We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.

ملاحظة: كما السل م مولودية 2 6206 هو سلالة الفوعة 17، 18، كل عمل في هذا البروتوكول لا يمكن أن يؤديها في 2 مرفق السلامة الأحيائية مستوى (BSL-2). 1. شروط الثقافة عن البروتين الفلوري الأخضر تعرب عن السل م مولودية 2 6206 (المتفطرات السلية -GFP) ملاحظة: م. السل H37Rv المستمدة عوني التغذي سلالة مولودية 2 6206 (Δ panCD، Δ leuCD) تحولت مع استخدام GFP معربا عن البلازميد pMN437 طوال هذا البروتوكول 16. كان من الممكن أن تحل محل سلالة المتفطرة السلية -GFP مع عدم GFP يعبرون عن نوع السلالة البرية لتمكين تسهيل عملية التواصل من سلالة للباحثين. ومع ذلك، التعبير GFP أمر مرغوب فيه لتمكين تأكيدا البصرية البلعمة وتشكيل المتفطرات السلية المجاميع / البلاعم. لخط الطولز التخزين على المدى، جمدت المتفطرات السلية -GFP في -80 درجة مئوية في 7H9 وسائل الإعلام كاملة (كما هو موضح في الخطوة 1.1) تستكمل مع 20٪ الجلسرين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كامل وسائل الإعلام المتفطرات السلية -GFP (7H9-C) من خلال استكمال 7H9 المتوسطة مع 10٪ ميدلبروك OADC، 0.02٪ تيلوكسابول، 24 ميكروغرام / مل مد البانتوثنيك حامض، 50 ميكروغرام / مل L-ليسين و 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قارورة واحدة من المتفطرات السلية -GFP وإضافة إلى 10 مل من 7H9-C في 30 مل قارورة مربع PETG أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية على شاكر دوارة (50 دورة في الدقيقة). أخذ قياسات الكثافة الضوئية (OD 600) كل بضعة أيام حتى OD 600 يصل إلى 1.0 (حوالي 5-8 أيام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع والثقافة مرور حسب الحاجة للحفاظ على OD 600 بين 0،2-1،0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للعدوى، استخدم ثقافة راسخة من المتفطرات السلية -GFP في مرحلة النمو لوغاريتمي (OD 600 من 0،6-1). لتجنب الثقافات ملتف، يصوتن الثقافة قارورة المتفطرات السلية في حمام مائي (130 واط؛ 3 × 5 ق البقول) انسه أو مرتين في الأسبوع </li></ol> 2. شروط الثقافة ل THP-1 خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كامل THP-1 خلية الإعلام (RPMI-C) من خلال استكمال RPMI 1640 المتوسطة مع 10٪ للحرارة المعطل مصل الجنين البقري، 2 مم L-الجلوتامين، و 10 ملي HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في قارورة T-75 عند 37 درجة مئوية في جو مرطب من 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو التدفق الخلوي كل يوم والحفاظ على THP-1 الخلايا في مناطق ذات كثافة بين ،1-0٬600٬000 لكل مليلتر. </li></ol> 3. بروتوكول العدوى لتوليد هياكل MTB / بلعم الركام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP-1 إعداد الخلية (في لوحة 96-جيدا) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 7 × 10 6 THP-1 الخلايا في 250 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في 7 مل RPMI-C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواضيع المتميزة -GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي 2.8 × 10 8 المتفطرات السلية -GFP في 3200 x ج لمدة 5 دقائق في جهاز للطرد المركزي يتأرجح دلو شالغناء تحويل OD 600 1.0 = 3 × 10 8 بكتيريا / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع RPMI-C وأجهزة الطرد المركزي كما في الخطوة 3.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في 7 مل RPMI-C ودوامة لمدة 10 ثانية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدوى ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لقالب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة 96-جيدا من خلال إضافة 200 ميليلتر من الماء المعقم في صفوف ألف وحاء والأعمدة 1 و 12 لحافة الماء لمنع التبخر من مستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر RPMI-C إلى العمود 2 (B2 إلى G2) لمراقبة الخلفية (فارغة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصيب، إضافة المتفطرات السلية -GFP تعليق (الخطوة 3.2) إلى THP-1 تعليق خلية (الخطوة 3.1) وتخلط جيدا من قبل pipetting. النهائي THP-1 كثافة الخلية 5 × 10 5 لكل مليلتر وتعدد المقابلة من الإصابة هو 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب THP-1 / المتفطرات السلية -GFP تعليق في خزان 25 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من THP-1 / المتفطرات السلية -GFP تعليق على كل 96-الآبار المتبقية (B3 من خلال G11) النقيبالجا متعدد القنوات ماصة. ملاحظة: إذا كان يعمل مع لوحات متعددة 96-جيدا، و resuspend بانتظام THP-1 / المتفطرات السلية تعليق المتبقية في الخزان لضمان يضاف خليط حتى إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 7-10 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2 عن طريق إزالة ببطء 100 ميكرولتر قضى وسائل الإعلام من أعلى كل بئر وبلطف بإضافة 100 ميكرولتر قبل تحسنت RPMI-C باستخدام الماصة متعدد القنوات. لا و resuspend الآبار وتعكير