Name: quantitative analysis of climbing defects in a drosophila model of neurodegenerative disorders
Uploaded: 2015-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders at JoVE.com

This work is supported by a Canadian Health Research Institute (CIHR) Team Grant to Dr. Bolduc (co-PI) and Dr. Guy Rouleau (PI). We would like to thank Dr. Oksana Suchowersky, Dr. Kathryn Todd, the members of the University of Alberta fly club and Dr. Clayton Dickson for help in development of the method and statistical analysis.

كان البحث على ذبابة الفاكهة السوداء البطن في الامتثال مع جامعة المبادئ التوجيهية للبحوث ألبرتا. 1. يطير مجموعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 20 الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 (ز) تخدير ووضعه في 25 ملم × 95 ملم جمع قارورة تحتوي على المواد الغذائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن قارورة تحتوي على الذباب أفقيا لتجنب محاصرة الذباب في أي السوائل التي قد تتراكم في الجزء السفلي من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الذباب للا يقل عن 21 ساعة على 22 ° C في 45٪ الرطوبة في الحاضنة لمدة ما يقرب من 15 ساعة. تعيين حاضنة مع ضوء 12 ساعة: دورة الظلام. </li></ol> 2. تسلق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، ونقل 20 الذباب من قنينة واحدة في كوب 250 مل تخرج اسطوانة. بمناسبة موقف اسطوانة ليبقيه ثابتا كل يوم. استخدام واحدة اسطوانة الزجاج في التركيب الوراثي لمنع التلوث المتبادل بين الأنماط الجينية. يغسل في نهاية كل تجربة وريال عمانياألمد لهم بين الأنماط الجينية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تجارب في الضوء المحيط (أو الضوء الأحمر إذا كان هناك خلل محتمل في رؤية) في درجة حرارة ورطوبة 22 ° C و 40٪ على التوالي. لتجنب إيقاع الساعة البيولوجية يخزي، نفذ دائما التجارب في نفس الوقت من اليوم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الجزء العلوي من اسطوانة مع فيلم الحاجز (فيلم الشمع) لمنع هروب أي الذباب (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاميرا الفيديو على حامل ثلاثي الأرجل. الكاميرا التركيز على خط 190 مل من 250 مل تخرج اسطوانة (17.5 سم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من الذباب الميت في الجزء السفلي من الاسطوانة وفي قارورة الغذاء. تسجيل هذا الرقم كما في وفيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بخفة جدا الاسطوانة ضد سادة رغوة الخلايا المغلقة مرارا وتكرارا مع ما يكفي من القوة لإزاحة الذباب على السطح السفلي الداخلي. الاستفادة من 5-10 مرات بينما تستخدم اليد الأخرى للضغط سجل على الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على &quot;سجل&quot; الموجود على الكاميرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء فيدEO كاميرا تسجيل والاستفادة من اسطوانة ست مرات في نمط غير إيقاعية متميزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء كل محاكمة لمدة 2 دقيقة من الوقت الذي يتم استغلالها آخر الذباب وتسجيل عدد من الذباب عبور ارتفاع 17.5 سم (190 مل) في كل نقطة زمنية المختار (قياس كل 10 ثانية). ملاحظة: إن مل وضع علامات على اسطوانة تختلف من نموذج اسطوانة واحدة إلى أخرى اعتمادا على قطر. لتجنب الخطأ، وقياس ارتفاع على كل اسطوانة المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن المحاكمة قد انتهت، والتخلص من الذباب في الايثانول 95٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،1-2،9 حتى يتم اختبار جميع مكررات مع الذباب جديدة في كل مرة. ملاحظة: على الرغم من 5 مكررات قد يكون كافيا مع الطفرة التي لها تأثير قوي على الحركة، 10 مكررات البيولوجية لل20 الذباب (200 الذباب) ويوصى للكشف عن الفروق الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من التجربة، وغسل اسطوانات في غسالة الصحون المختبر وO جاف / N لإعادة استخدامها. </li></ol> تحليل 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Analyأشرطة الفيديو زي كل تطير المحاكمة. كل 10 ثانية، وتسجيل عدد من الذباب الذي اجتياز خط المرمى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا ذبابة يصعد إلى أسفل أو السقوط، سجل أن يطير -1 والاعتماد الطاير المقبل لعبور خط الهدف في نفس العدد الطاير أن قفز إلى أسفل أو سقط. على سبيل المثال، إذا انخفض ذبابة ال 15 تحت خط الهدف، الطاير المقبل لعبور خط (16 تشرين تطير) تعتبر ذبابة ال 15 وليس ال 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح معدل الوفيات الناجمة عن العدد الإجمالي من الذباب (20) للحصول على عدد من الذباب التي تبقى في المحاكمة. في كل نقطة زمنية، يجب الحصول على جزء من الذباب فوق خط المرمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم كل نسبة في كل نقطة زمنية (انظر الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل أداء عند نقطة البيانات 120 ثانية وأداء الطالب اختبار t عند وجود 2 مجموعات أو