فإن الكتاب أود أن أشكر ميريام استر لتكاثر البعوض. وأيد هذا العمل عن طريق التمويل في المنزل من مركز أبحاث Borstel وانضم التمويل من قبل مركز العدوى لايبنتز.

<ol>
	<li>Mueller, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Transmission+of+Plasmodium+berghei+Exacerbates+Chronic+Tuberculosis+in+an+Experimental+Co-Infection+Model.">Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model.</a> PLoS ONE. 7, e48110 (2012).</li><li>Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+tuberculosis:+myths+and+truth.">Innate immunity in tuberculosis: myths and truth.</a> Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).</li><li>Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+parasite+development+in+the+mosquito+and+infection+of+the+mammalian+host.">Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host.</a> Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).</li><li>Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+immune+defenses+against+Plasmodium+infection.">Mosquito immune defenses against Plasmodium infection.</a> Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).</li><li>Page, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium-induced+potentiation+of+type+1+immune+responses+and+protection+against+malaria+are+host+specific.">Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific.</a> Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).</li><li>Hawkes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+exacerbates+experimental+mycobacterial+infection+in+vitro+and+in+vivo.">Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo.</a> Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).</li><li>Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+report:+modulation+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection+by+Plasmodium+in+the+murine+model.">Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).</li><li>Hoffman, S. L., Doolan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines-targeting+infected+hepatocytes.">Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes.</a> Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).</li><li>Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+Plasmodium+parasites+as+a+protective+experimental+malaria+vaccine.">Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine.</a> Nature. 433, 164-167 (2005).</li><li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216, 160-162 (1967).</li><li>Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectivity+of+Plasmodium+berghei+sporozoites+delivered+by+intravenous+inoculation+versus+mosquito+bite:+implications+for+sporozoite+vaccine+trials.">Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials.</a> Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).</li><li>Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+midgut+and+salivary+glands+from+Ae.+aegypti+mosquitoes.">Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes.</a> J. Vis. Exp. , e228 (2007).</li><li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle.">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li><li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss-of-function+analyses+defines+vital+and+redundant+functions+of+the+Plasmodium+rhomboid+protease+family.">Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family.</a> Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).</li><li>Bancroft, J. D. G., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , (2007).</li><li>Schneider, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+IL-18+in+protective+immunity+against+Mycobacterium+tuberculosis.">A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis.</a> Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).</li><li>Craig, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+animal+models+for+research+on+severe+malaria.">The role of animal models for research on severe malaria.</a> PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).</li><li>de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+malaria:+why+experimental+murine+models+are+required+to+understand+the+pathogenesis+of+disease.">Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease.</a> Parasitology. 137, 755-772 (2010).