صفو المجاميع MTB / بلعم على الجزء السفلي من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص البصر الآبار بواسطة المجهر مضان (الهدف 4-10X) يوميا، مع الأخذ علما حجم المتفطرات السلية المجاميع / البلاعم. بعد يوم 10/7، وينبغي أن يكون المتفطرات السلية المجاميع / بلعم كبير بما فيه الكفاية (انظر الشكل 2 للمرجعية) على المضي قدما لاختبار نجاعة الأدوية (القسم 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، التقاط الصور من الآبار 96 باستخدام نظام آلي التصوير الخلية مجهزةمع حقل مشرق ومرشح GFP يحدد لتوثيق MTB / بلعم تشكيل الكلي. ملاحظة: إذا لم يكن لدى المستخدمين الوصول إلى نظام التصوير الآلي، صور الآبار التمثيلية التي يمكن اتخاذها باستخدام أي المجهر المناسب مع GFP ومشرق الميدان القدرات. </li></ol></li></ol> 4. إعاقة النمو الفحص لتقييم الأدوية فعالية ضد المتفطرة السلية مشتقة من المتفطرات السلية / بلعم المجاميع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المخدرات (شروط ثلاث نسخ للعقارين) ملاحظة: انظر الشكل 1A للقالب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة 96-جيدا منفصلة، ​​إضافة 125 ميكرولتر من وسائل الإعلام 7H9-C إلى B2 من خلال لG10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عقارين في ضعف أعلى تركيز النهائي المطلوب في 1 مل من 7H9-C لحساب التخفيف في الخطوة 4.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من كل دواء لآبار B11-C11-D11 و E11-F11-G11، على التوالي للعلاج ثلاث نسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة متعدد القنوات، ديل متسلسليوت المخدرات اختبار شقين عن طريق نقل 125 ميكرولتر من B11-G11 إلى B10-G10. مزيج من قبل pipetting 5 مرات في كل خطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة التحرك 125 ميكرولتر من عمود إلى عمود (من اليمين إلى اليسار) عبر لوحة، ووقف بعد العمود 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خلط العمود 4، ونبذ 125 ميكرولتر في حاوية النفايات. الأعمدة 2 و 3، أن لا يحتوي على أية عقاقير للسماح للاستخدام كخلفية (فارغة) والضوابط نمو إيجابية. ملاحظة: بدلا من ذلك، اتبع القالب في الشكل 1B للمكتبات اختبار المخدرات. كل لوحة 96-جيدا يمكن أن تستوعب 58 المخدرات بتركيز واحد. إعداد هذا الطبق المخدرات باستخدام ضعف التركيز النهائي المطلوب لأنها سوف تضعف في نصف في الخطوة 4.2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج من الإدمان: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد لوحة 96 كذلك يحتوي على المتفطرات السلية -infected الضامة (المجاميع MTB / بلعم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية صب جميع الآبار ذات الصلة (B2 من خلال G11) مع الماصة متعدد القنوات.تنفيذ هذا بطريقة خطوتين: أولا إزالة 150 ميكرولتر من دون إمالة لوحة، ثم قم بإزالة وسائل الاعلام المتبقية (~ 50 ميكرولتر) عن طريق إمالة لوحة وإدخال طرف ماصة إلى الحافة السفلى من البئر. كما MTB / بلعم المجاميع هي ملتصقة إلى قاع البئر، يجب أن تضيع أي مادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 100 ميكرولتر من 7H9-C وسائل الإعلام لجميع الآبار ذات الصلة (B2 من خلال G11) من لوحة تحتوي على مجاميع / بلعم المتفطرات السلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الماصة متعدد القنوات، ونقل 100 ميكرولتر من المخدرات التي تحتوي على 96-جيدا لوحة (الخطوة 4.1) إلى الآبار المقابلة من لوحة العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان في كيس مختوم واحتضان لمدة 3 أيام في 37 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 5. الكمي من فعالية الدواء باستخدام الفحص ريسازورين عيار مكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ريسازورين حل السهم عند تركيز النهائي من 0.8 ملغ / مل في H 2 O. تصفية من خلال 0.22 ميكرون مسام الغشاء حجم PVDF للتعقيم.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ريسازورين العمل الحل عن طريق خلط ريسازورين حل الأوراق المالية، H 2 O وتوين-80 (حل 20٪ في H 2 O) في نسبة 2: 1: 1. تركيزات النهائية هي 0.4 ملغ / مل ريسازورين و 5٪ توين-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قارئ لوحة، وإعداد برنامج لقراءة مضان في 530 نانومتر الإثارة و 590 نانومتر انبعاث كل 30 دقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. قبل دافئ لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من محلول العمل ريسازورين لجميع الآبار ذات الصلة (B2 من خلال G11) من لوحة المخدرات المعالجة (الخطوة 4.11) باستخدام الماصة متعدد القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على قارئ لوحة وبدء البرنامج بإعدادها في الخطوة 5.3. ملاحظة: لتسهيل معالجة كميات كبيرة من لوحات الفحص، فإنه يكفي لتطوير فحص في الحاضنة 37 درجة مئوية وأداء مضان واحد يقرأ كل 24 ساعة. هذا ينطبق أيضا على المستخدمين الذين لا يستطيعون الوصول إلى قارئ لوحة مع القدرات الحركية والحضانة. </li></ol>