ANOVA والاختبار البعدي للمقارنات متعددة (مع تعديل Bonferroni للتخطيط وتوكي للتعاون غير المخطط لهmparisons). وكولموجوروف-سمرنوف 17 تتم أيضا للتأكد من الوضع الطبيعي والتباين على قدم المساواة ولكن أيضا لمقارنة توزيع مجموعة متحولة إلى عنصر التحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقديم البيانات عبر الشيخوخة، ورسم النسبة المئوية للذباب تسلق في 120 ثانية مع الذباب من مختلف الأعمار (2 أيام، 1 أسبوع، 2 أسابيع) لمعرفة ما إذا كان هناك عجز التدريجي (الشكل 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Auluck, P. K., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+prevention+of+Parkinson+disease+in+Drosophila.">Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila.</a> Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).</li><li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila.">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li><li>Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+protein+synthesis+in+Drosophila+fragile+X+mutants+impairs+long-term+memory.">Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory.</a> Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).</li><li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+rescue+of+synaptic+plasticity,+courtship+behavior,+and+mushroom+body+defects+in+a+Drosophila+model+of+fragile+X+syndrome.">Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome.</a> Neuron. 45, 753-764 (2005).</li><li>Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+epilepsy:+bss+is+a+gain-of-function+mutation+in+the+para+sodium+channel+gene+that+leads+to+seizures.">Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures.</a> Genetics. 187, 523-534 (2011).</li><li>Marley, R., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+persistent+Na++current+contributes+to+seizure+in+the+slamdance+bang-sensitive+Drosophila+mutant.">Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant.</a> Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+Mutants+Of+Drosophila+Isolated+By+Countercurrent+Distribution.">Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Ganetzky, B., Flanagan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+relationship+between+senescence+and+age-related+changes+in+two+wild-type+strains+of+Drosophila+melanogaster.">On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster.</a> Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).</li><li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+assay+Drosophila+behavior.">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+Drosophila+melanogaster+geotaxis,+a+complex+behavioral+trait.">Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait.</a> Nature genetics. 31, 349-353 (2002).</li><li>Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+simple+gravity+sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster.</a> Nature protocols. 5, 20-25 (2010).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).</li><li>Botella, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+carbonyl+reductase+sniffer+prevents+oxidative+stress-induced+neurodegeneration.">The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration.</a> Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).</li><li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li><li>Chakraborty, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Drosophila+Alzheimer's+disease+model:+pharmacological+rescue+of+cognitive+defects.">Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects.</a> PLoS One. 6, e20799 (2011).</li><li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-related+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+hereditary+spastic+paraplegia+are+ameliorated+by+treatment+with+vinblastine.">Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine.</a> J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).</li><li>Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , (2006).</li><li>Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spastin+regulates+synaptic+microtubule+networks+and+is+required+for+normal+motor+function.">Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function.</a> PLoS biology. 2, e429 (2004).</li><li>Inlow, J. K., Restifo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+comparative+genetics+of+mental+retardation.">Molecular and comparative genetics of mental retardation.</a> Genetics. 166, 835-881 (2004).