نشكر أعضاء المختبر عبر للحصول على المشورة ومناقشة مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل خدمات الصحة العمومية 5RO1-GM078153 و جائزة زميل جديد من مؤسسة سيمونز لميكال Breker.

<ol>
	<li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microbial+avenue+to+cell+cycle+control+in+the+plant+superkingdom.">A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom.</a> Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).</li><li>Cross, F. R., Umen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+cell+cycle.">The Chlamydomonas cell cycle.</a> Plant J. 82, 370-392 (2015).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Indexed,+Mapped+Mutant+Library+Enables+Reverse+Genetics+Studies+of+Biological+Processes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Plant Cell. 28, 367-387 (2016).</li><li>Tulin, F., Cross, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin-Dependent+Kinase+Regulation+of+Diurnal+Transcription+in+Chlamydomonas.">Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas.</a> Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).</li><li>Simchen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+mutants.">Cell cycle mutants.</a> Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).</li><li>Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+the+cell-division+cycle+in+yeast.">Genetic control of the cell-division cycle in yeast.</a> I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants.">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li><li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell. 30, 248-258 (2008).</li><li>Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , (2008).</li><li>Dutcher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+and+tetrad+analysis+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).</li><li>Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+and+repair+in+plants+under+ultraviolet+and+ionizing+radiations.">DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations.</a> Sci World J. 2015, 250158 (2015).</li><li>Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+mechanisms+of+DNA+repair+by+photolyase.">Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).</li><li>Francis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+and+plant+development.+Annual+Plant+Reviews,+Volume+32.">Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32.</a> Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).</li><li>Zachariae, W., Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+end+is+destruction:+cell+division+and+the+anaphase-promoting+complex.">Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex.</a> Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).</li><li>Merchant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chlamydomonas+genome+reveals+the+evolution+of+key+animal+and+plant+functions.">The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions.</a> Science. 318, 245-250 (2007).</li><li>Ben-Aroya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+temperature-sensitive+mutant+repository+of+the+essential+genes+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).</li><li>Mnaimneh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+essential+gene+functions+via+titratable+promoter+alleles.">Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles.</a> Cell. 118, 31-44 (2004).</li><li>Schuldiner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+the+function+and+organization+of+the+yeast+early+secretory+pathway+through+an+epistatic+miniarray+profile.">Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile.</a> Cell. 123, 507-519 (2005).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+transient+expression+of+Cas9+and+single+guide+RNA+genes+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).</li></ol>

الكتاب تعلن أي مصالح مالية كبيرة.

