هذه الطريقة توفر أداة هامة في مجال تعديل البروتين، مما يتيح جيل سهلة وفعالة من اقترانات المخدرات المضادة للجسم. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي سهولة التعامل مع, الغلة العالية لإنتاج الأجسام المضادة, سرعة رد فعل psychodision, واستقرار الربط شكلت. ابدأ هذا الإجراء بالخلايا المعلقة المبينة في بروتوكول النص.
عندما يتم الوصول إلى كثافة 2.5 مليون خلية لكل ملليلتر ، قم بإعداد محلول جديد من مشتق السيكلوبروبين من اليزين ، أو CPK ، في هيدروكسيد الصوديوم الضرس 1. إضافة 2.5 ملليلتر من CPK إلى متوسطة التعبير تكملها المضادات الحيوية. اخلطي المحلّل جيداً وأضفي 250 ميكرولترات من حمض هـكـل واحد، ثمّ قم بتعقيم المحلّل باستخدام فلتر 22 ميكرون.
الآن جهاز طرد مركزي 125 مليون خلية في الكثافة المستهدفة لمدة خمس دقائق في 500 x ز. بعد الطرد المركزي، إضافة خليط كاشف الحمض النووي-نقل إلى وسيط التعبير التي تحتوي على CPK واستخدام هذه الوسيلة لإعادة تعليق الخلايا. بعد ستة إلى سبعة أيام بعد إضافة CPK، حصاد trastuzumab تحمل الأجسام المضادة CPK من طاردة عن طريق الطرد المركزي للخلايا لمدة 15 دقيقة في 3، 000 x ز.
ثم، تصفية المناط. الآن إضافة 5x حبة غسل العازلة في 250 ملليلتر أنابيب مخروطية وخلط مع السوبر وإضافة البروتين A الراتنج. ضع الأنبوب المخروطي على الأسطوانة لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة لسحب الجسم المضاد والسوبر.
بعد الحضانة، ونقل البروتين A الراتنج مع سوبرنات في عمود والسماح للسوائل بالتدفق من خلال. ثم إضافة 25 ملليلتر من العازلة غسل والسماح التي تتدفق من خلال. إضافة ملليلتر واحد من واحد عازلة فوسفات مولر، 150 ملليمولار كلوريد الصوديوم إلى أنبوب جمع وerute الأجسام المضادة مع أربعة ملليلتر من 1 ضرس الصوديوم citrate 3.
يتم تحييد الحل الحمضية على الفور لأنها تأتي من العمود من قبل الحل الأساسي الموجود بالفعل في أنبوب جمع. بعد ذلك ، تمييع الجسم المضاد مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. تركيز الأجسام المضادة إلى 5 إلى ملليلتر واحد عن طريق الترشيح الطرد المركزي وتبادل العازلة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
تنقية العينات بواسطة FPLC باستخدام عمود تفاعل بوتيل ماء مع صفر إلى 100٪ تدرج من العازلة الملح المنخفضة في العازلة الملح عالية على مدى 30 دقيقة. جمع كل الكسور ورصد elution في 280 نانومتر. تركيز الكسور التي تحتوي على الأجسام المضادة عن طريق الترشيح الطرد المركزي وتبادل العازلة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
ويمكن بعد ذلك تخزين الأجسام المضادة عند أربع درجات مئوية. monomethyl Auristatin E، أو MMAE، هو شديد السمية. لذلك، استخدم القفازات والنظارات الواقية عند التعامل مع مشتقات MMAE.
إذا كنت تستخدم MMAE غير معدلة كتحكم، معالجة المنتج الصلبة داخل غطاء أبخرة عند إعداد حل الأسهم في MSO. لمقارنه الأجسام المضادة مع tetrazine تحمل جزيء، تمييع 10 معادلة المول من tetrazine MMAE لكل جسم مضاد مع 20 ميكرولترات من الأسيتونيتريل و 76 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني في أنبوب مخروطي صغير. إضافة ما يعادل واحد الضرس من trastuzumab تحمل CPK.
اخلطي جيداً واسمحي بالتفاعل لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة لتكوين trastuzumab مرتبط بـ MMAE. يمكن ربط جزيئات أخرى غير MMAE يحتمل أن تكون أكبر وأكثر إعاقة من الناحية النجمية بالجسم المضاد باستخدام هذا البروتوكول. أضف حجم التفاعل بالكامل إلى عمود الدوران والطرد المركزي عند 1500 × g لمدة دقيقة واحدة.
لتحليل المترافق، قم بتكبيل عمود HPLC HIC مع 100٪ من احتياطي الملح العالي لمدة خمس دقائق. ثم مزيج 15 ميكروليتر من واحد مليغرام في ملليلتر حل من trastuzumab مرتبطة MMAE مع 15 ميكروليتر من 2X العازلة الملح العالي في القارورة. حقن الخليط على العمود HPLC.