</li><li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+Drosophila.">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila.</a> Genetics. 161, 1197-1208 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد ثبت بالفعل أن تكون ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا في مرض 14 والظروف العصبية الأخرى 1،2 باركنسون. بالإضافة إلى الأدوات الجينية المتاحة في ذبابة الفاكهة، والحفظ جدا الجينوم من أجل الجينات المسؤولة عن الاضطرابات العصبية 19. ظهور أساليب الفحص الجيني الجينوم (بما في ذلك كله التسلسل exome) من المرجح أن تستمر في تقديم قائمة أكبر من الجينات المرشحة المرتبطة اضطرابات الحركة البشرية. فإن تطوير علاجات لهذه الظروف تتطلب النماذج الحيوانية لزيادة فهمنا لعلم الأمراض تشارك في المراحل المبكرة من التنكس العصبي. استخدام ذبابة الفاكهة وانجذاب بالجاذبية الفحص السلبي يوفر وسيلة غير مكلفة ويمكن الاعتماد عليها لتحديد الجينات المسؤولة عن عيوب قاطرة وبعد فحص المخدرات مرشح لإنقاذ النمط الظاهري. وهذا يضيف إلى الجزيئية، الكهربية، والبراهين التصوير ركما يمكن الحصول على قبعة في نموذج حيواني نفسه. باستخدام الفحص التسلق، والبعض الآخر قد استنسخت بنجاح عيوب السيارات في الذباب متحولة عن الجينات تعطيل الحركة البشري. ومع ذلك، فقد أظهرت الأبحاث السابقة أن التغيرات المرضية يمكن أن تسبق الكشف عن العيوب قاطرة عدة أيام (14). ويلاحظ هذه الظاهرة أيضا في ظروف الاعصاب الإنسان حيث نتكلم عن التغييرات تحت الإكلينيكي. ونحن نعتقد أن من خلال فهم ومن ثم معالجة هذه التغييرات تحت الإكلينيكي، سيتحسن تعديل المرض بشكل كبير. نقدم هنا نموذجا يسمح للكشف عن عيوب الحركة الخفيفة التي قد تساعد في فهم مرور من &quot;سابق للأعراض لأعراض&quot; من أمراض الاعصاب باستخدام نموذج ذبابة الفاكهة. وقد استخدمت العديد من المجموعات مسافة التسلق قصيرة (5-10 سم)، ولكن، قمنا بزيادة المسافة إلى 17.5 سم كما هو الحال في بالادينو وآخرون. 20. على الرغم من هذا الاختلافبين مرتفعات تسلق قد تبدو بسيطة، كان المقصود من الزيادة في الارتفاع إلى زيادة صعوبة الاختبار، مما يساعد في التعرف على العيوب تسلق طفيفة نسبيا. أيضا، اختارت بعض الطرق لإلقاء الضوء على رأس الاسطوانة مع مصباح الألياف الضوئية، للاستفادة من الاستجابة phototaxic من الكبار ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، يمكن للمصدر الضوء يسبب انعكاس الضوء داخل الاسطوانة. وبالتالي، يتم استخدام النفقات العامة مصدر منتشر ضوء الفلورسنت بدلا من ذلك. بالإضافة إلى ذلك، طفرة في الجينات المسؤولة عن التنكس العصبي قد تؤثر على وظيفة العين وبالتالي انحياز النتائج. الزيادة في حجم العينة 10-20 الذباب يزيد من القدرة الإحصائية من كل محاكمة. في البداية، قمنا بزيادة هذا العدد ليصل الى 30 الذباب، ولكن خفضت في وقت لاحق من أجل تقليل الازدحام والتفاعل بين آثار الذباب. يتم تجاهل العينات بعد استخدام مرة واحدة، بدلا من أن يستمر لمدة أربع تكرار التجارب لكل عينة، للقضاء عossibility التعلم أو التعب. بسبب الذباب مع فقر مدقع أداء التسلق، وكان يأتي بنتائج عكسية لتسجيل الوقت اللازم ل50٪ من الذباب لعبور خط الهدف لأنه يمكن أن يستغرق وقتا طويلا لهذه المعايير التي ينبغي الوفاء بها. بدلا من ذلك، أعطيت الذباب مدة 2 دقيقة لعبور خط المرمى. تم تسجيل عدد من الذباب لعبور الخط واهمال في الزيادات من 10S، وأعربوا عن القيمة الناتجة كنسبة مئوية. هذه الشروط هي إنشاء تقييم أكثر حساسية من قدرات التسلق ذبابة الكبار. في حين تصاميم أخرى للمقايسة لا تزال مفيدة، ويمكن اعتبار هذا النموذج في الحالات التي يتم التحقيق فيها عيوب مبكرة خفيفة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار قد تساعد في الكشف عن التغيرات الصغيرة في سياق محاكمات المخدرات. قضية مهمة هي أن السلوك انجذاب بالجاذبية سلبي يقوم على الذباب يجري استغلالها في الجزء السفلي من الاسطوانة. فمن therefخام هامة لتقييم أشكال أخرى من الحركة، مثل على سطح مستو أو رحلة. جوانب أخرى مثل التحفيز والتفاعل الاجتماعي لا بد من اعتبار نخلط المحتملين. التحذير الآخر هو أن الفحص قدم يسمح واحد فقط لتقييم الحركة في الذباب الكبار. وهذا يحد من القدرة على الحصول على إرتباطات عصبية مرضية للسلوك لاحظ وهو أمر مهم جدا في فهم الآلية المرضية للمرض. في الواقع، وقد تم ذلك معظم أعمال التصوير العصبي في يرقة الوصل العصبي العضلي حتى الآن في ذبابة الفاكهة. الحصول على سلوك الحركة في يرقة قد تكون خطوة هامة من أجل رسم علاقة مباشرة بين السلوك والتغيرات المرضية. من المهم جدا للسيطرة على درجة الحرارة والرطوبة التي تربى الذباب واختبارها. بالإضافة إلى التأثير على تطور ذبابة، كان لهذه العوامل أثر هام على قدرة التسلق من الذباب المطروحة وتخزينها في ظروف غير مثالية. في صresence من زيادة الكهرباء الساكنة أو الرطوبة، لم الذباب لا تؤدي على النحو الأمثل. وكان هذا التأثير لا يساوي لجميع المورثات، متحولة الذباب عادة يجري أكثر تأثرا بهذه العوامل من الضوابط. بالإضافة إلى ذلك، تحتاج اسطوانات لغسلها وتجفيفها بشكل صحيح بين كل تجربة.