<ol>
	<li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery.">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li><li>Bass, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention.">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li><li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis.">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li><li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMC207+becomes+bedaquiline,+a+new+anti-TB+drug.">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li><li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery.">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li><li>Evangelopoulos, D., Fonseca, d. a., D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy:+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them.">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li><li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+back+to+the+future:+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis.">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li><li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2'+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors.">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645 (2009).</li><li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis,+and+the+impact+of+P-glycoprotein.">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li><li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput/high-content+screening.">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114 (2014).</li><li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages.">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li><li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis.">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li><li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin?.">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?.</a> Front Microbiol. 6, 1117 (2015).</li><li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment?.">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?.</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li><li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children.">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li><li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis.">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li><li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs.">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li><li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li><li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection.">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li><li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium.">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li><li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs.">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، التي وصفناها في التفاصيل بديلا المتفطرات السلية نموذج العدوى مناسبة لاختبار فعالية الدواء. يأخذ هذا النموذج في الاعتبار اثنين من العوامل الرئيسية التي ينبغي إيلاء المزيد من الاهتمام خلال عملية التنمية السل المخدرات في وقت مبكر: وجود الحواجز ذات الصلة من ا...

<html> السل (TB) لا يزال يشكل تهديدا الصحة العالمية خطيرا على الرغم من توفر نظم العلاج الكيميائي لمكافحة السل لأكثر من 40 سنوات 1. وهذا يرجع جزئيا إلى شرط لفترات علاج طويلة لأكثر من 6 أشهر باستخدام مزيج من الادوية متعددة، الأمر الذي يؤدي إلى المريض عدم الامتثال 2 هذا. وظهور السل المقاوم للأدوية في السنوات الأخيرة من تعقيد المشاكل في الميدان حيث التنمية الناجحة من الأدوية المعتمدة سريريا هي شبه معدومة 3. في الواقع، على الرغم من تطوير الأدوية المضادة للسل شاملة، كان فقط دواء واحد وافقت ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام السريري في السنوات ال 40 الماضية (4). وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى الأجيال الجديدة من الأدوية المضادة للسل لمعالجة هذه المشكلة. المشكلة الرئيسية في اكتشاف السل المخدرات هي عدم وجود النقل الناجح من مركبات مع في المختبر النشاط إلى فعالية في الإعداد السريرية= &quot;XREF&quot;&gt; 5، 6، 7. في البداية، تم استخدام النهج الهدف استنادا للكشف عن مكافحة المخدرات المتفطرات السلية 5، الذي فشل في ترجمتها إلى الخلايا البكتيرية بأكملها. حتى عندما يتم استخدام خلايا المتفطرة السلية، وغالبا ما يتم تنفيذ ذلك باستخدام مرق نمت الثقافات، التي لا التنبؤ بدقة فعالية الدواء في الجسم الحي 8 و 9. وقد تم التعرف على هذه المشاكل وتم المقايسات فحص المخدرات ضد الضامة التي تحتوي على المتفطرات السلية أو الكامنة المتفطرات السلية أنشأت بنجاح 8، 10، 11، 12. ولكن، حتى هذه المقايسات أكثر تقدما لا