</li><li>Van den Steen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunopathology+and+dexamethasone+therapy+in+a+new+model+for+malaria-associated+acute+respiratory+distress+syndrome.">Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وصفنا كيف الفئران يمكن أن يصاب مثمر مع المواضيع المتميزة وP. berghei عبر الطرق الطبيعية للعدوى. نطبق تأسيس بروتوكولات عدوى السل إلى دراسة تجريبية 13 أو 12 الملاريا والتي اعتمدت مؤخرا لدراسة لهم عدوى مرافقة بين المواضيع المتميزة والمتصورة في نموذج الفأر 1. الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لالتهابات الناجحة هي انتقال مسببات الأمراض سواء على الأرقام المطلوبة. يجب أن لا تكون الأسهم المتفطرات مضى عليها أكثر من 2 سنوات لأنها سوف تفقد جدوى مع مرور الوقت، وسوف عيار مصممة أصلا للأسهم على الأرجح لن تكون دقيقة. ونتيجة لذلك، فإن الجرعات العدوى تكون أقل بكثير مما كان متوقعا. لذلك، ينبغي تحديد التتر كفو الثقافات الأسهم كل بضعة أشهر. نفس القدر من الأهمية هو زراعة موحدة وجيل من الأسهم المواضيع المتميزة في المقام الأول. ظروف مثل الثقافةالمتوسطة، وملاحق، والوقت، وحجم يجب أن تكون موحدة لكي تكون قادرا على مقارنة البيانات من التجارب باستخدام مخزونات مختلفة من المواضيع المتميزة. المتفطرات تميل إلى تتجمع خلال الثقافة، وبالتالي فإنه من المهم للحفاظ على ظروف ثقافة موحدة، والبكتيريا الحصاد في مرحلة النمو نفسه و resuspend في كثير من الأحيان خلال aliquoting. خلاف ذلك يمكن أن يكون هناك تباين واسع في التتر كفو ونتيجة العدوى. توليد دفعات البعوض المصابة متجانس هو خطوة حاسمة أخرى. منذ البعوض المختلفة وتتغذى على كل فأر الفردية، من المهم أن جميع من البعوض تستخدم لعدوى التجربة واحدة تأتي من نفس الدفعة والتي تستخدم فقط تلك دفعات حيث يصاب أكثر من 90٪ من البعوض. النموذج الحالي يمكن استخدامها لتشريح الاستجابات المناعية والتحويرات المناعي في مجموعة المصابون عن طريق مقارنتها إلى الاستجابات المناعية في المضيفين المصابة واحد. يمكننا تطبيق فامنهجيات rious زارة راسخة مثل الأنسجة، المناعية، تحليل الخلوي من السكان الخلايا المناعية، أو PCR وELISA للخلوى وكشف chemokine للأنسجة أو سوائل جسم من الفائدة. تجدر الإشارة إلى أن مثل هذه النماذج الماوس على قيود معينة. في حين أن الغالبية العظمى من المصابين MTB تطوير عدوى كامنة مع عدم وجود علامات لهذه الأعراض السريرية والفئران تطوير مرض مزمن مع التدريجي أمراض الرئة. لا يزال، C57BL / 6 الفئران هي مقاومة نسبيا للإصابة MTB ولا تطوير حبيبية الكلاسيكية كما لوحظ في مرضى السل الإنسان. ونتيجة لذلك، وردود الفعل immunopathological في الماوس لا تعكس ولا مرض السل الكامنة الإنسان ولا نشطة بشكل مناسب. على الرغم من التباين بين المرض الكامنة والمزمنة في الإنسان والفأر، وقد استخدمت على نطاق واسع الفئران لتحديد ودراسة العوامل المضيفة التي تتحكم العدوى المواضيع المتميزة وأدوات قيمة والتي لا غنى عنها للتحقيقالاستجابات المناعية في الأمراض المعدية. الأهم من ذلك، القابلية للإصابة MTB اختلافا كبيرا بين السلالات الفطرية الماوس استخداما وسلالات أكثر عرضة مثل DBA أو C3H يمكن تضمينها في الدراسات وشارك في العدوى واحد. علاوة على ذلك، وبصرف النظر عن الأنواع الممرض الموصوفة هنا، يمكن أن تستخدم أي نوع من الأنواع المتفطرة الأخرى ذات الاهتمام (على سبيل المثال العزلات السريرية). وبالمثل، في حين يعيد يوجد نموذج واحد الملاريا جميع جوانب المرض الإنسان نماذج الماوس مختلفة لا تشبه جوانب مختلفة من عدوى الملاريا البشرية المكتسبة بشكل طبيعي. على سبيل المثال، P. berghei أنكا وP. ودرس yoelii YM/17XL على نطاق واسع من النماذج البشرية (المتصورة المنجلية التي يسببها) الملاريا الحادة، مع P. berghei أنكا التي تعتبر نموذجا ممتازا للإنسان malari الدماغي و 14،15. P. berghei NK65 هو نموذج ممتاز لhyperparasitaemia وفقر الدم الحاد الملاريا، وقد تم مؤخراوصفها بأنها نموذج تجريبي لمتلازمة المرتبطة بالملاريا الحادة الضائقة التنفسية (MA-ARDS 16). باستخدام نموذج عدوى مرافقة وصفها، ويمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن المتزامنة P. عدوى berghei NK65 تفاقم السل المزمن 1. وبصرف النظر عن استخدام مختلف الطفيليات القوارض والملاريا، ويمكن تكييفها ترتيب وتوقيت الأحداث العدوى اعتمادا على سؤال البحث الأساسي. في هذا المجال، وقد تكون العدوى المصاحبة المتصورة في الوقت الحاضر من العدوى المكتسبة MTB أو في وقت لاحق. في كل من السيناريوهات قد تتأثر الاستجابات المناعية لMTB والمتصورة بشكل مختلف. وبالتالي، يمكن أن تصاب الفئران مع sporozoites المتصورة إما قبل أو بعد الإصابة MTB. علاوة على ذلك، يمكن الطعن الفئران في أوقات مختلفة إصابة آخر المواضيع المتميزة لتقييم أثر الاستجابة المناعية التي يسببها المتصورة على الحادة مقابل المزمنةالسل. الأهم من ذلك، عند اختيار طفيلي الملاريا لدراسة عدوى مرافقة الملاريا والسل، وينبغي للمرء أن يكون على علم بأن بعض سلالات الملاريا القوارض تسبب المرض الحاد في بعض سلالات الفئران والاستسلام للإصابة خلال أيام أو أسابيع فقط في حين MTB يسبب التهابات مزمنة وطويلة الأمد في مناعيا الفئران. وبالتالي، توقيت عدوى مرافقة أمر بالغ الأهمية من أجل تجنب الوفاة المبكرة من حيوانات التجارب. يبقى التشكيل الحصانة المضيف عن طريق العدوى المتزامنة مع الأنواع الممرض متعددة غير مفهومة. توفر لدينا نموذج عدوى مرافقة التجريبية أداة قوية لتحقيق المتفطرة - التفاعل المتصورة مع الجهاز المناعي للمضيف المصابون وسوف تسهم في فهمنا كيف يمكن أن تؤثر coinfections المرضية، نتيجة المرض، والتطعيم، والمناعي، والعلاج.

