الكتاب يود أن يشكر مكتب البريد البكالوريا علماء البرنامج ومعاهد نوفارتيس "البحوث الطبية الحيوية" ككل من أجل تمويل هذه الدراسة.

1-إعداد الخلايا
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول، بما في ذلك توليد البيانات، الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع باكولوفيروس ترميز الخلايا NR1 و NR2A.
<ol><li>البذور عدد مناسب من الخلايا HEK293 وإضافة NR1 و/أو NR2A الفيروس بتركيزات النهائية المناسبة (1.00 ميليلتر في كل). لوحة 384، حسنا، استخدم 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر.</li>
	<li>وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا HEK293-NR1-NR2A في الخلية المناسبة عدد وحجم (للوحة 384، حسنا، استخدام 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر). إضافة التتراسيكلين بتركيز 2 ميكروغرام/مل للحث على التعبير NR2A وإضافة حماية مجمع (100 ميكرومتر MDL105، 5 ميكرومتر CGP07066724أو 519).</li>
	<li>ملاحظة: يجب أن يكون باكولوفيروس ترميز NR1 و NR2 عيار تقريبي بين 5 × 109 -10 × 109 وحدة المعدية كل المليلتر24.</li>
</ol>2-قياس نشاط مستقبلات NMDA
<ol><li>إعداد لوحة 384-جيدا مع الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع خلايا NR1/NR2 أو HEK293-NR1-NR2A حضور أما الحماية المركبة. استخدام أسفل واضحة، والإطار الأسود، لوحة بولي-د-يسين المغلفة. ملاحظة: حماية مع 100 ميكرومتر ويستخدم MDL105، 519 يضفي حساسية جليكاين، بينما 5 ميكرومتر CGP070667 يستخدم لإضفاء التجاوب غلوتامات.</li>
	<li>احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها).</li>
	<li>إزالة اللوحة من الحاضنة ولطف تجاهل وسائل الإعلام الخلية بإبطاء تنقلب اللوحة حاوية بيوواستي متوافقة. اضغط برفق لوحة على منشفة ورقية لتنظيف وسائل الإعلام خارج حواف اللوحة واستنزاف أي وسائط الإعلام المتبقية.</li>
	<li>إعداد calcium6-الصبغة قبل سولوبيليزينج قنينة واحدة من صبغة calcium6 (حجم لوحة 1) في 10 مل من حضانة المخزن المؤقت (حبس pH 7.5، 20 مم حبيس، 1 مم مجكل2، البروبينسيد 1 مم). احتضان اللوحة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.</li>
	<li>إزالة اللوحة من الحاضنة والسماح للخلايا ضبط درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>صب بلطف calcium6 الصبغ كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وإضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للفحص (حبس pH 7.5، 20 مم حبيس، 1.8 مم كاكل2، البروبينسيد 1 مم).</li>
	<li>كرر الخطوة 2.6 مرتين لمجموعة من يغسل 3. ترك 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للفحص على الخلايا بعد الغسيل الأخير.</li>
	<li>السماح للخلايا الراحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعداد لوحة يجند بجعل مخزون النوبات من 400 ميكرون جليكاين و 400 ميكرون غلوتامات (التركيز النهائي من 100 ميكرومتر؛ تركيز الأمثل من يغاندس يحدد كما هو موضح أدناه). تحويل الحد أدنى من 25 ميليلتر من الأسهم يجند إلى الخامس-أسفل لوحة 384-جيدا.</li>
	<li>تحميل لوحة يجند ولوحة الخلية في فدس (نظام فحص المخدرات الوظيفية).</li>
	<li>قياس fluorescence خط الأساس (وس) من لوحة الخلية لمدة 30 ثانية. نقل 10 ميليلتر من رصيد يجند في لوحة الخلية باستخدام الدالة الاستغناء عن فدس وقياس تدفق الكالسيوم عن طريق تسجيل الأسفار صبغ calcium6 لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>حساب نسبة الأسفار القصوى بتقسيم الأسفار القصوى التي حصل عليها الأسفار خط الأساس (و/Fماكسس).</li>
</ol>3-الاستفادة المثلى مستويات التعبير نمدار
<ol><li>لتحديد مقدار باكولوفيروس لاستخدام الأمثل، إجراء معايرة للفيروسات NR1 و NR2A على حد سواء. إعداد لوحة 384-جيدا مع خلايا HEK293 (التوصية 10,000 الخلايا/بئر، 30 ميليلتر لوسائط الإعلام) وتشمل مركبات الحماية كما هو موضح في الخطوة 2، 1.</li>
	<li>إضافة كميات مختلفة من الفيروس NR1 في صفوف مختلفة من اللوحة (على سبيل المثال: إضافة 0 ميليلتر، ميليلتر 2، 1 ميليلتر، 0.5 ميليلتر، ميليلتر 0.25 في صفوف ألف إلى هاء على التوالي). إضافة تكرارات لدقة البيانات.</li>