خط أنابيب الموصوفة هنا لعزل عالية الغلة من المسوخ المميتة TS يضمن أن يفترض كل مسارات الخلوية ضرورية للجينوم كلاميدوموناس ممثلة. خطوتين الأكثر أهمية بالنسبة لمجموعة فعالة من الجينات دورة الخلية المحتملة وللقضاء على الأليلات المتكررة &quot;المسافر الدائم&quot; هي: 1) تعريف متماسك من خصائص النمط الظاهري اعتقال لدورات الخلايا غير مكتملة و2) فحص تكامل مواز ضد تحديدها بالفعل الاستعلام الجينات لتكبير جمع بأخرى معزولة حديثا. عندما متزامنة عبر الدوائر السوداء الخفيفة، كلاميدوموناس ينمو الضوئي خلال ساعات النهار وزيادة في حجم الخلية&gt; 10X دون أي تكرار الحمض النووي أو خلية تقسيم 13. تتزامن تقريبا مع بداية الليل، وخلايا ثم الخضوع لدورات متعددة بالتناوب تكرار الحمض النووي، الانقسام، وانقسام الخلايا (الشكل 8). هذا schem التنظيمييوفر البريد التمييز الطبيعي بين الجينات المطلوبة في المقام الأول لنمو الخلايا والنزاهة والجينات المطلوبة خصيصا للدورة انقسام الخلايا. وجدنا أن 10 ساعة و20 ساعة نقطة زمنية هي مفيدة للغاية لالمظهرية الخام الأولية قطع 1. لفئات واسعة من طفرات مميتة TS أن ندرك في الوقت الراهن، على أساس هذه الصور (انظر SI في تولين والصليب، 2014) 1، هي: الشق، الفشار، جولة، الصغيرة والمتوسطة، تحلل في وقت مبكر، ومتعددة دورة (الشكل 8 ). الفئات الثلاث الأكثر أهمية التي نركز عليها هي الشق، الفشار، وجولة. عرضت على &quot;الشق&quot; والظواهر &quot;الفشار&quot; في السابق أن تكون سمة من سمات معظم الآفات خلية دورة محددة (على سبيل المثال، الإنقسامية التي تعتمد على السيكلين كيناز، والآلات تكرار الحمض النووي، وTopoisomerase الثاني) 1. مظهر واحد (الشق) أو متعددة (الفشار) طائرات واضحة من انقسام الخلايا بدايته ولكن غير ناجحة هو morphol مريحةمؤشر ogical من بدء دورة الخلية. هذه المسوخ المعرض عموما عيوب نمو ضئيلة أو معدومة، مع زيادة في حجم الخلايا مماثلة لWT على علامة 10 ساعة. والشق والفشار الظواهر واضحة في 10 ساعة ويتم تطويرها بالكامل (كثيرا ما يرتبط مع تحلل الخلايا) بواقع 20 ساعة. خلايا &quot;جولة&quot; تنمو على نحو مماثل لWT لكن مع إنتاج خفضت كثيرا من الطائرات تقسيم بدايته واضحة، وبالتالي العوائد الكبيرة، وخلايا القبض الجولة. وتراجعت المسوخ السابقة في هذه الفئة إلى مكونات معقدة 14 أو في الجينات الداعمة للطور الصعود المطلوبة لوظيفة أنيبيب (العوامل المساعدة للطي تويولين، جاما تويولين حلقة مجمع) 1. في أوقات لاحقة، وهذه الخلايا غالبا ما تظهر تحلل الخلايا وضوحا. &quot;الصغيرة&quot; وخلايا &quot;متوسطة&quot; تنمو إما تكاد لا تذكر (الصغيرة) أو أقل بكثير من وزن (وسط). العديد من هذه المسوخ التي تم تحديدها حتى الآن لديهم آفات في الجينات التي تشير إلى الأدوار في cellula الأساسي الشروحعمليات النمو ص (الترجمة أو نشوء حيوي الغشاء). التمييز المجهري الرئيسي بين المتوسطة وجولة يعتمد على مقدار النمو في 10 ساعة (جولة: مثل WT، المتوسطة: انخفاض). لأن الفئات الصغيرة والمتوسطة هي كبيرة جدا وربما تعكس الآفات في مجموعة كبيرة من مسارات الخلوية، نحن لسنا في محاولة لتشبع هذه الفئات. ومع ذلك، فإننا لا نريد أن جزيئيا تحديد ممثلي الطبقة لفهم الظواهر