نادرا ما يتعرض البشر لالممرض واحد فقط. ولا سيما في المناطق التي يرتفع فيها عدد الإصابات مثل أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، coinfections تمثل مشكلة صحية عامة ولكن رئيس بالتقدير للغاية. والسل، والملاريا هي الالتهابات البكتيرية والطفيلية الأكثر انتشارا في البشر، على التوالي وما زالت الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. على الرغم من تداخل جغرافي واسع بين السل والملاريا وعدد كبير من الأفراد المعرضين لخطر عدوى مرافقة، والقليل جدا هو المعروف عن التفاعلات بين مختلف وغالبا مواجهة المنظمين والمستجيبات المناعي أثارت في وقت واحد ضد طفيليات الملاريا والعصيات السلية في الأفراد المصابون. نماذج القوارض من الإصابات المختلطة تسمح تميز الفرق التفاعلات المناعية ضد مسببات الأمراض متميزة في مضيف واحد، وبالتالي تسليط الضوء على influ المتبادلةبسبب الخلافات تحوير علم الأمراض والنتائج السريرية للمرض الفردية، والتي سوف تساعد أيضا على تحديد توصيات جديدة لعلاج والوقاية. أنشأنا نموذج الفأر التجريبية التي تمكننا من تحقيق في تداعيات الناجمة عن العدوى المتزامنة مع المتفطرة السلية (MTB) وأنواع القوارض المتصورة ضمن نفس المضيف 1. الأهم من ذلك، لمحاكاة الإصابات البشرية المكتسبة بشكل طبيعي قدر الإمكان، نموذجنا تنفذ الطرق الطبيعية للعدوى يستخدمها كل من مسببات الأمراض. السل هو عدوى المحمولة جوا، وبالتالي الذي يظهر أساسا في الرئتين. العامل المسبب، تبث MTB من قبل أشخاص يعانون من مرض نشطة عبر الطريق الهباء الجوي عندما طرد قطرات المعدية أثناء السعال أو العطس. وهكذا، والعدوى الهباء الجوي هو الأسلوب المفضل لتقليد العدوى الطبيعية. لا يمكن أن يتحقق جيل من الجسيمات العالقة في الهواء التي تحتوي على MTB عن طريق استخدامنظام التعرض للاستنشاق. هذا كله غرفة تعرض الجسم يسمح تعريض حيوانات التجارب لMTB التي تحتوي على قطرات المعدية (الشكل 1) والتي يتم استنشاقها إلى الحويصلات الهوائية في الرئتين حيث يبدأ المرض 2. الملاريا من ناحية أخرى هي الأمراض المنقولة بالنواقل الناجمة عن الأوالي، apicomplexan طفيلي المتصورة التي تبث بشكل طبيعي عن طريق لدغة أنثى البعوض أنوفيلي. خلال وجبة الدم، تترسب sporozoites المعدية تحت الجلد وتصل في وقت لاحق المضيف الكبد عن طريق مجرى الدم. داخل خلايا الكبد أن تتطور وتتكاثر بسرعة في schizonts مرحلة الكبد. في نهاية المطاف، schizonts ناضجة تمزق والافراج عن الآلاف من الإمراض merozoites الجيل الأول في مجرى الدم حيث بدء دورة التدريجي للغزو الخلية الحمراء، والنسخ، وتمزق الخلايا الحمراء، والاجتياح 3. في دورة حياة المتصورة continUES لبعض merozoites تتطور إلى مراحل الطفيلي الجنسي، من الذكور والإناث gametocytes، والتي يمكن تناولها عن طريق البعوض خلال وجبات الدم. في البعوض، sporozoites المتصورة تطوير داخل بيض التوكسوبلازما المقيمين في المعي المتوسط ​​البعوض ويهاجر في نهاية المطاف إلى الغدد اللعابية لإحالتها إلى 3،4 مضيف آخر. بينما في النماذج الحيوانية التجريبية تسليم MTB عبر الأيروسول والطريق وبالتالي الأكثر أهمية هو شائع جدا، وقد أجريت العديد من الدراسات العدوى القوارض المتصورة بما في ذلك الدراسات التجريبية على عدوى مرافقة الملاريا السل 5-7 خارج عن طريق إصابة الفئران مع الكريات الحمراء مطفول، مما أدى لعدوى الملاريا مرحلة الدم مع استبعاد مرحلة مرحلة الكبد سريريا الصامتة. ومع ذلك، فإن المرحلة الكبد هو خطوة إلزامية خلال العدوى وذات الصلة لمكافحة الحصانة متصوري 8-11. لذا نعتبر أنه من المهم أن تشمل فتاه كبديبورصة عمان من انتقال الملاريا والصيانة في دراسات كل من الملاريا وعدوى مرافقة الملاريا السل، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين أن تنتقل بشكل طبيعي sporozoites هي أكثر من تلك المعدية التي تنتقل عن طريق العدوى إبرة 12، والتي دفعتنا