	<li>إضافة كميات مختلفة من الفيروس NR2A في أعمدة مختلفة من اللوحة (على سبيل المثال: إضافة 0 ميليلتر، ميليلتر 2، 1 ميليلتر، 0.5 ميليلتر، ميليلتر 0.25 في صفوف ألف إلى هاء على التوالي). إضافة تكرارات لدقة البيانات.</li>
	<li>احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها).</li>
	<li>تحديد نسبة مثلى وكمية من الفيروسات NR1، و NR2A عن طريق إجراء قياس تدفق كالسيوم في فدس (انظر أعلاه).</li>
</ol>4-يجند المعايرة
<ol><li>إعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2، 3.</li>
	<li>إعداد تخفيف ليجند كل حضور تشبع تركيزات (100 ميكرومتر) من يجند الأخرى كحل أسهم النوبات. فعلى سبيل المثال: لتركيز اختبار نهائي 10 ميكرون من جليكاين، إعداد حل جليكاين بما في ذلك 400 ميكرون غلوتامات أسهم 40 ميكرومتر.</li>
	<li>المضي قدما بقياس فدس كما هو موضح في الخطوة 2.11.</li>
</ol>5-مجمع اختبار
<ol><li>إعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.</li>
	<li>إعداد لوحة يجند مع أسهم 5 إضعاف تركيز يجند النهائي في المخزن المؤقت للمقايسة.</li>
	<li>إعداد لوحة المركبات مع الأسهم النوبات التركيز النهائي المطلوب للمركبات في المخزن المؤقت للمقايسة. لتركيز مركب نهائي من 10 ميكرون في المخزن المؤقت للمقايسة، تعد حلاً أسهم 40 ميكرومتر.<ol>
<li>يبقى تركيز ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ثابت عبر كافة العينات بإعداد إضعاف ما قبل المجمع في [دمس] قبل المزيد من إضعاف في المخزن المؤقت للمقايسة.</li>
		<li>لاستجابة جرعة من المجمع في التحليل النهائي تتراوح ما بين 3 و 30 ميكرون، وإعداد إضعاف ما قبل المجمع في [دمس] تتراوح بين 1 إلى 10 مم. إضعاف تلك الموجودة في المخزن المؤقت المقايسة لتركيز المخزون النوبات. التركيز [دمس] النهائي ينبغي أن لا تتجاوز 0.5%. ملاحظة: من المستحسن اختبار كل عينة في تريبليكاتيس.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحميل يجند ومجمع، ولوحة الخلية في فدس.</li>
	<li>قياس fluorescence الأساس لمدة 30 ثانية.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر من الأسهم المركب وقياس الأسفار لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>إضافة 10 ميليلتر من الأسهم يجند وقياس الأسفار لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>تحديد متكاملة لنسبة الأسفار عن طريق حساب المنطقة تحت المنحنى نسب الفلورسنت خلال آخر 5 دقائق للقياس. ملاحظة: بدلاً من ذلك، نسبة الأسفار بعد إضافة يجند القصوى يمكن استخدامها لتحليل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li><li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders.">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li><li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases.">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li><li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunit+diversity:+impact+on+receptor+properties,+synaptic+plasticity+and+disease.">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li><li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses.">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li><li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil.">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+block+by+Mg2++of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones.">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation.">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li><li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration.">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li><li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95.">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li><li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح وليس للكشف عن.