الخسارة في مسارات متنوعة. فئتين غير مدروسة هي: 1) المسوخ التي تفقد سلامة (فقدان اللون الأخضر، وفقدان refractility) من قبل علامة 10 ساعة، مع القليل من الأدلة على نمو الخلايا مسبق و2) دورات متعددة الناشر في وقت مبكر. خلايا تتكاثر على نحو مماثل لWT في 10 و 20 ساعة، على الرغم من أنها تظهر عجزا كاملا لتنفيذ الانتشار على المدى الطويل. نحن تميز معظمها &quot;من الدرجة الأولى&quot;، &quot;الفشار&quot;، و &quot;جولة&quot; واستبعاد خلايا صغيرة مدورة والمتوسطة، وكذلككما المسوخ تتسرب منها المياه التي كاملة القليلة انقسامات الخلية. هذا هو أساسا لضمان ميزات الخلوية الأساسية، مثل النمو وسلامة الغشاء، وظيفية، وإثراء احتمال لالجينات ذات الصلة الانقسام. تم العثور على هذا النهج لتكون فعالة تجريبيا. ومع ذلك، قد يكون هذا الجين دورة الخلية هو عديد المظاهر ولها أدوار إضافية في وقت سابق من G1، قبل التقسيم الفعلي. مثل هذه الحالات، والتي نتوقع أن تكون نادرة، وغاب. أكثر عموما، ونحن نهدف لاعتقال متجانسة، وهذا احتمال كبير ويرجع ذلك إلى واحد الطفرة المسببة هذا هو بروتين مختلة تماما. ومع ذلك، لنفس السبب كما هو موضح فقط، قد يكون هناك عدة نقاط اعتقال وبالتالي، بعض المرونة من المستحسن في اختيار المرشحين. من أجل إثراء مجموعة مع الجينات التي تم تشخيصها حديثا، ويعاير المرشحين الذي تم اختياره لتكامل. نحن بحاجة ts- في السيطرة الايجابية (الاستعلام ضد طفرة الاستعلام) ونهاية الخبر + في السيطرة السلبية (QUERذ ضد WT). طفرات جديدة في مجموعة تكامل نفس الاستعلام هي ts-. العضوية في مجموعة تكامل نفس يعكس دائما تقريبا آفة الجزيئية في نفس الجين (وقد كان هذا هو الحال بالنسبة لكل هذا الجين اختبرناها). لذلك، ل &quot;المسافرين الدائمين&quot;، هذا المعيار هو الإقصائي لمزيد من التوصيف. المسوخ التي لم تكن في مجموعة تكامل نفس الاستفسارات اختبار المرشحة للجينات جديدة وتتميز مزيد من المعلومات البيولوجية والأدوات التجريبية. انتعاش متغير بدرجة كبيرة من ts- الأليلات إلى مجموعات مختلفة تكامل ظاهرة التي تعرف جيدا هو، وتقلب أكبر بشكل ملحوظ من الضوضاء بواسون، وذلك بسبب تقلب جوهري كبير من التحولية لts- بين جينات مختلفة. يسبب يمكن أن تشمل الاختلافات الجوهرية thermolability. أحجام البروتين مختلفة؛ وجود البروتين ومونومر مقابل كما كبيرة، استقر المجمع. والبقع الساخنة تسبب الطفرات الوراثية. هذا هو تقريبا nuisa النقيالامتحانات التنافسية الوطنية. ومع ذلك، وينتج نتيجة إيجابية هي أن &quot;المسافر الدائم&quot; القائمة ليست طويلة (مع فقط بضعة أهداف الاحتلال أكثر من القائمة)، وبالتالي فإن اختبار تكامل كثيفة العمالة ليست مهمة ضخمة حتى مراحل لاحقة من المشروع. كما اتباع نهج متكامل، أجرينا فحص الربط. في هذا الاختبار، يتم اختيار السلالات المقاومة للازدواجية ويتم اختبارها لالنمط الظاهري ts-. ومن المتوقع النمط الظاهري ts- (ولاحظ) عن المسوخ في مجموعة تكامل نفس الاستعلام أو طفرات مرتبطة بإحكام. لكل من الجينات اختبار، ومن المتوقع أن تظهر (TS + النمط الظاهري) في احتمال معينة اعتمادا على المسافة الوراثية ذرية WT. ونحن نقدر أن هناك حوالي 100 zygospores لكل التزاوج في هذه البقع. على افتراض 