These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.

1. عزل C. صعب من مختلف المصادر البيئية أو السريرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العزلات البيئية: باستخدام مقياس القطن المعقم مسبقا (مبللة طفيفة مع 0.85٪ كلوريد الصوديوم)، مسحة سطح أي مجال من مجالات الاهتمام (الكلمة، الباب، مقبض، الرف، الخ ). 8 تأكد من ارتداء قفازات معقمة ووضع مسحة في أنبوب معقمة بعد الانتهاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العزلات السريرية (البراز): لوحة 10 إلى 100 ملغ من عينات البراز السريري على أجار السيفوكسيتين سيكلوسيرين - الفركتوز (كفا) باستخدام حلقة التلقيح واحتضان تحت ظروف اللاهوائية صارمة لمدة 48 - 72 ساعة. مخزن المستعمرات المعزولة من C. صعب الأسهم في كريوفيالز في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات. 7 ، 9 ، 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إثراء عينات مسحة البيئية في الدماغ ضخ القلب (بهي) مرق مع 0.05٪ توروشولات الصوديوم ومكان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئويةلمدة 5 أيام. الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في 10،000 x ج و ريسوسبيند بيليه في 100 ميكرولتر من الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا معلق (50 ميكرولتر) على سيكلوسيرينسيفوكسيتين أجار الفركتوز (كفا) لوحات واحتضان في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 40 - 48 ساعة. مخزن المستعمرات المعزولة من C. صعب الأسهم في كريوفيالز في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار يشتبه C. المستعمرات صعب باستخدام كاشف تراص اللاتكس أو ير. </li></ol> 2. زراعة C. صعب وقتل الإجراءات الحركية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو تنقيته البيئية أو السريرية C. السلالات صعب على لوحات أجار الدم في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ مستعمرة واحدة معزولة مع حلقة التلقيح، ونقله إلى 5 مل بهي المتوسطة في أنبوب 15 مل، وتنمو لمدة 24 ساعة في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع ما قبل الثقافات 1: 100 إلى ما يقرب من 10 6 وحدة تشكيل مستعمرة(كفو) / مل في الطازجة قبل تخفيض بهيس (بهي زائد 5 جرام / لتر استخراج الخميرة و 1٪ L- السيستين) تستكمل مع 0.1٪ توروشولات الصوديوم والتركيز المناسب للمضادات الحيوية (T0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينة 1 مل مع ماصة في كل نقطة زمنية (T0، T6، T24، T48) لوحة / انتشار قسامة صغيرة (100 ميكرولتر في التخفيفات المسلسل) على لوحة أجار الدم. السماح للخلايا تنمو على لوحة أجار الدم لمدة 48 ساعة في غرفة اللاهوائية عند 37 درجة مئوية، وعدد عدد الناتجة من المستعمرات لتحديد كفو. </li></ol> 3. إعداد عينات لمسح المجهر الإلكتروني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 1 مل من الخلايا من كل نقطة زمنية في أنابيب ميكروسنتريفوج وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي العينات في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة مرة أخرى وتجاهل طاف. إعادة تمييع الخلايا في 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 10،000 زغ وتجاهل طاف. غسل الخلايا مرتين مع الماء المقطر وإعادة تعيين في 100 ميكرولتر من الماء المقطر. ضبط حجم اعتمادا على تعكر الحل. ملاحظة: جعل التخفيفات التسلسلية متعددة هي فكرة جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية كوفرسليبس وإضافة 40 ميكرولتر من العينة على ذلك. احتضان لمدة 15 دقيقة في غطاء محرك السيارة لتدفق السائل والسماح للخلايا على التمسك ساترة. إذا كان السائل لا يزال موجودا، استخدم منفاخ لإزالة السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان كوفرسليبس المسمى مع الخلايا في آلة الاخرق مكتب وشريط أسفل. تأمين الذهب الخالص في آلة الاخرق. بدوره على الجهاز والبدء الاخرق في الضغط المنخفض (50 متور). خلايا معطف لمدة 30 ثانية في 80 مللي أمبير، والذي يترجم إلى 20 