يتم التعرف على الاضطرابات العصبية المدمرة مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري، والشلل النصفي التشنجي وراثي على نحو متزايد. لسوء الحظ، فإن معظم هذه الاضطرابات العصبية لا تزال دون معالجة. الاستخدام السريري على نطاق واسع، الاختبارات الجينية مشاركات الجينوم على نطاق مثل كله التسلسل exome أدى إلى تزايد عدد الجينات بالتورط في الاضطرابات قاطرة الإنسان. على الرغم من هذا التقدم، والتقدم المرضي من أوائل حتى مراحل متأخرة، لا يزال بعيد المنال في هذه الاضطرابات. يوفر ذبابة الفاكهة واحدة مع الأدوات الوراثية لدراسة متطلبات الجين بطريقة المكانية والزمانية التي تسيطر عليها. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت ذبابة الفاكهة مفيد في فحص المخدرات لظروف عصبية مثل الشلل الرعاش 1، 2 مرض الزهايمر أو الإعاقة الفكرية 3،4 5،6 والصرع وغيرها. كان هدفنا لتطوير فعالة من حيث التكلفةوفحص موثوق بها من شأنها أن تسمح تحليل الإنتاجية العالية التي من شأنها أن تكون لا تزال حساسة بما يكفي للكشف عن تغيرات صغيرة في الأداء الحركي. هناك عدة فحوصات تستخدم لتحديد آثار الطفرات الوراثية و / أو الظروف البيئية على السلوك تسلق ذبابة الفاكهة. معظم المقايسات الاستفادة من الميل الطبيعي للذباب في الصعود، والمعروفة باسم انجذاب بالجاذبية السلبية، أو فحص التسلق. بنزر 7 اقترح في عام 1967 أن جهاز مكافحة الحالية المستخدمة لدراسة انجذاب ضوئي ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة gravitaxis. ومنذ ذلك الحين، Ganetsky 8 وغيرها الكثير 9 -12 قد بنيت على فحص الأولي. المبدأ هو وضع عدد معروف من الذباب في قارورة والاستفادة من قنينة بقوة ضد سطح صلب، مما تسبب في الذباب ان يسقط الى أسفل القارورة. كما هو سلوك فطري، فإن الذباب تحاول الصعود إلى أعلى القارورة، بدلا من الجاذبية. هذا الاختبار هو الكمي وmeasuوارتفعت الدقة كم عدد الذباب الماضي علامة على القارورة خلال فترة الوقت المحدد. أصبح قياس سرعة بدلا من العدد الكلي للذباب تسلق معلمة موثوقة وأظهرت عيوب في الحالات التي يكون فيها عدد من المعايير الذباب ليس كبيرا (13). وقد أثبت الفحص تسلق مفيدة في دراسة العديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون 14. ومع ذلك، لاحظنا أن العيوب قاطرة قد لا تكون قابلة للكشف في وقت حيث ينظر التنكس العصبي بالفعل في دراسات باثولوجية 14. وبالتالي، استخدام الفحص التقليدي قد تحد من القدرة على دراسة المراحل المبكرة من المرض والتسبب. ظهور عيوب قاطرة خلال مراحل لاحقة من أمراض قد تعكس مرض الذي تقدم هو متقدمة جدا لإنقاذ كاملة. هذا يثير مشكلة محتملة مع حساسية مقايسة تسلق التقليدي. عدم القدرة المحتملة للالتقليديينtional تسلق فحص للكشف عن العيوب قاطرة خفيفة ويمكن أن يعزى إلى الارتفاع الذي يطلب فيه من الذباب في الصعود. التقليدية التدابير فحص 15،16 عدد من الذباب لتسلق بنجاح على ارتفاع 2-5 سم في 10 إلى 20 ثانية.