100٪ كفاءة الانتصافي، وهذا سوف يؤدي إلى ذرية مقاومة للالمزدوج المخدرات حوالي 100 من أشرطة مقاومة العقاقير غير المرتبطة (25٪ من ذرية الانتصافي، أربعة في الانقسام الاختزالي، بسبب Mالميراث endelian). وهذا من شأنه أيضا أن تكون الحال بالنسبة ts- الطفرات، حيث 25٪ من السلالات ستكون مزدوجة متحولة، وسوف يكون 25٪ WT إذا كان الاستعلام واختبار الطفرات غير المرتبطة. لذلك، من ذرية-مقاومة مزدوجة من المخدرات، و25٪ يكون وزن (حوالي 25 خلية). هذا هو الحال بالنسبة لطفرات غير المرتبطة تماما. ومع ذلك، الربط المعتدل (داخل ~ 20 سم، حوالي 2 ميغابايت، أو 2٪ من الجينوم 115) سوف يقلل بشدة أو القضاء على الخبر + إشارة. في حالة الربط بين الطفرة اختبار لالكاسيت المضادات الحيوية، واتس + haploids التي هي مزدوجة المقاوم للعقاقير موجودة في كميات منخفضة جدا. هذا يظهر كما فشل واضح لإعادة تجميع مع كل المسوخ اختبارها، وعلى الرغم من استكمال جميع المسوخ اختبارها، وهي نتيجة الشاذة أن يلاحظ بسهولة. في مثل هذه الحالات، سوف backcrossing يحل المشكلة. كلا من المعرفة المسبقة ومن تحليل تسلسل، فإننا نتوقع الجينات دورة الخلية في كلاميدوموناس الى نحو 500 جين 2، على الرغم من موشارع، ولكن ربما ليس كل شيء، ضرورية. سنقيم ضرورة لجولات الطفرات إضافية كما يتم جمع المزيد من المسوخ ومستوى ارتفاع التشبع. تم تصميم هذا الإجراء بشكل فريد لدراسة العمليات البيولوجية الأساسية والجينات والبروتينات التي تحمل بها. منهجيات أخرى لتوليد اضطرابات في الجينات الأساسية موجودة (على سبيل المثال، والتحول من الأليلات mutagenized عشوائيا 16، الأليلات كتب مشروط 17، أو الأليلات hypomorphic 18). ومع ذلك، فإنها كلها تتطلب إعادة التركيب مثلي، التي قمعت بقوة في الخضري كلاميدوموناس. متفاوت المسافات، interspaced بانتظام تكرار المتناوب قصيرة (كريسبر) / تم تأسيس نظام Cas9 كأداة قوية لتعديل الجينات 19. ومع ذلك، فإنه حتى الآن للعمل بكفاءة في كلاميدوموناس 20. الأهم من ذلك، كل من هذه الأساليب تتطلب معرفة مسبقة من الهدف. هذا هو تقييد شديدإذا كان أحد يرغب في أن تتاح الفرصة لتعلم شيء جديد! ونهجنا تسفر عن الطفرات تحديد الجينات الأساسية، مستقلة عن أي معرفة مسبقة. لذلك، على المستوى الحالي للتكنولوجيا، قد يكون عزل الطفرات العشوائية نهاية الخبر تليها تحديد الجينات التي كتبها تسلسل عميق الطريقة الأكثر فعالية لكسب الدخول السريع في بيولوجيا الخلايا الميكروبية في superkingdom النبات. تحديد الطفرات المسببة (من بين 100 ~ الترميز تسلسل تغيير الطفرات في كل استنساخ) هو خارج نطاق هذه الورقة. تسلسل عميق حمامات المعزول متضخم 1 فعالا لكنه يحتاج إلى عمالة كثيفة. استراتيجية تجمع اندماجي لتحديد جميع الطفرات في عدد كبير من السلالات، وبعد تسلسل عدد قليل من برك، هو من حيث التكلفة وفعالة جدا والعمل. استراتيجية جديدة لاندماجي التسلسل المعزول متضخم قيد التطوير التي من شأنها أن تسمح بتحديد الطفرات المسببة في العشرات من المسوخ سيمultaneously في تشغيل تسلسل واحد (قيد الإعداد). هذه الكفاءات هي مهمة جدا للسماح للخطوة تحديد الجينات الهامة لمواكبة التراكم السريع جدا من المسوخ التي أصبحت ممكنة بفضل الإجراءات الموضحة هنا.