إلى تأسيس عدوى الملاريا من قبل لدغة البعوض بدلا من حقن معزولة الغدة اللعابية sporozoites مشتقة. الطريقة الوحيدة للحصول على البعوض المعدية للانتقال الطبيعية من طفيليات الملاريا هو الحفاظ على دورة الحياة الكاملة للطفيل في كل من الفقاريات المضيف (هنا الماوس) والبعوض الناقل للمرض. وبالتالي، الوصول إلى معمل الحشرات للصيانة الطفيلي أمر لا مفر منه من أجل أداء الإرسال الطبيعية عن طريق لدغة. وقد وضعت لدينا بروتوكول الموصوفة هنا لمعرفة كيف عدوى مرافقة مع المتصورة sporozoites التأثيرات على السل المزمن 1. للقيام بذلك، يصاب الفئران الهباء الجوي مع م. السل و4في وقت لاحق 0 يوم، عندما M. وصلت عدوى السل المرحلة المزمنة، ويتعرض الفئران لبعوض الملاريا المعدية. يمكن اتباعها نتائج كل من الملاريا والسل في الحيوانات المصابون من خلال رصد الطفيل في الدم والحمل البكتيري في الأنسجة، على التوالي. في بروتوكول لدينا، فإننا سوف تصف بالتفصيل كيفية تصيب الفئران مع كل مسببات الأمراض من طريق العدوى الطبيعية، وكيف لتأكيد انتقال الممرض ناجحة. في أيدينا، وحققت معدل الإصابة عادة لكلا الالتهابات التجريبية هو 100٪. ويمكن تطبيق هذه البروتوكولات لدراسة كل على حدة أو الالتهابات، كما نفعل، لنموذج ودراسة عدوى مرافقة بين اثنين من الأمراض المعدية الأكثر تحديا الإنسان. هذا النموذج ينطبق على الأنواع المتفطرة والقوارض المتصورة أخرى خارجة عن تلك الموصوفة في هذا البروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="650">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Buraton</td>
			<td style="width:124px;">Sch&#252;lke</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Middlebrook 7H9&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M0178</td>
			<td style="width:191px;">For Mtb broth cultures</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook 7H11&#160;</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">283810</td>
			<td style="width:191px;">Agar medium for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Middlebrook OADC enrichment medium</td>
			<td style="width:124px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212240</td>
			<td style="width:191px;">Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Staining Dish</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62542-12</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24-Slide Holder w/Handle</td>
			<td style="width:124px;">Science Services</td>
			<td style="width:119px;">E62543-06</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution</td>
			<td style="width:124px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">109204</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wright&#180;s stain</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W0625</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inhalation Exposure System</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nebulizer-Venturi</td>
			<td style="width:124px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice cream cups</td>
			<td style="width:124px;">H&#228;agen-Dazs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:191px;">Used as mosquito cages</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal-frame mosquito cages</td>
			<td style="width:124px;">BioQuip Products</td>
			<td style="width:119px;">1450A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental model to study tuberculosis-malaria coinfection upon natural transmission of mycobacterium tuberculosis and plasmodium berghei