نانومتر من طلاء الذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا المغلفة إلى المجهر الإلكتروني الماسح الضوئي. </li></ol> 4. التصوير C. صعب الخلايا على المجهر الإلكتروني المسح الضوئي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيس المجهر الإلكتروني الماسح (سيم) بشكل صحيح من قبل العلاقات العامةإسينغ زر تنفيس على برامج الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الشريط الكربون، وتأمين كوفرسليبس المغلفة على المرحلة المعدنية. بمجرد تنفيس سيم، يجب فتح الباب بسهولة. قفل المرحلة المعدنية في غرفة سيم عن طريق شد عليه في. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق الزر بومب في برنامج الكمبيوتر. سوف سيم تكون صالحة للاستخدام عندما يقرأ النظام &quot;فاك موافق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على كاشف سي تحت علامة التبويب كاشفات. بدوره على شعاع من خلال النقر على الزر الذي يعرض الجهد. بدء التصوير في الجهد المنخفض (5 كيلو فولت) قبل زيادة الجهد (تصل إلى 15 كيلو فولت). ستظهر صورة بعد تشغيل الحزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام وظيفة تتبع، والعثور على منطقة على كوفرسليبس المغلفة إلى الصورة. التكبير في المنطقة والعثور على هياكل على شكل قضيب. هذه هي كلوستريديوم صعب . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكبير والتركيز على الصورة لمعايرة النظام. وينبغي أن يتم ذلك على مسافات عمل متعددة: 15 و 9 و 5 مم. صورة على مسافة عمل 5 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قم بتشغيل uلترا عالية الدقة وضع التصوير والبدء في التركيز وتحسين الاستجماتيزم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التركيز في التكبير عالية. استخدام التركيز الخشنة وغرامة تبديل لهذا الغرض. ضبط الاستجماتيزم وكذلك للحصول على صورة أوضح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الاستجماتيزم في التكبير عالية. للقيام بذلك، وضبط الصيغ الاستجماتيزم (أنها تبدو مشابهة للتبديل التركيز غرامة / الخشنة) والتحقق من الصورة عن وضوح عن طريق التكبير رقميا على برامج الكمبيوتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سي وظيفة المسح البطيء لجمع صورة ذات جودة عالية. حفظ الصورة التي تم جمعها كملف .TIFF، والتي سيتم استخدامها للتحليل. تأكد من تحديد شريط البيانات إذا تم إجراء القياسات أثناء التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور في زوايا مختلفة (تصل إلى 52 درجة عن طريق تحويل زاوية مباشرة على سيم.الزاوية الصور تميل إلى الكشف عن مزيد من المعلومات العمق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير شعاع الجهد اعتمادا على الخلايا التي يتم تصويرها. الحفاظ على هذا في الغالب بين 5-15 كيلوفولت لجميع التجارب. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال التصوير، قم بإيقاف تشغيل الحزمة ورفع مسافة العمل إلى 20 مم. ويمكن بعد ذلك تنفيس الغرفة ويمكن إزالة المرحلة. نسخ جميع الصور على محرك الأقراص لمزيد من التحليل. </li></ol> 5. معالجة الصور وتحليلها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل وتثبيت البرمجيات المتاحة بحرية، فيجي (http://fiji.sc)، على جهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افتح ملف الصورة في فيجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام وظيفة الخط، تتبع بدقة شريط مقياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر فوق علامة التبويب تحليل في برنامج فيجي وأخيرا حدد وظيفة تحديد مقياس. ستظهر نافذة ستتطلب تحديد المسافة المعروفة استنادا إلى شريط المقياس. تغيير وحدة طول وكذلك انقر فوق موافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن بعد أن يتم معايرة البرنامج لمسافة، استخدم وظيفة خط لقياس طول الخلية. للحصول على طول، استخدم الدالة خط لتتبع الخلية في مجملها. حدد علامة التبويب تحليل مرة أخرى ثم انقر على قياس. يجب طول التطبيقالأذن في الوحدات المشار إليها سابقا. </li></ol>