التوصيف المظهري من مجموعات متحولة منهجي من الكائنات النموذج هو نهج ثبت لتشريح تعقيد الخلوية. وفرداني وحيدة الخلية الخضراء الطحالب كلاميدوموناس reinhardtii يحتوي على مجموعة الجينات مثل النباتات، لكنها اختلفت من النباتات البرية قبل الازدواجية الجينوم متعددة في النسب نبات الأرض 2. من حيث المبدأ، وعدم الازدواجية الجينات ودورة الحياة أساسا فرداني يسهل إلى حد كبير النهج الوراثية الخسارة من وظيفة. ومع ذلك، واختلال الموجهة للجينات من الاهتمام يكاد يكون من المستحيل نظرا لعدم وجود كفاءة التكامل الجيني مثلي. مكتبة تعطل إقحامي عشوائية قيد الإنشاء، جنبا إلى جنب مع تحديد الموقع تعطلت، مما أسفر حتى الآن مجموعة العريض من 1،935 اضطرابات معين يمثل 1،562 الجينات 3. ومع ذلك، فإن هذا النهج (من المتوقع في عام لإنتاج طفرات فارغة) لا ينطبق على الجينات الأساسية. درجات الحرارة الحساسة (TS) الطفرات يمكن recovereد في الجينات الأساسية، والطرق الحديثة تسمح تحديد كفاءة من هذا الجين المتحور والآفة المسببة. تحليل المظهري في درجة حرارة عالية ثم يقدم معلومات فورية حول وظيفة الجين المتحور. وذكرت لنا على عزل وتوصيف الطفرات المميتة TS في ~ 70 جينات أساسية في كلاميدوموناس، مع التركيز بصفة خاصة على الجينات المسؤولة عن تقدم دورة الخلية والسيطرة على 1،4. وكانت شاشات المميتة نهاية الخبر الدعامة الأساسية للتحليل الجيني في الكائنات الحية الدقيقة لعقود 5،6. من حيث المبدأ، وهذه سمة مرغوب فيه هو نهج &quot;التشبع&quot;، وهذا يعني أن كل الجينات قادرة على التحور إلى تضمنته الفتك يتم تحديدها من قبل متحولة واحد على الأقل، مما يسمح للتحليل كامل. ومع ذلك، في الواقع، هناك عدة عوامل تحد من نهج إلى التشبع. أولا، في حين أن جميع الجينات تقريبا يمكن أن تحور إلى فقدان النشاط في درجة حرارة عالية، وكفاءة استرداد هذه المسوخ تختلف باختلاف ما لا يقل عنأمر من حجم 7،8. لذلك، تبدأ شاشة عشوائية لالتقاط الزيارات المتكررة في &quot;المسافرين الدائمين&quot; قبل فترة طويلة واقترب التشبع. ثانيا، في حين نهاية الخبر الطفرات عادة ما تؤدي إلى الحد من وظيفة، فإنها قد لا تكون بلا قيم حقيقية في درجة حرارة المقيدة (وعلى العكس، هي في كثير من الأحيان لا تعمل بكامل طاقتها في درجة الحرارة المسموح بها). يمكن التعامل مع هذه المشكلة إلى حد ما مقارنة الأليلات متعددة؛ إذا كانت كل مشاركة النمط الظاهري مشترك، وهذا هو الأرجح أن تعكس نتيجة لتعطيل بسيط من الجين. الأليلات متعددة قد تكون مفيدة أيضا للغاية لتحديد الجزيئي نهائي الآفة المسببة 1. ومع ذلك، فإن &quot;المسافر الدائم&quot; المشكلة يعني أن الأليلات متعددة في الجينات نادرا ما تصيب يمكن أن يكون من الصعب التعافي. لهذه الأسباب، لقد تم تطوير خط أنابيب معززة لعزل وتوصيف المسوخ نهاية الخبر ظاهريا. لقد جمعنا أكثر من 3،000 نهاية الخبر المسوخ حتى الآن، طالتسبب حوالي 200 الطفرات دورة الخلية مرشح جديدة. التحليل الجزيئي والمظهرية لهذه المجموعة، والتي من المرجح بالفعل تشمل الطفرات في معظم أو جميع مسارات الخلية الأساسية، ينبغي أن تقدم رؤى ونظريات جديدة في علم الأحياء الخلية النباتية. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الخط إلى أي الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو على أجار لبناء بكفاءة نهاية الخبر مجموعات متحولة. مذكرة بشأن المعدات: اثنين من الروبوتات هي مهمة جدا لتحقيق الكفاءة في هذا الإجراء (منقار مستعمرة ومجموعة متماثلة منقار بلاتر / الكرز). جامعي وعادة ما يكون المسامير المعدنية. وتعقد المستعمرات التقطت في الهواء على هذه المسامير لفترة (ثواني إلى دقائق، اعتمادا على نموذج). يموت كلاميدوموناس في حوالي 20 ثانية على مسمار معدني في الهواء. هذا يقيد اختيار نموذج للكائن. المسائل دقة. لدينا منقار مستعمرة دقيقة إلى حد معقول. ومع ذلك، فمن عنيفة بعض الشيء في عملها وبعض إمكانية لانتقال التلوث القائم على الرش. لم يتم استخدامه على ارتفاعإيه من 384 الكثافة (4.5 ملم تباعد مركز الوسط)؛ في هذه الكثافة، ودقة مقبولة تماما. واختيار الروبوت الطلاء طبق الأصل / الكرز (التجهيزات المختلفة المستخدمة لهذه التطبيقات) أبطأ بكثير في قطف، ولكن ليس دقيقا بما فيه الكفاية لكثافة 1536 (6144 يشكل تحديا، وحتى بالنسبة لهذا الروبوت دقيقة للغاية، ونحن قمنا بتقييم هذه الكثافة ولكن لم يتم انتخاب لاستخدامه بسبب الصعوبات التي تواجهها مختلف). الروبوت سوف لا تعمل بشكل جيد إذا تم تحميلها لوحات بشكل غير متساو، وما إلى ذلك. ومن المهم أن بقعة تحقق للتأكد من أن الأمور في نصابها الصحيح تحدث. وبطبيعة الحال، سيتم تشغيل الروبوت غير المراقب وبشكل عام، كل سوف تسير على ما يرام إذا كانت لوحات القليلة الأولى الصحيحة.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hudson RapidPick colony picker</td><td>Hudson Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiDrop Combi Reagent Dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small tube metal tip cassette</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Singer RotoR replica-plating robot</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool</td></tr><tr><td>Singer single-colony picking attachment (&amp;lsquo;Stinger&amp;rsquo;)</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput robotically assisted isolation of temperature-sensitive lethal mutants in chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