Coinfections تحدث بشكل طبيعي بسبب التداخل الجغرافي للأنواع متميزة من الكائنات الحية المسببة للأمراض. العدوى المتزامنة على الأرجح تعدل الاستجابة المناعية منها إلى كل الممرض واحد، وبالتالي قد تؤثر المرضية ونتائج المرض. المرضى المصابون قد تستجيب بشكل مختلف أيضا للتدخلات المضادة للعدوى. لم يدرس عدوى مرافقة بين السل الناجم عن المتفطرات وطفيل الملاريا المتصورة، وكلاهما coendemic في أجزاء كثيرة من أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى، بالتفصيل. من أجل الاقتراب من التحدي ولكن علميا وسريريا مسألة ذات أهمية كبيرة كيف عدوى مرافقة الملاريا السل تعدل الحصانة المضيفة وبالطبع من كل مرض، أنشأنا نموذجا الماوس التجريبية التي تسمح لنا لتشريح الاستجابات المناعية أثارت لكلا مسببات الأمراض في البلد المضيف المصابون . من المذكرة، من أجل تقليد الأكثر تحديدا الإصابات البشرية المكتسبة بشكل طبيعي، ونحن أداء التجريبيةالعدوى من الفئران مع كل مسببات الأمراض من خلال مساراتها الطبيعية للعدوى، أي الهباء الجوي ودغة البعوض، على التوالي.