Elute في تدفق ملليلتر واحد متساوي الوقراطية في الدقيقة مع 100٪ من الملح العازلة لمدة دقيقة واحدة. اتبع هذا مع تدرج 15 دقيقة من 100 إلى صفر في المئة من العازلة الملح عالية في المخزن المؤقت الملح المنخفض. رصد elution في 280 نانومتر.
دمج القمم على الكروماتوغرافية مع أوقات الاحتفاظ من 7.5 و 9.2 و 11.5 دقيقة، والتي تتوافق مع trastuzumab مع صفر، واحد، واثنين من السموم المقترنة، على التوالي. الآن، حساب DAR عن طريق إضافة ما يصل مناطق القمم في 9.2 دقيقة، والتي وزنها واحد، و 10.5 دقيقة، والتي وزنها اثنين، وتقسيمها على المساحة الإجمالية للذرات الثلاث. لتحليل المترافق من قبل LC-MS، أولاً، deglycosylate 30 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر ADC والأجسام المضادة غير المعدلة في ظروف غير خفض باستخدام 250 وحدة من PNGase F لمدة ست ساعات على الأقل في 37 درجة مئوية.
اذيب المصل وتصفية من خلال مرشح 22 ميكرون. ثم املأ الآبار الخارجية لطبقة 96 بئر بالماء. في الآبار المركزية، تخلط في ثلاثية 90 ميكرولترات من المصل مع 10 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر تراستوزوماب رباعيmethylrhodamine في برنامج تلفزيوني بتركيز نهائي من 1 ملليغرام لكل ملليلتر.
ضع الطبق في حاضنة مشبعة بالرطوبة عند 37 درجة مئوية و4 في المائة من ثاني أكسيد الكربون. كل 24 ساعة على مدار خمسة أيام، ماصة كل جيدا جيدا لخلط واتخاذ خمسة aliquot ميكرولتر. فلاش تجميد aliquot مع النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجة مئوية.
بمجرد جمع جميع العينات، اذيب aliquots وتحليل باستخدام ELISA غير مباشر، كما هو مفصل في بروتوكول النص. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام مجموعة ELISA التجارية لقياس تركيز ADC. قبل يومين من الفحص، قم بملء الآبار الخارجية لطبقة 96 بئر بالماء.
ثم رفع الخلايا مع 05٪ التربسين في 5 ملليمولار EDTA. الطرد المركزي الخلايا ثلاث دقائق في 250 × ز وإعادة تعليق في وسط جديد. ثم البذور 3،000 الخلايا في 100 ميكرولترات في بئر 96 لوحات جيدا ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.
بعد يومين من بذر الخلايا، وإعداد التخفيفات التسلسلية من جميع العينات في ثلاثية مع 1٪ DMSO في المتوسط الكامل. الآن إضافة 100 ميكرولترات من كل عينة في كل بئر واحتضان لمدة خمسة أيام في 37 درجة مئوية و 4 في المئة ثاني أكسيد الكربون. في اليوم الخامس، قياس صلاحية الخلية.
وتحقيقا لهذه الغاية، واستخدام مجموعة تجارية لlyse الخلايا وقياس ATP صدر. رسم النسبة المئوية للإشارة فيما يتعلق بالخلايا التحكم تعامل مع 1٪ DMSO. يمكن احتضان ADCs عند 37 درجة مئوية لمدة خمسة أيام في المصل ومُحَسَّنًا من أجل السمية الخلوية لإثبات الاستقرار الوظيفي.
ويمكن الحصول على جسم مضاد مع مقبض السيكلوبروبين باستخدام هذا الإجراء مع غلة أعلى من 20 ملليغرام للتر الواحد بعد بروتين تنقية. يمكن أن يكون الجسم المضاد المنتجة بسرعة والموقع على وجه التحديد مترافقة إلى سم يحمل تترازين. عند اقتران الجسم المضاد بسم، يبلغ متوسط نسب الأدوية إلى الأجسام المضادة 1.9، كما يقاس بالتفاعل الوريموغرافيا.
يتم تأكيد هوية ADC بواسطة قياس الطيف الكتلي. السندات dihydropyridizene ولدت مستقرة في مصل الإنسان لأكثر من خمسة أيام في 37 درجة مئوية. إن عقار المضاد هو مركب قوي ويقتل بشكل انتقائي الخلايا ذات المستويات العالية من HER2 ، بدلاً من الخلايا ذات المستويات المنخفضة من HER2.
وعلاوة على ذلك، فإن الأجسام المضادة دون السم والسموم المعدلة مع رابط tetrazine لديها سمية منخفضة جدا. السم وحده يظهر السمية غير معتمدة HER2 تسليط الضوء على الحاجة إلى استهداف لتحقيق الانتقائية. بعد هذا الإجراء ، يمكننا إعداد مضادات الأجسام المضادة بشكل سريع وفعال لعلاج الأورام.
يحتمل أن يكون أي دواء وظيفيا مع tetrazine مرتبطة بأي جسم مضاد يستهدف علامة بيولوجية خلية سرطانية. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى أي البروتين المتقارن المقصود للعلاج أو التشخيص.