يعتمد نجاح هذا التحليل إلى حد كبير على صحة الخلايا HEK المستخدمة. الخلايا تشهد نمواً متسارعا وينبغي أن تستخدم بعدد مرور منخفضة. هذا التحليل ينطوي على العديد من عمليات النقل وإضافات حلول، وذلك باستخدام الحذر سوف ضمان دقة أعلى في نتائجه. ينبغي أن تكون تركيزات مركبات وجميع الكواشف الأخرى أيضا ...

مع التقدم الحالي في الطب، ازداد متوسط العمر المتوقع إلى حد كبير؛ ومع ذلك، قد ذلك انتشار الأمراض المرتبطة بالسن. أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) مثل الفصام والتصلب العضلي الجانبي (المرض)، ومرض الزهايمر ومرض باركنسون، بين أمور أخرى، ليست استثناء، وقد كان المتوقع أن تزيد على مدى العقد القادم1، 2 , 3-خلل مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك المعروف باسم N-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (نمدار) ارتبط بمرض الزهايمر والفصام وإصابات الدماغ الرضية، والسكتة الدماغية، والسكري والزرق بين أمور أخرى، مما يستلزم بحاجة إلى دراسة هذه الأحياء لتطوير علاجات فعالة، والمرض--تعديل4،5،،من67.
نمدارس تتألف من أربعة مونومرات أو الوحدات الفرعية4،،من89. ويبين تشكيل الهيكلية نمدار تقلب التنموية والإقليمية داخل المخ7،10. وتشارك نمدارس في اللدونة متشابك، والإدراك، وتوليد إيقاعات للتنفس والحركة11،،من1213. كقناة لبوابات الجهد، إلى حد كبير غير إجراء في استراحة غشاء المحتملة (-70 mV) وتم حظره بواسطة الماغنسيوم لمنع المزيد من تخلل للايونات. القناة يتم تفعيلها من خلال ربط يغاندس اثنين وغلوتامات جليكاين/د-سيرين، وتوسط depolarization متزامنة في الغشاء متشابك مستقبلات امبا، فئة فرعية أخرى من مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك. ديبولاريزيشن يزيل انسداد المغنيسيوم نمدار، تمكين تدفق الاتصالات، لا سيما الكالسيوم14،،من1516. على الرغم من أن تنشيط نمدار ضروري لبقاء الخلية، يمكن أن يؤدي التنشيط المفرط الخلية وفاة17،،من1819 من خلال اكسسيتوتوكسيسيتي. هذا، بالإضافة إلى الطبيعة المعقدة للمستقبلات، يجعل من تحدي لإجراء الدراسات اللازمة لتطوير علاجات فعالة.
وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة نمدار. ومع ذلك، كل واحد لديه المصاحبة للمحاذير. على سبيل المثال، إحدى التقنيات المستخدمة على نطاق واسع هو تحليل القائم على الأسفار الذي يقيس التغيرات نمدار بوساطة في الكالسيوم داخل الخلايا في خط خلية مستقرة تحت سيطرة مروج التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في)20. ومع ذلك، في هذا النظام، سوبراماكسيمال وتركيزات يغاندس مطلوبة وشرط أن مثبطات نمدار موجودة أثناء أخذ القياس يجعل من المستحيل تقريبا للكشف عن النشاط لخصم تنافسية. وفي نظم أخرى مماثلة، يسبب التعبير عن مستقبلات الوظيفية السمية، التي تتطلب محصرات قنوات مثل الكيتامين21،22 الحفاظ على الثقافات الخلية. الجلوس في صميم المستقبلات هذه محصرات قنوات ويصعب أن يغسل بها، لا سيما في شكل لوحة، حيث تتداخل مع الدراسات الفنية للمستقبلات. وأخيراً، في القياسات الكهربية مثل لقط التصحيح، هناك إنتاجية محدودة، ودراسات واسعة النطاق، هي مكلفة جداً23. على الرغم من أنظمة المذكورة أعلاه حساسة لتحفيز جليكاين؛ ومن ثم دراسة جليكاين-تعتمد على نشاط نمدار يصبح تحديا.
وهنا يصف لنا نهجاً جديداً لدراسة نمدار أن يتغلب على القيود التي نوقشت. لدينا أسلوب يستغل نظام التعبير باكولوفيروس للتعبير عن مستقبلات على المستويات الوظيفية مع نسبة مثلى للوحدات الفرعية بأقل قدر من 16 ساعة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام باكولوفيروس لنهج بسيط والتوافقي، الذي يوفر وصفاً واسعة من الأنواع الفرعية نمدار المؤتلف متميزة. وخلافا لفحوصات أخرى، لا يتطلب هذا البروتوكول محصرات قنوات بسبب استخدام الخصوم ضعيفة. ميزة أقوى للأسلوب تبييض بعد ذلك لخصم ضعيف، والمستقبلات حساسة لتحوير مواقع الربط جليكاين وغلوتامات الفردية بالإضافة إلى التعديل المزدوج جليكاين/د-سيرين وغلوتامات ملزم يجند المواقع. ويجمل المقايسة الأدوية المعروفة لمستقبلات نمدار وآثار به المغيرون إيجابية وسلبية معروفة. أخيرا، السمية الخلوية الناتجة عن تدفق الكالسيوم المفرط ويتغلب على توليد هذه في المختبر الخلوية المقايسة ويسمح للدراسات الفنية من المستقبلات في طريقة الفائق، التي يمكن أن تعجل باكتشافات المغيرون نمدار في الحالات المرضية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

