצאות של ציר-Reconstitutions עם המורכבות הגוברת (א) תחזיות בעוצמה מקסימלית של טיפות המכילות שני centrosomes הצגת דוגמאות של קצר, בינוני, ארוך microtubules. Centrosomes ו microtubules הם דמיינו על ידי תוספת של 10% HiLyte-488 שכותרתו טובולין. ברי סולם = 10 מיקרומטר. (ב) לוקליזציה של ה- GFP-ביוטין-dynein-TMR בהעדר (-, שמאל) ונוכחות (+, מימין) של streptavidin (Strp). (C) microtubule מיצוב אסטר בהעדר (-, משמאל) או נוכחות (+, מימין) של ביוטין-dynein-TMR GFP קליפת המוח. (ד) microtubule אסטר (פאנל משמאל, גרeen) מיצוב בנוכחות Ase1 (פאנל באמצע, אדום). (E) אסטר microtubule (פאנל משמאל, ירוק) מיצוב בנוכחות Ase1 ו Cut7 (kinesin-5) (פאנל באמצע, אדום). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> איור 5: Dynamics מיצוב הדמיה אסטר במבחנה (א) תכנון כוס PDMS המאפשר הדמיה אגל של עד מספר שעות.. (ב) דור, אחסון והדמיה של טיפות (משודר) המכיל תכנים שונים, מאוירים על ידי היעדרות (שמאל) הכללה (מימין) של dextran ניאון (Alexa 647). (ג) תמונות מטוס יחידות של זמן לשגות 60 דק &#39;(2 מרווחי דקות) שנלקח Z- מחסנית (2 מיקרומטר מרחקים) של מודעהroplet המכיל centrosome יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets at JoVE.com

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Video: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Biochemistry

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

ייצור של כדוריות, בצורת תולעת Nanocrystals Micellar על-ידי שילוב ספקטרומטריית Electrospray, הרכבה עצמית ובקרת מבנה ממס מבוסס

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

Chemistry

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Bioengineering

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.

תחליב בתבנית חלקיקים מאפשר בדיקות טיפות נטולות מיקרופלואידים

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

השפעת שלד ציטו-שלד על הצורה הגרעינית ודינמיקת העיבוי בביציות עכבר

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

מחבר זרקור: הבהרת הדינמיקה של התמרה מכנו ותסיסה גרעינית בביציות עכבר

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת ענק שלפוחית encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

ייצור של כדוריות, בצורת תולעת Nanocrystals Micellar על-ידי שילוב ספקטרומטריית Electrospray, הרכבה עצמית ובקרת מבנה ממס מבוסס

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

תחליב בתבנית חלקיקים מאפשר בדיקות טיפות נטולות מיקרופלואידים

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הכנת ענק שלפוחית ​​encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

ייצור של כדוריות, בצורת תולעת Nanocrystals Micellar על-ידי שילוב ספקטרומטריית Electrospray, הרכבה עצמית ובקרת מבנה ממס מבוסס

שחזור פעילות החילוץ Msp1 עם רכיבים מטוהרים לחלוטין

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

תחליב בתבנית חלקיקים מאפשר בדיקות טיפות נטולות מיקרופלואידים

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

הכנת ענק שלפוחית encapsulating מיקרוסכמות על ידי צנטריפוגה של אמולסיה מים ב-שמן