<ol>
	<li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States.">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li><li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ridinilazole:+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection.">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li><li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance.">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li><li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development.">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li><li>Bass&#232;res, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+(SMT19969),+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection.">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile.">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production,+Immune+Response,+and+Morphological+Changes.">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li><li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs.">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li><li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+Endemic+Setting,+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent.">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li><li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+(SMT19969),+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection.">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li><li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapse+of+antibiotic+associated+colitis:+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy.">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li><li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination,+outgrowth+and+recovery.">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li><li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+a+review+of+current+and+emerging+therapies.">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li><li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidemic,+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile.">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li></ol>

KWG has received past and current research support from Merck &amp; Co. and Summit, PLC.

وكان الهدف من الدراسة الحالية لخلق طريقة عالية الإنتاجية لعزل C. صعب واختبار الحساسية للمضادات الحيوية باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم) كوسيلة لتوصيف أكثر دقة من العمل الدوائي للمضادات الحيوية. باستخدام البروتوكولات المبينة هنا، أثبتنا أن التصوير استجاب...

كلوستريديوم ديفيسيل عبارة عن جرثومية إيجابية تشكل البكتريا التي تسبب الجراثيم، مما تسبب في حوالي 500،000 إصابة سنويا في الولايات المتحدة، ويعتبر هذا المرض ممرضا عاجلا على مستوى التهديد من قبل مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها، وهو أعلى مستوى من المخاطر. 1 شهد العقد الماضي تطورا كبيرا في العقاقير المضادة للميكروبات مع النشاط ضد C. صعب . 2 ، 3 في المختبر الدراسات هي عنصر ضروري من عملية تطوير المخدرات. 4 تقليديا، في المختبر وقابلية الوقت وقتل الدراسات تستخدم للتحقق من صحة الحيوان في المستقبل وغيرها من الدراسات في الجسم الحي . في حين أن هذه الأساليب تخدم دورا هاما لتقييم عمل القتل، فإنها لا تعبر عن استجابة الخلايا الظاهرية للعلاج الدوائي. من خلال دمج المسح المجهري الإلكتروني (سيم) مع القياسيهد قتل الدراسات الحركية، توصيف أكثر دقة من المضادات الحيوية الآثار المباشرة هو ممكن. 5 ، 6 ، 7 هنا، نقدم طريقة حيث سيم يستخدم كوسيلة للتعرف على فعالية العلاج بالمضادات الحيوية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>cotton gauze&#160;</td>
			<td>Caring</td>
			<td>PRM21408C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Macron</td>
			<td>7532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium taurocholate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anaerobic chamber</td>
			<td>Coy</td>
			<td></td>
			<td>vinyl anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates</td>
			<td>Anaerobe systems</td>
			<td>AS-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood agar plates</td>
			<td>Hardy diagnostics</td>
			<td>A-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex agglutination reagent</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>DR1107A</td>
			<td>C. diff test kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>222363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-259-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>J. Melvin freed brand</td>
			<td>7525M</td>
			<td>75x25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Class II type A2&#160;</td>
			<td>biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desk sputtering machine</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>Desk II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>Plastic Core</td>
			<td>05072-AB</td>
			<td>SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gold</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>TAR001-0158</td>
			<td>2.375&#8221; Diameter x .002&#8221; Thick Gold foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanning electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>XL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol to characterize the morphological changes of clostridium difficile in response to antibiotic treatment

تقييم عمل المضادات الحيوية مع تطوير العقاقير الجديدة الموجهة نحو البكتيريا اللاهوائية أمر صعب ومطالب من الناحية الفنية. للحصول على نظرة ثاقبة وزارة الزراعة ممكن، والتغيرات المورفولوجية المرتبطة التعرض للمضادات الحيوية يمكن تصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسح (سيم). دمج التصوير سيم مع منحنيات قتل التقليدية قد تحسن رؤيتنا في العمل المخدرات والمضي قدما في عملية تطوير المخدرات. لاختبار هذه الفرضية، وقتل منحنيات ودراسات سيم أجريت باستخدام المخدرات مع وزارة الزراعة المعروفة ولكن مختلفة (فانكومايسين وميترونيدازول). خلايا C. صعب (R20291) نمت مع أو بدون وجود المضادات الحيوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. على مدى فترة 48 ساعة، تم جمع الخلايا في نقاط زمنية متعددة لتحديد فعالية المضادات الحيوية والتصوير على سيم. وتمشيا مع التقارير السابقة، كان فانكومايسين وميترونيدازول نشاطا كبيرا للجراثيم بعد 24 ساعة من العلاج على النحو الذي تقاسه وحدة تشكيل مستعمرة (كفو) كونتينغ. باستخدام التصوير سيم، وجدنا أن ميترونيدازول له آثار كبيرة على طول الخلية (&gt; 50٪ تخفيض في طول الخلية لكل المضادات الحيوية؛ P &lt;0.05) مقارنة مع الضوابط والفانكومايسين. في حين لم يتم توثيق الاستجابة المظهري للعلاج من تعاطي المخدرات سابقا بهذه الطريقة، فإنها تتفق مع وزارة الزراعة المخدرات التي تبين تنوع وموثوقية التصوير والقياسات وتطبيق هذه التقنية للمركبات التجريبية الأخرى.

كلوستريديوم ديفيسيل هو بكتيريا تشكيل بوغ وبالتالي فمن الضروري تحديد الاختلافات التشكل بين الخضري وخلايا بوغ قبل أي تحليل وظيفي. الشكل 1 يوضح الصور التمثيلية للخلايا الخضرية التي تم التقاطها خلال المرحلة الأسية من منحنى النمو وخ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment at JoVE.com

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em&gt; كلوستريديوم ديفيسيل</em&gt; في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

8.9K Views.  University of Houston College of Pharmacy. Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Video: A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

زراعة وصيانة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; في بيئة لاهوائية

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

المواد الجزيئية الحيوية لوصف التفاعلات البكتيريا في استضافة

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

This protocol outlines the cefoperazone mouse model of Clostridium difficile infection (CDI) using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Emphasis on clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol.

المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; سلالة R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

This study involves methods to reveal effects on a model fish host following alteration of the skin and gut microbiome communities&#160;composition by an antibiotic.

دراسة الظواهر المضيف في<em&gt; affinis الجمبوزيا</em&gt; وبعد المضادات الحيوية العلاج

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...