ن-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (NMDA) (نمدار) تصنف مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك وأدوار حاسمة في التعلم والذاكرة. عطل نمدار، أعرب أما أكثر-أو وكيل-activity الناجم عن الطفرات، تغيير تعبير أو الاتجار أو التعريب، يمكن أن يسهم في العديد من الأمراض، وبخاصة في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فهم البيولوجيا المستقبلات، فضلا عن تيسير اكتشاف المركبات والجزيئات الصغيرة حاسمة في الجهود المبذولة لمكافحة الأمراض العصبية. النهج الحالي لدراسة المستقبلات لها حدود بما في ذلك انخفاض الإنتاجية والتكلفة العالية وعدم القدرة على دراسة قدراته الفنية نظراً لوجود الضرورة محصرات قنوات للحيلولة دون وساطة نمدار اكسسيتوتوكسيسيتي. بالإضافة إلى ذلك، نظم التحليل القائمة حساسة للتحفيز قبل غلوتامات فقط وتفتقر إلى الحساسية للتحفيز التي جليكاين، يجند المشارك الأخرى نمدار. نقدم هنا، التحليل القائم على اللوحة الأولى مع السلطة الفائق للدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية لكلا يغاندس المشارك وغلوتامات د-سيرين/جليكاين. هذا النهج يتيح دراسة التراكيب وحدة فرعية نمدار مختلفة ويسمح الدراسات الفنية للمستقبلات في أوضاع جليكاين-و/أو الحساسة غلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، الطريقة لا تتطلب وجود مثبطات خلال القياسات. ويمكن الكشف عن آثار المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية مع هذا التحليل والأدوية المعروفة من نمدار تكررت في نظامنا. هذا الأسلوب يتغلب على أوجه قصور الأساليب القائمة، وفعالة من حيث التكلفة. ونحن نعتقد أن هذه التقنية الجديدة سوف تعجل باكتشاف العلاجات للأمراض بوساطة نمدار.

قبل اختبار آثار الجزيئات الصغيرة، واحد يجب أن تحدد مستويات التعبير الأمثل نمدارس، فضلا عن تركيزات يجند الأمثل. كما هو موضح، HEK293 كانت تبذر الخلايا في الخلايا 10,000 كل بئر في صفيحة 384، حسنا، حضور 5 ميكرومتر CGP060667، ثم ترانسدوسيد بمقادير متفاوتة من NR1 و NR2A الفيروسات. تم قياس الجر...

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

مقايسة الفائق كالسيوم-التمويه لدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية جليكاين/د-سيرين وغلوتامات

والهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل دراسة نمدا-مستقبلات (نمدار) على نطاق أوسع، والسماح بدراسة آثار مودولاتوري من الجزيئات الصغيرة وتطبيقاتها العلاجية.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Views.  Novartis Institutes for BioMedical Research. والهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل دراسة نمدا-مستقبلات (نمدار) على نطاق أوسع، والسماح بدراسة آثار مودولاتوري من الجزيئات الصغيرة وتطبيقاتها العلاجية.

Video: A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

طريقة بسيطة لقياس حساسية الايثانول في الذباب

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

ضوء الفحص ميول لدراسة الساعة البيولوجية الفطرية وPhotobehavior الخاضعة للرقابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

الاستجواب وظيفية من الكبار طائية تكوين الخلايا العصبية مع البؤري الإشعاعية تثبيط

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding immunostaining (specifically for ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1), a calcium binding protein expressed by microglia) and tissue processing for electron microscopy (EM). Methoxy-X04 is a fluorescent dye that crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. Injection of the animals with methoxy-X04 prior to sacrifice and brain fixation allows pre-screening and selection of the plaque-containing brain sections for further processing with time-consuming manipulations. This is particularly helpful when studying early AD pathology within specific brain regions or layers that may contain very few plaques, present in only a small fraction of the sections. Post-mortem processing of tissue sections with Congo Red, Thioflavin S, and Thioflavin T (or even with methoxy-X04) can label &#946;-pleated sheets, but requires extensive clearing with ethanol to remove excess dye and these procedures are incompatible with ultrastructural preservation. It would also be inefficient to perform labeling for A&#946; (and other cellular markers such as IBA1) on all brain sections from the regions of interest, only to yield a small fraction containing A&#946; plaques at the right location. Importantly, A&#946; plaques are still visible after tissue processing for EM, allowing for a precise identification of the areas (generally down to a few square millimeters) to examine with the electron microscope.

This article describes a protocol for visualizing amyloid A&#946; plaques in Alzheimer&#39;s disease mouse models using methoxy-X04, which crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. It allows pre-screening of plaque-containing tissue sections prior to immunostaining and processing for electron microscopy.

متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.