<table><tbody><tr><td>Drosophila stocks</td><td></td><td></td><td>The stocks are selected depending on the experiments. The temperature and humidity in the room and in the incubator must be controled and consistent to avoid flies being too staticky or too wet.</td></tr><tr><td>Video camera</td><td></td><td></td><td>Any digital camcorder will do. Make sure they can focus on close object.</td></tr><tr><td>Graduated cylinder</td><td>Kimble</td><td>20028W</td><td>Different models of graduated cylinder may have different diameter. It is therefore imporant to measure the height.</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td>Any model will do. We used the computer to monitor the climbing of the flies and record the number of flies at each time point.</td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of climbing defects in a drosophila model of neurodegenerative disorders

عيوب الحركي الناتجة عن الاضطرابات العصبية يمكن أن يكون أحد أعراض ظهور المرض في وقت متأخر، بعد سنوات من الانحطاط تحت الإكلينيكي، والاستراتيجيات العلاجية الحالية وبالتالي ليست شافية. من خلال استخدام كامل تسلسل exome، وقد تم تحديد عدد متزايد من الجينات تلعب دورا في الحركة البشري. على الرغم من تحديد هذه الجينات، فإنه ليس من المعروف كيف أن هذه الجينات هي الحاسمة لسير قاطرة العادي. ولذلك، فإن فحص موثوق بها، التي تستخدم الكائنات نموذج لتوضيح دور هذه الجينات من أجل تحديد أهداف جديدة للالفائدة العلاجية، هناك حاجة أكثر من أي وقت مضى. لقد قمنا بتصميم نسخة توعيتهم للمقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية التي تسمح للكشف عن العيوب أكثر اعتدالا في وقت سابق، ولديه القدرة على تقييم هذه العيوب بمرور الوقت. ويتم تنفيذ في كوب فحص تخرج اسطوانة، التي أغلقت مع فيلم الحاجز الشمع. عن طريق زيادة المسافة عتبة للتسلق إلى 17.5 جم وزيادة مدة التجربة لمدة 2 دقيقة لاحظنا وجود حساسية أكبر في الكشف عن الخلل التنقل خفيفة. ويكلف فحص فعال و لا يتطلب تدريبا مكثفا للحصول على نتائج استنساخه للغاية. وهذا يجعل من تقنية ممتازة لفحص المخدرات مرشح في المسوخ ذبابة الفاكهة مع عيوب الحركة.