وتبين لنا خط أنابيب المتسارع لعزل نهاية الخبر المسوخ في كلاميدوموناس. والاستغناء الخلايا على لوحات أجار، وبعد فترة وجيزة من التحقق من صحة سريع تحت المجهر لكثافة وحيدة الخلية، لوحات وللأشعة فوق البنفسجية المشع (الشكل 1). يتم تحديد المستعمرات المشع النموذجية واختار في شكل المحتشدة بعد 10 يوما من النمو في درجة الحرارة المسموح بها (الشكل 2). يتم دمج لوحات الناتجة في شكل 384 إلى 1536 مصفوفة (الشكل 3). من هذه الخطوات الأولى لجمع المستعمرات المشع، ونحن المحتشدة ~ 200000 المستعمرات حتى الآن. يتم ضبط كثافة تعليق على أساس جرعة الأشعة فوق البنفسجية المخطط بحيث، وهو ما يمثل الموت، 200 - 600 والمستعمرات الناجين تتشكل على لوحات. تم اختبار ثلاث مرات للأشعة فوق البنفسجية التعرض (1.5 دقيقة، 1 دقيقة، و 0.5 دقيقة)، وثلاثة الكثافة وفقا لذلك (جدول رقم 1). تجريبيا، أسفرت وقت التعرض 1.5 دقيقة أكثر من الخبر- المسوخ (~ 50٪)؛ ولكن، حتى الآن، أسفرت عن 1 دقيقة معظم المرشحين دورة الخلية. لذلك، تم القيام به في المستقبل جولات الأشعة فوق البنفسجية الطفرات مع 1 دقيقة فقط. أهم ما يشغل هو الرش أثناء قطف الأولي والتلوث (وخصوصا في صيغ عالية الكثافة). وهذا قد يؤدي إلى الازدواجية ومزيد من phenotyping من نفس متحولة مرتين. لتقليل احتمال لمثل هذا السيناريو، ورعاية لجمع المستعمرات في الحجم الأمثل، وتأكد من أن المستعمرات المجاورة لا التقطت في الفحص الأولي. بعد ذلك، تم تنفيذ اثنين متتابعة فحوصات النمط الظاهري ts- (الشكل 5)، وانعزل حوالي 3000 ts- المسوخ وتتميز ظاهريا بواسطة المجهر مرور الزمن (الشكل 8). بسبب التركيز البيولوجي في دراسة دورة الخلية من الفائدة في الظواهر التي تفي بمعايير معينة، نحن لسنا مهتمين بجمع أكثر من اثنين الأليلات في كل هدف جنراله. لذا، أجرينا تكامل واختبار الربط مع الجينات تتميز بالفعل مع أكثر من أليلين (سؤال) ضد المرشحين جمعت حديثا لإزالة الجينات المتكررة للغاية من أنابيب المصب (الشكل 9). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig1.jpg" /> الشكل 1: شكل انتشار خلايا Unmutagenized والأشعة فوق البنفسجية الطفرات. (أ) الاستغناء عن 384 × 2 قطرات ميكرولتر على لوحة أجار باستخدام موزع كاشف. (ب) ويتم اختبار لوحات عشوائية تحت المجهر للتحقق من كثافة وحيدة الخلية وتكون الأشعة فوق البنفسجية مع المشع التعرض 1 دقيقة. شريط النطاق = 50 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2"SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 54831 / 54831fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. المستعمرات-mutagenized الأشعة فوق البنفسجية اختار لصفائف 384. (أ) تزرع الخلايا وحيدة المشع للأشعة فوق البنفسجية ل~ 10 أيام إلى المستعمرات مرئية. شريط مقياس = 2 سم. (ب) يقر برنامج تحليل الصور مستعمرات للانفصال وفقا لمعايير معينة وآليا صالحة لهم في 384 لوحات. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig3.jpg" /> الرقم 3. دمج إلى مجموعة 1536. يتم دمج أربع لوحات 384 شكل لواحد 1536 لوحة. مرة واحدة نمت، يتم نسخ أنها مرة أخرى لاختبار والنمط الظاهري ts-. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض</a>نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig4.jpg" /> الرقم 4. التصوير لالكمي. وتعقد (أ) لوحات في إطار تحت موقفا وثيقة التصوير بحيث يتم تصويرها جميع لوحات في سلسلة في التكبير متطابقة وتحديد المواقع. (ب) الصورة الأولى هي لوحة microtiter 1536 جيدا مع نقاط حمراء وضعت في زوايا ونقاط المنتصف. هذه &quot;الشبكة لوحة&quot; صورة تحدد موقف مجموعة. (ج) مثال على مصفوفة 1536 بعد الحضانة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig5.jpg" /> الرقم 5. تحديد النمط الظاهري ts- من شبهتحليل الصور -automated. ويتم تحليل الصور لوحة العرف البرمجيات MATLAB (المنصوص عليها في SI). ومجزأة الصورة تلقائيا إلى صفوف الخلية (96، 384، أو 1536)، وكميا إشارة في كل خلية. يتم وضع علامة نمو في 21 درجة مئوية في الزرقاء، ويتم وضع علامة النمو عند 33 درجة مئوية في أصفر. المستعمرات واظهار نمو أعلى بكثير