الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة تأثير الجين SOX5 على تعقيد الخلايا العصبية التشعب خلال تطور الخلايا العصبية في دروسوفيليا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في دراسة تكوين المورفين من التشعبات العصبية ، ووظيفة الجينات في تطوير الجهاز العصبي ، لفهم أفضل لجينات الأمراض العصبية التنكسية. في نهاية المطاف يوفر هذا الأسلوب تحليل كمي لتشعب التعقيد، والتي يمكن استخدامها في العديد من أنواع مختلفة من تشعبات الأعصاب.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الآلية الوراثية للمرض العصبي التنكسي، لأن الطفرة تحمل المفتاح لفهم وظيفة الجينات. إعداد الصلبان من UAS-GFP؛ ppk-GAL4 مع UAS-Sox102F-RNAi سلالة الذباب أو الضوابط W118. ثقافة يطير تحت شروط معياريّة في 25 درجة مئويّة.
في حوالي خمسة إلى ستة أيام ، استخدم ملقط لجمع اليرقات الثالثة بعناية للتشريح. ضع يرقة في طبق تشريح مصنوع من قاعدة مليستومر السيليكون ، وطبق بيتري من الأنسجة. ثم ضع الطبق تحت مجهر التشريح.
الآن دبوس ذيل اليرقة لفضح خط الوسط. ثم قم بربط خطاطيف فم اليرقة حتى يصل الجانب الظهري لليرقة. الآن إضافة 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى الطبق لتزج اليرقة في الحل.
بعد ذلك ، قطع ذيل فم اليرقة بشقوق صغيرة. ثم قطع اليرقة مفتوحة على طول خط الوسط الظهري وبين القصبة الهوائية اثنين، الانتقال من السد إلى الروسترال. ثم وضع دبوس في كل من الزوايا الأربعة من الجسم حتى الجسم يكمن شقة.
الآن إصلاح جدار الجسم يرقة في أربعة في المئة PFA لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل اليرقة مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. بعد غسل، وإزالة دبابيس ونقل الأنسجة على شريحة زجاجية.
ثم تزج الأنسجة في antifade تصاعد المتوسطة، وجبل مع زلة الغطاء. السماح للأنسجة التي شنت على الهواء الجاف لمدة ساعة قبل الختم على زلة الغطاء مع طلاء الأظافر. تخزين هذه الشرائح في الظلام في أربع درجات مئوية.
التقاط الصور سلسلة ض مع مجهر confocal باستخدام هدف 20X. أولاً، قم بتعيين نطاق الخطوات z لتشمل جميع الخلايا العصبية DA في جدار جسم اليرقة، وتعيين حجم الخطوة إلى نصف ميكرومتر. ثم تخزين الصور كملفات TIF أو ND2 للمعالجة.
بعد ذلك، تقييم عدد ومورفولوجيا التشعبات على الخلايا العصبية DA. تبدأ مع تقييم أطوالها. أولاً، في فيجي إيمج، قم بتقسيم الصور إلى قنوات منفصلة إذا لزم الأمر.
ولا يحتاج التقييم إلا إلى تقييم قناة البرنامج العالمي. المقبل، وجعل الإسقاط z. في النافذة الجديدة، حدد أقصى كثافة لنوع العرض، واختر شرائح البداية والتوقّف.
ثم انقر فوق موافق لإنتاج صورة الإسقاط ض مع توقعات dendrite واضحة. الآن تتبع neurites باستخدام أداة المكونات في. أولاً، انتقل إلى سوما من الخلايا العصبية من الفائدة وانقر حيث يُظهر تشعب واحد من جسم الخلية.
ثم انقر على طرف هذا التشعب. إذا كان الخط الأزرق الذي يربط بين نقطتين يمتد طول neurite، اضغط Y نعم. ثم إذا كان هذا الخط يناسب المسار الكامل لل neurite، انقر فوق المسار الكامل.
إذا كان الخط لا يتناسب مع المسار، ثم انقر على نقاط أخرى على طول هذا neurite لثني المسار في شرائح خط متعددة من شأنها أن تناسب طول neurite. ثم، انقر فوق المسار الكامل والمضي قدما في وضع علامة على المسار ل neurite المقبل. بعد إكمال كافة مسارات التتبع، حدد الخيار تحليل، قياس المسارات لتصدير المسارات إلى ملف CSV.
استخدم هذه البيانات لحساب متوسط قيمة أطوال المسار للتحليل. بعد ذلك، حساب مساحة السطح من الخلايا العصبية. أولاً، حدد أداة الرسم اليدوي الحر من نافذة Fiji ImageJ.
ثم، ربط نقاط نهاية من الخلايا العصبية من الفائدة. ثم، حدد الخيار قياس من إطار تحليل. تظهر النتيجة في مربع جديد مع تحديد قيمة المنطقة.
نسخ هذه القيمة إلى برنامج تحليل البيانات. وأخيرا ، حساب العدد الإجمالي الفروع باستخدام تحليل الهيكل العظمي المسارات البرنامج المساعد. تم تسمية dendrites من الخلايا العصبية DA من قبل المشاركة في التعبير عن GFP في سوما وتشعب arbors لتحليل التصوير الفلوريس GFP.
تم تصوير مورفولوجيا التشعب باستخدام مجهر مقلوب. تم تتبع dendrites من الخلايا العصبية DA كما هو موضح. تم استخدام الملف لتقدير طول التشعب.
أدى إسكات Sox102F في الخلايا العصبية DA في يرقة النجوم الثالثة إلى انخفاض كبير في العدد الإجمالي للتشعبات مع حوالي نصف طول الفرع وبنية أبسط ، مما يظهر فقط نصف عدد الفروع. منطقيا، أدى هذا إلى انخفاض في مساحة سطح arbor. يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة لتقييم تطور الخلايا العصبية الحسية DA.
أثناء محاولة هذا الإجراء, تأكد من اتخاذ عدد وفير من الصور لكل مجموعة من الخلايا العصبية DA للحصول على تغطية جيدة. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تحليل التشعب من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول تطوير التشعب. منذ أن تطور، ساعدت هذه التقنية الباحثين في مجال علم الأعصاب على استنتاج الأمراض العصبية مثل الزهايمر باستخدام أنظمة النماذج.