تسلق هو سلوك قوي وقابلة للتكرار. في الواقع، في يوم من الأيام القديمة الذباب من النوع البري تصل إلى أداء تسلق مسافة الهدف بسرعة (25-30 ثانية). الذباب متحولة تمثل مجموعة من الأداء بين معتدلة (أو تأخر) لإكمال عدم القدرة على الصعود إلى الهدف. نحن لتوضيح هذا هنا مع اثنين من الأليلات الطافرة مختلفة. أول واحد هو أليل شديد في spastin الجين عن طريق الحذف الكامل للجين spastin (المنتجعات 5.75) 18. في هذا الخط (المنتجعات 5.75 مع TM6b) يوم واحد الذباب القديمة لا تصل WT أداء تسلق حتى بعد 2 دقيقة. ويعرض هذا الخط متحولة مع عيوب شديدة حتى عند استخدام الأسلوب قارورة (الشكل 1A، B). الاستفادة من الطريقة المعروضة هنا يصبح أكثر وضوحا عند دراسة متحولة لنفس الجين ولكن مع حذف ناقصة نشرت من قبل نفس المجموعة (المنتجعات 17-7 مع TM3) 18. في هذا الأداء حالة ما يصل إلى 8 أيام من الطبيعي (الشكل 1C-F </s<html> ترونج&gt;). في 8 أيام، تلك الذباب تعرض لاحظ وجود خلل في تسلق إلى أن تكون خفيفة ولكنها مهمة في طريقة اسطوانة ولكن ليس في طريقة قارورة لنفس العدد من التكرار. هذا قد يوحي بأن باستخدام أكبر مسافة الهدف يسمح للكشف عن عيوب في المسوخ أقل حدة. اختيار الضوابط المناسبة وراثيا يضمن أن التأثير هو نتيجة التعبير المعدلة وراثيا (الشكل 3) أو التفاعل الوراثي. لمزيد من الإثبات، وتشمل إنقاذ النمط الظاهري السلوكي مع التعبير عن بروتين من النوع البري لجين دراستها. للدراسات التفاعل، مقارنة الذباب التي هي متخالف لكل من الطفرات في المصالح مع الذباب الذي لا تملك إلا طفرة واحدة من الفائدة. كما يسمح للفحص واحد لمراقبة تطور الخلل التسلق على مر الزمن، جانبا هاما في نمذجة اضطرابات الحركي التقدمية (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، 2 دقيقة تسمح لرؤية أفضل تطور تسلق في المسوخ شديدة. الحمار = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig1.jpg" /> الشكل 1. مقارنة المقايسات تسلق مختلفة للحصول على طفرات حادة يمكن أن ينظر إلى درجات مختلفة من تسلق عيب باستخدام أساليب مختلفة ولكن الطفرات أكثر اعتدالا قد لا يتم الكشف مع بعض المقايسات. لشرح هذا استخدمنا خطين متحولة تنشر لspastin الجينات: spastin 5-75 الذي يحتوي على الحذف الكامل للجين spastin وspastin 17-7 والذي يحتوي على حذف جزئية من الجين spastin (A) أولا، ويتم تقييم التسلق من خلال وجود الذباب تسلق إلى أعلى قارورة فارغة الغذائية. يتم تسجيل عدد من الذباب في الجزء العلوي بعد 18 ثانية. باستخدام هذا البروتوكول يعتبر عيب كبير في Spast 5-75 / TM6b بالمقارنة مع من النوع البري الضوابط (N = 10، ع &lt;0.001). (B) المقبل، وتسلق الأداء وتقييمها باستخدام الأسلوب هو موضح هنا. هو D أيضا تسلق<html> efective في في نفس النمط الجيني Spast 5-75 / TM6b. الفرق في الأداء مهم للغاية (N = 5، ص &lt;0.001)، ولكن الفجوة في الأداء هو أكبر. للطفرات تبين أن لها أقل تأثير الفكر (على سبيل المثال، Spast 17-7 يحتوي على حذف جزئية من الجينات spastin)، وطريقة اسطوانة المقدمة هنا قد تكون أكثر حساسية. (C) ويلاحظ وجود خلل كبير مع 3 أيام من العمر spast 17-7 لوحظ / TM3 مع أسلوب قارورة (N = 5). (D) لا عيب كبير مع 3 أيام من العمر spast 17-7 / TM3 مع أسلوب اسطوانة (N = 5). (E) ويلاحظ وجود اتجاه غير الإحصائي مع 8 أيام من العمر spast 17-7 / TM3 الذباب (N = 5). (F) ولكن لوحظ أهمية لمدة 8 أيام من العمر spast 17-7 / TM3 اختبار مع أسلوب اسطوانة قدمت لنفس العدد من مكررات (N = 5، ص &lt;0.001).r يمكنك الحصول = &quot;_ فارغة&quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig2.jpg" /> الشكل 2. تمثيل تخطيطي للالتجريبية اقامة. تندس 20 الذباب في اسطوانة زجاجية ثم توج مع فيلم الحاجز الشمع. ثم يتم استغلالها الذباب الى الاسفل، وعدد من الذباب عبور خط الوسط وتسجيلها باستخدام كاميرا لمدة 120 ثانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52741/52741fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig3.jpg" /> الشكل 3. ممثل النتائج من تجربة تسلق الجبال. نسبة الذباب بعد أن مرت ويمثل خط عتبة كل 10 ثانية على duratiعلى الفحص. في هذه التجربة، 3 الضوابط المناسبة وراثيا (البرية من نوع والمنتجعات UAS -RNAi / +، Elav-GAL4 / +) وبالمقارنة مع الذباب المعدلة وراثيا تحتوي على كل مكونات GAL4 (المنتجعات Elav-GAL4 / UAS -RNAi) UAS و. وUAS المنتجعات رني هو من VDRC # 108739. هذا التمثيل يسمح لتقييم معدل التسلق لكل الوراثي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52741/52741fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52741/52741fig4.jpg" /> الشكل 4. الرسم البياني الممثل الشخصي للشيخوخة. ومنذ العديد من الاضطرابات قاطرة تقدمية، من المهم أن يصور تطور مع مرور الوقت. في هذا الرسم البياني، تتم مقارنة الذباب WT إلى المسوخ متخالف (منتجعات / WT) والمسوخ عبر متخالف (spast5-75 / spast17-7) في 2 أيام (A) و 8 أيام (B)(N = 10، ع &lt;0.001). وصفت النتائج أيضا على مر الزمن ل120 ثانية. نقطة زمنية (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52741/52741fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders at JoVE.com