في 21 درجة مئوية مقارنة ب 33 درجة مئوية (موحدة لنهاية الخبر +) ويتم اختيار وتميز في المربعات السوداء مع نقطة خضراء. هذه الخيارات يمكن تحريرها يدويا. يتم نقل الاختيار النهائي لملف المستخدمة من قبل الروبوت قطف مستعمرة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig6.jpg" /> الشكل 6. انتقاء الروبوتية من أول جولة نهاية الخبر المرشحين القاتلة. الكرز-pickiنانوغرام الروبوت يتبع تعليمات من الملفات التي تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 2.1 لاختيار المرشحين لمجموعة جديدة. تظهر لوحة أعلى التحميل من دبوس معقم. تظهر لوحة أسفل قطف دقيقة من مستعمرة معينة في لوحة مصدر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig7.jpg" /> الرقم فحص 7. الوقت الفاصل بين الفرز الأولي من الظواهر الفتاكة TS. يتم نسخ النسخ التي مرت جولتين من بروتوكول فحص موضح في الشكل رقم 5 لوحات في كثافة الخلايا مثل الخلايا الفردية التي لا يمكن حلها مجهريا. ويستخدم الرباعيات تشريح المجهر تعديلها لتحديد المواقع التي تؤخذ photomicrographs بعد 0 ساعة و 10 ساعة، و 20 ساعة حضانات<html> ر 33 درجة مئوية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="شكل 8" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig8.jpg" /> الرقم 8: كلاميدوموناس المسوخ دورة الخلية التي تم تحديدها من قبل الوقت الفاصل بين المجهري. (أ) يصف رسم توضيحي لدورة الخلية فريدة كلاميدوموناس المرحلة G1 طويلة تميزت نمو الخلايا، تليها دورات SM الانشطار، الذي ينتهي مع تفريخ الخلايا الوليدة حديثي الولادة. (ب) وصور مجهرية تظهر خلايا WT خلال دورة الخلية وتحديد نموذجية المسوخ دورة الخلية التي تفشل في استكمال الانقسام. شريط النطاق = 50 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> والأنف والحنجرة &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/54831/54831fig9.jpg" /> الرقم 9: التكملة والربط اختبار. (أ) يعبروا مقاومة (على سبيل المثال، الرطوبة) الاستعلام المضادات الحيوية مع تحور الجين يتكرر كثيرا في لوحة 96-جيدا مع مجموعة من المسوخ من الآخر نوع التزاوج التي تأوي الكاسيت الثاني المضادات الحيوية المقاومة (على سبيل المثال، بارو). لوحات تكامل تسفر عن جزء كبير من diploids كما يتضح من تلطيخ النووي حامض والتحليل في التدفق الخلوي (اللوحة السفلى اليسرى في). (ب) يتم اختبار خليط التزاوج سواء بالنسبة للتكامل في diploids والربط في مقاومة المزدوج ذرية الانتصافي. السيطرة الإيجابية هي الاستعلام نفسه في المقابل نوع التزاوج، وكما هو متوقع، تبين النمط الظاهري ts- في 33 درجة مئوية، في حين أن السيطرة السلبية هي WT ويظهر في نهاية الخبر + النمط الظاهري. تظهر المستعمرات حلقت أي تكامل مع الاستعلام وبالتالي فهي نالأليلات ts- مصريات لجين الاستعلام. وتستبعد هذه عموما من مزيد من التوصيف، منذ فقط &quot;المسافرين الدائمين&quot; موجودة في مجموعة واختبار تكامل. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54831/54831fig9large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مرة </td><td> OD </td><td> اختار المستعمرات (#) </td><td> النمط الظاهري Ts- </td><td> المرشحين دورة الخلية </td></tr><tr><td> 1.5 &#39; </td><td> 0.012 </td><td> 6000 (متوسط ​​= ~ 200) </td><td> 200 (3.3٪) </td><td> 7 (3.5٪) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 1 &quot; </td><td rowspan="2"> 0.003 </td><td> 11000 </td><td rowspan="2"> 131 (1.19٪) </td><td rowspan="2"> 15 (11.4٪) </td></tr><tr><td> (متوسط ​​= ~ 360) </td></tr><tr> &lt;الدفتيريا روسبان = &quot;2&quot;&gt; 0.5 &quot; </td><td rowspan="2"> 6E-04 </td><td> 9000 </td><td rowspan="2"> 40 (0.45٪) </td><td rowspan="2"> 1 (2.5٪) </td></tr><tr><td> (متوسط ​​= ~ 300) </td></tr></tbody></table> الجدول 1: معايرة تشعيع تايمز لتعظيم العائد من دورة الخلية المرشحين متحولة. تم اختبار ثلاث مرات التشعيع (30 لوحات لكل منهما) مع المواد المستنفدة للأوزون المقابلة لضمان قيد الحياة أعداد مستعمرة (200-600).