إصابة الفئران مع المواضيع المتميزة وP. berghei عبر الطريق الطبيعي، أي الهباء الجوي ودغة البعوض، على التوالي، في نتائج متسقة وقابلة للتكرار العدوى لجميع الحيوانات (الجدول 1) 1. يمكننا رصد العدوى ناجحة وبالطبع كل من الملاريا والسل من خلال تحديد وقوع الأولي (سبقة الظهور) وعدد من الطفيليات في الدم (P. berghei الطفيل) وعبء المواضيع المتميزة في مختلف الأجهزة، على التوالي. ويرد مثال على نجاح انتقال طفيل الملاريا عن طريق لدغ البعوض المعدية في الجدول (1) والشكل (3). أدت التغذية من 10 البعوض المصابة حيوان بوغي على كل الماوس في معدل الإصابة بنسبة 100٪ على نحو ما أكده وجود الطفيليات مرحلة الدم 4-5 أيام في وقت لاحق (الجدول 1 والشكل 3A). الأهم من ذلك، نجد أعداد الطفيل مماثلة في دم الفئران الفردية من نفس غرام التجريبيةموعة، مشيرا إلى أن انتقال حيوان بوغي بالنتائج دغة بعوضة في عدوى متسقة وقابلة للتكرار. بمقارنة سبقة الظهور في السيطرة على الفئران السذاجة مع أنه في الحيوانات MTB-المصابون، يمكننا أن نرى أن يتم تأخير سبقة الظهور بشكل طفيف في الفئران التي تم preinfected مع MTB (الجدول 1، الشكل 3B) 1. ونحن قد ذكرت سابقا 1، يمكننا تحديد أثر MTB عدوى مرافقة على مسار الملاريا بحلول الطفيل الرصد اليومي في مسحات الدم بالغيمزا الملطخة كما هو مبين في الشكل 3B. إصابة الفئران مع MTB عن طريق استخدام أحد نتائج التعرض للاستنشاق في نظام ترسب ناجحة من البكتيريا في الرئتين مع تقلب منخفض نسبيا بين الفئران الفردية (الشكل 4A). يمكننا متابعة الأحمال الفطرية في الرئتين والأعضاء الأخرى من الفائدة مع مرور الوقت عن طريق تقرير كفو. مثال لتحميل الفطرية في رئاتإصابة المواضيع المتميزة C57BL / 6 الفئران في غياب أو وجود P. ويظهر في الشكل 4B berghei. الجدول 1. سبقة الظهور بعد انتقال حيوان بوغي بواسطة لدغة البعوض. جميع الفئران وضعت العدوى المرحلة الدم بعد انتقال طبيعي للP. berghei sporozoites بواسطة لدغة البعوض. مقتبس من 1 بلوس وان، 7 (10)، e48110 بإذن. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مجموعة الماوس التجريبية (C57BL / 6) </td><td> تحدي بنسبة 10 دغات البعوض المعدية </td><td> عدد مرحلة الدم الحيوانات إيجابية / عدد الحيوانات لكل مجموعة </td><td> يعني سبقة الظهور [د] </td></tr><tr><td> السذاجة </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 4،4 </td></tr><tr><td> المواضيع المتميزة المصابين </td><td> P. berghei </td><td> 7/7 </td><td> 5،5 </t<html> د&gt; </tr></tbody></table><img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig1.jpg" /> الشكل 1. . يتعرض الخطة الشاملة للإجراءات التجريبية C57BL / 6 الفئران لMTB التي تحتوي على قطرات في غرفة الهباء الجوي غلاس كولونيل. بعد يوم واحد العدوى الهباء الجوي، يتم التحقق من امتصاص المواضيع المتميزة من خلال تحليل كفو في الرئة. بعد 40 يوما MTB التحدي (عندما أصبح السل المزمن في الفئران المصابة)، تتعرض الحيوانات لP. إصابة berghei البعوض. لتأكيد انتقال حيوان بوغي ناجحة ومتابعة مسار عدوى المتصورة، ويتم رصد الطفيل في مسحات الدم اليومية بالغيمزا الملطخة اعتبارا من 3 أيام بعد لدغة البعوض. / files/ftp_upload/50829/50829fig2highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/50829/50829fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. رسم من قفص البعوض. ترد البعوض المعدية داخل الكرتون مثل نصف باينت الآيس كريم الكرتون. يتم قطع فتحة صغيرة في جانب من الكرتون ومغطاة بطبقة مزدوجة من اللاتكس مع فتحة قطع في كل قطعة لإنشاء مدخل آمن للبعوض. وسجلت قطعة من ورق الترشيح على الجزء السفلي من داخل الكرتون لامتصاص القطرات. يتم إغلاق أكواب الآيس كريم قبالة مع المعاوضة (شبكة النايلون) الذي هو ثابت للكرتون بواسطة شريط وشريط مطاطي. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig3.jpg" /> الرقم 3. الطفيل في الدم. A) مثال لرايت سيصدره اللطاخة الدموية الملون تظهر الكريات الحمراء مطفول (شريط مقياس، 20 &amp; #تم رصد م) B) الطفيل في الدم عن طريق تحليل الماوس اليومية مسحات الدم ملطخة بالغيمزا؛ 181. الفئران المصابون لديهم انخفاض الطفيل مقارنة مع الفئران المصابة المتصورة واحد (ن = 10)، وتظهر النتائج على النحو يعني ± SD؛ *** ف &lt;0،001. طبع من 1 بلوس وان، 7 (10)، e48110 بإذن. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50829/50829fig4.jpg" /> الشكل 4. الكشف عن MTB في الرئة. وقد تم الطعن C57BL / 6 الفئران الهباء الجوي مع 100 كفو من المواضيع المتميزة وبعد 40 يوما، المصابون P. berghei بواسطة لدغة البعوض. A) بعد يوم واحد من عدوى الهباء الجوي تم التحقق من امتصاص العدد المطلوب من المواضيع المتميزة من قبل الطلاء الخليط الرئة كله من أجل تقرير CFU. ب) البكتيرياتم تحديد لتر الأحمال في وقت عدوى مرافقة في الرئة لست] من 3 الفئران عن طريق تحليل كفو (MTB d40/d0). بعد 12 يوما عدوى مرافقة، كانت مطلية لست] الرئة لتحليل كفو لتحديد تأثير المتصورة عدوى مرافقة على السيطرة MTB. نلاحظ، أن أعدادا المواضيع المتميزة في الرئتين زادت خلال عدوى مرافقة مع P. berghei NK65. وضع العلامات المحور السيني: الوقت بعد MTB -infection/time بعد عدوى مرافقة. مقتبس من 1 بلوس وان، 7 (10)، e48110 بإذن.