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

quantitative-analysis-climbing-defects-drosophila-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.6K Views.  University of Alberta. We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets. 

Video: Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

يعاير الحركي ، والتعلم ، والذاكرة في العجز ذبابة الفاكهة نماذج من تنكس عصبي

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Genetics

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. To understand the mechanism of these cellular events, and their causal relationships with each other, Drosophila melanogaster, with its sophisticated genetic tools and diverse behavioral features, are used as disease models for assessing neurodegenerative phenotypes. Here we describe a high-throughput method to analyze Drosophila adult negative geotaxis behavior, as an indication for possible motor defects associated with neurodegeneration. An automated machine is designed and developed to drive fly synchronization using an initial electric impulse, later allowing the recording of negative geotaxis behavior over a course of secs to mins. Images from the digitally recorded video are then processed with the self-designed RflyDetection software for statistical data manipulation. Different from the manually controlled negative geotaxis assay based on single fly, this precise, fast, and high-throughput protocol allows data acquisition from more than hundreds of flies simultaneously, providing an efficient approach to advance our understanding in the underlying mechanism of locomotor deficits associated with neurodegeneration.

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

This step-by-step protocol analyzes Drosophila negative geotaxis behavior using an automated multi-cylinder system that hosts hundreds of flies and synchronizes their action by an electric motor. Upon synchronization, fly negative geotaxis behavior is assayed, digitally recorded, and analyzed using the self-designed RflyDetection software.

فحص الآلي سريع جيوتاكسيس سلبية متكررة لتحليل سلوك التسلق الكبار في نموذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

Behavior

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

تقييم الظواهر الاعصاب في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

تقنية بسيطة لفحص النشاط الحركي في ذبابة الفاكهة

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

كتلة الأنسجة لتحديد تنكس عصبي في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

التحليل الكمي لتعقيد أربوريزاتيون الجذعية العصبية في المورفولوجية

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biology

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

تصور الانحطاط متشابك في دروسوفيليا الكبار بالاشتراك مع التنكس العصبي

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video