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

عزل عالي الإنتاجية بمساعدة روبوتية للطفرات القاتلة الحساسة لدرجة الحرارة في Chlamydomonas Renhardtii | علم الوراثة | فيديو

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em&gt; كلاميدوموناس reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

high-throughput-robotically-assisted-isolation-temperature-sensitive

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Views.  The Rockefeller University. Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput. 

Video: High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

النهج الوراثية إلى الأمام في<em&gt; الكلاميديا ​​المتدثرة</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Immunology and Infection

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

طريقة استخراج متعددة Omics للتحليل المتعمق للثقافات المتزامنة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Developmental Biology

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

العلامة حذف الجينات من قبل Floxed كاسيت أليليتش تبادل Mutagenesis في الكلاميديا trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

العيش الخلية إلى الأمام النهج الجيني لتحديد وعزل المسوخ التنموية في الكلاميديا trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

التكامل الجيني المستقر في شلوريلا الشائع باستخدام Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

تسليط الضوء على المؤلف: بروتوكول التحول الأمثل لشلوريلا الشائع باستخدام Agrobacterium tumefaciens 

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ومنصة الروبوتية لإنتاجية عالية البروتوبلازم عزل والتحول

النهج الوراثية إلى الأمام في

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

طريقة استخراج متعددة Omics للتحليل المتعمق للثقافات المتزامنة من الألغا الأخضر Chlamydomonas reinhardtii

العلامة حذف الجينات من قبل Floxed كاسيت أليليتش تبادل Mutagenesis في الكلاميديا trachomatis

العيش الخلية إلى الأمام النهج الجيني لتحديد وعزل المسوخ التنموية في الكلاميديا trachomatis

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع

Agrobacterium tumefaciens- الهندسة الوراثية بوساطة الطحالب الدقيقة الخضراء ، شلوريلا الشائع