تعطي الاعتبار الكافي للحواجز الاختراق التي تواجهها المخدرات في الآفات الرئوية غير أوعية دموية، وفي بؤر نخرية في موقع الإصابة. في الواقع، حتى للخط الأول السل ريفامبيسين المخدرات، وقد تم استجواب الجرعات دون المستوى الأمثل نظرا لعدم كفاية في أنسجة الجسم الحي والدماغية السائل الشوكي (CSF) اختراق 13، 14، 15 وكذلك انخفاض كفاءة الخلايا ضد المتفطرة السلية 8 و 9. على هذا النحو، ونماذج وفحوصات جديدة من شأنها أن تأخذ بعين الاعتبار هذه المعلمات أثناء عملية التنمية الرصاص في وقت مبكر من شأنه أن يحسن بلا شك السل جهود اكتشاف المخدرات. لتلبية هذه الحاجة، أنشأنا مؤخرا-2 BSL متوافق نموذج العدوى بديل غير مكلف وسريع، والمتفطرات السلية المخدرات فعالية الاختبار 16. هذا النموذج عدوى تنتج المكتظة معبأة المتفطرات السلية داخل هياكل الإجمالية البلاعم الكبيرة، والتي لخص الحواجز معدل انتشار الهواتف النقالة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ولدت بلعم-passaged <eم&gt; المتفطرات السلية مع الحالة الفيزيولوجية تغير تشبه الكامنة المتفطرات السلية. المواضيع المتميزة المستمدة من هذا النموذج العدوى ودمجها مع فحص ريسازورين عيار مكروي (REMA) لتقييم نجاعة الأدوية، والتي تنتج نتائج متسقة مع نماذج إصابة الخلايا الأخرى وربطها بشكل جيد مع القدرة ذكرت من أدوية السل المشتركة لتحقيق تركيزات عالية CSF النسبية لتركيزات مصل 16. نحن هنا تصف بالتفصيل جيل من المتفطرات السلية / الهياكل الكلية بلعم لإنتاج بلعم passaged المتفطرات السلية مناسبة لاختبار الحساسية المخدرات باستخدام REMA. على وجه الخصوص، وتبين لنا كيف يمكن تكييف هذا النظام العدوى إلى تنسيق 96-جيدا من أجل التوافق مع الفحص الإنتاجية مرشح الأدوية المضادة للسل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7H9</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>271310</td>
			<td>Follow manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook OADC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyloxapol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8761</td>
			<td>Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5710</td>
			<td>Prepare 24 mg/ml&#160; stock solution in H2O; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194694</td>
			<td>Prepare 50 mg/ml&#160; stock solution in H2O; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400051</td>
			<td>Prepare 200 mg/ml&#160; stock solution in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Square PETG media bottle</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>2019-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT25005CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 3 plate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 Software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>Recording and analysis of rezasurin coversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2679250</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moxifloxacin Hydrochloride</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>457960010</td>
			<td>Prepare 10 mg/ml stock solution in H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resazurin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7017</td>
			<td>Prepare 800 &#956;g/mL stock solution in H2O; filter sterilize</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T164500</td>
			<td>Prepare 20% stock solution in H2O; filter sterilize</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput compatible assay to evaluate drug efficacy against macrophage passaged mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

لتأكيد متانة التكيف مع هذا النموذج العدوى إلى 96 بئرا شكل لوحة، ونحن هنا فحص قابلية المخدرات من المتفطرات السلية المستمدة من وجهة نظرنا 96-جيدا تكييفها نموذج العدوى إلى ريفامبيسين (RIF) وموكسيفلوكساسين (MOXI) وفقا لقالب معين في الشكل 1A. علين...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis at JoVE.com

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

7.7K Views.  University of Alabama at Birmingham. New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening. 

Video: A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

نموذج الالتهاب الرئوي القوي في مناعيا القوارض لتقييم مضاد للبكتيريا فعالية ضد<i&gt; S. الرئوية</i&gt;،<i&gt; H. النزلية</i&gt;،<i&gt; K. الرئوية</i&gt;،<em&gt; P. الزنجارية</em&gt; أو<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; كاسيم ملزمة الفحص الذي يتنبأ اختراق المخدرات في الآفات السل

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

تصوير بكتريا السل في الفئران مع "مراسل إنزيم الأسفار"

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

السل النمذجة في "الزرد الكبار المصابين" بكتريا مارينوم

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...