Watch this Scientific Journal Video about An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei at JoVE.com

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

والسل، والملاريا وهما من الإصابات الأكثر انتشارا في البشر والأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. أنشأنا نظام نموذج تجريبي لدراسة نتائج عدوى مرافقة الملاريا والسل في الفئران بعد التحدي مع كل مسببات الأمراض عبر الطريق الطبيعية للعدوى.

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

an-experimental-model-to-study-tuberculosis-malaria-coinfection-upon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

19.7K Views.  University Hospital Heidelberg.  والسل، والملاريا وهما من الإصابات الأكثر انتشارا في البشر والأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات في السكان الفقراء في المناطق المدارية. أنشأنا نظام نموذج تجريبي لدراسة نتائج عدوى مرافقة الملاريا والسل في الفئران بعد التحدي مع كل مسببات الأم...

Video: An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

تحضير العينة من<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; خلاصات لدراسات النووية المغناطيسي الرنين Metabolomic

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most common microdissection technique used today. In this technique, a laser is used to focally melt a thermoplastic membrane that overlies a dehydrated tissue section1. The tissue section composite is then lifted and separated from the membrane. Although this technique can be used successfully for tissue examination, it is time consuming and expensive. Furthermore, the successful completion of procedures using this technique requires the use of a laser, thus limiting its use. A new more affordable and practical microdissection approach called mesodissection is a possible solution to the pitfalls of LCM. This technique employs the MESO-1/MeSectr system to mill the desired tissue from a slide mounted tissue sample while concurrently dispensing and aspirating fluid to recover the desired tissue sample into a consumable mill bit. Before the dissection process begins, the user aligns the formalin fixed paraffin embedded (FFPE) slide with a hematoxylin and eosin stained (H&#38;E) reference slide. Thereafter, the operator annotates the desired dissection area and proceeds to dissect the appropriate segment. The program generates an archived image of the dissection. The main advantage of mesodissection is the short duration needed to dissect a slide, taking an average of ten minutes from set up to sample generation in this experiment. Additionally, the system is significantly more cost effective and user friendly. A slight disadvantage is that it is not as precise as laser capture microscopy. In this article we demonstrate how mesodissection can be used to extract RNA from slides from FFPE granulomas caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb).

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Microdissection has been extensively employed for the examination of DNA, RNA, and protein within tissue. Laser capture microscopy (LCM) is the most commonly used method, but a new milling technique, mesodissection, is recently available. We demonstrate RNA extraction from mesodissected formalin fixed paraffin embedded tissue slides of Mycobacterium tuberculosis granulomas.

مقاربة الرواية تسليخ مجهري ليتعافى<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; نصوص محددة من الفورمالين الثابتة جزءا لا يتجزأ من البارافين الرئة أورام حبيبية

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

نموذج الأنسجة 3D الرئة الإنسان للدراسات وظيفية على<em&gt; المتفطرة السلية</em&gt; العدوى

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

تصوير بكتريا السل في الفئران مع "مراسل إنزيم الأسفار"

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...