تتيح هذه الطرق إجراء تقييم سريع لما إذا كان التلاعب التجريبي أو البروتين المسبب للمرض أو الحمض النووي الريبي يمكن أن يؤثر على العمليات المشبكية ، وما إذا كانت المركبات العلاجية يمكنها استعادة الوظيفة. توفر هذه التقنيات قراءة موثوقة للوظيفة المشبكية من مجموعة من الخلايا العصبية في فترة زمنية قصيرة نسبيا مقارنة بالفيزيولوجيا الكهربية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي مرض من أمراض تطور الخلايا العصبية أو التنكس.
هذا يعمل بشكل جيد مع الثقافات العصبية الأولية للقوارض ، وللخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. للبدء، قم بتحسين إعدادات الحصول على الصور باستخدام برنامج اكتساب التصوير البؤري. حافظ على ثبات وقت التعرض لطاقة الإثارة وكسب الكاشف ومعدل الإطارات عبر جميع العينات.
لتصوير الفاصل الزمني، حدد نسبة عرض إلى ارتفاع تبلغ 512 × 512، ومعدل إطارات يبلغ صورتين في الثانية لتقليل تبييض الصبغة. ثم حدد مجموعات مرشحات الإثارة الفلورية والديكرويك والانبعاثات ل GCaMP ستة M / GCaMP ثلاثة مع صبغة Fitzy و stearoyl مع Trixi. لتجنب انحراف Z أثناء تصوير الفاصل الزمني، استخدم ميزة التركيز البؤري المثالية لبرنامج اقتناء التصوير البؤري.
بعد ذلك ، حدد علامة التبويب الزمنية في لوحة الحصول على الصورة. بالنسبة للمرحلة الأولى ، قم بتعيين الفاصل الزمني 500 مللي ثانية والمدة من ثلاث إلى خمس دقائق. وبالنسبة للمرحلة الثانية ، حدد الفاصل الزمني 500 مللي ثانية والمدة ، خمس دقائق.
ثم لتجميع جهاز تروية الجاذبية للسائل الدماغي الشوكي الاصطناعي أو ACSF ، قم بتحميل المخزن المؤقت ACSF عالي كلوريد البوتاسيوم في حقنة 50 ملليلتر في الجزء العلوي من الجهاز وضبط معدل التدفق على ملليلتر واحد في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتحميل طبق زجاجي سعة 35 ملليلتر يحتوي على خلايا عصبية على مرحلة التصوير البؤري مع وضع نهاية أنابيب التروية على حافة الطبق واختر المجال للتصوير. بعد 48 ساعة من النقل ، احتضن الخلايا العصبية القشرية أو الحركية الأولية في مخزن ACSF منخفض كلوريد البوتاسيوم لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
ثم قم بإزالة المخزن المؤقت عن طريق الشفط واستخدام ماصة ، قم بتحميل الخلايا العصبية في الظلام على طبق بتري ذو قاع زجاجي مملوء ب ACSF يحتوي على 50 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم و 10 صبغة ستيريل ميكرو مولار. بعد خمس دقائق ، قم بإزالة محلول التحميل واستحم الخلايا العصبية في مخزن ACSF منخفض كلوريد البوتاسيوم عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للقضاء على تحميل الصبغة غير المحددة. ثم ضع الطبق على مرحلة التصوير للمجهر البؤري المقلوب وراقب الخلايا تحت هدف هوائي 20 مرة أو هدف غمر الزيت 40 مرة.
قم بإثارة الصبغة الفولاذية باستخدام ليزر 546 نانومتر وجمع الانبعاثات باستخدام مرشح ممر النطاق الترددي 570 إلى 620 نانومتر. بعد اختيار مجال التصوير وجذب التركيز البؤري المثالي، التقط صورة ثابتة واحدة مع قنوات علامات المجال الساطع والتريكسي والتألق لتحديد الحدود العصبية. ثم ابدأ التشغيل الآن في برنامج الاستحواذ وقم بإجراء التسجيل الأساسي لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لاستبعاد الاختلافات في كثافة الصبغة.
مباشرة عند التبديل إلى المرحلة الثانية ، قم بتشغيل زر التشغيل لنظام التروية وقم باستمرار بتوصيل كلوريد البوتاسيوم 50 ملليمولار إلى الخلايا العصبية لتسهيل تفريغ الصبغة. نفذ التسجيلات لمدة خمس دقائق ثم قم بتشغيل مفتاح إيقاف التشغيل لنظام التروية. احفظ التجربة لتحليل البيانات لاحقا باستخدام برنامج confocal .
بعد 48 ساعة من النقل باستخدام GCaMP Six M ، احتضن الخلايا العصبية القشرية للقوارض الأولية مع انخفاض كلوريد البوتاسيوم ACSF لمدة 15 دقيقة. ثم قم بتركيب الطبق على منصة التصوير وتصور GCaMP ستة M التألق باستخدام مرشح Fitzy وهدف 20 مرة أو 40 مرة. بعد اختيار مجال التصوير وجذب التركيز البؤري المثالي، التقط صورة ثابتة واحدة باستخدام قنوات علامة brightfield و Fitzy و fluorescence لتحديد الحدود العصبية.
بعد ذلك ، ابدأ Run Now في برنامج الاستحواذ وقم بإجراء التسجيل الأساسي لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. ثم قم بدمج ACSF الذي يحتوي على 50 مللي مول كلوريد البوتاسيوم إلى الخلايا العصبية كما هو موضح سابقا وسجل لمدة خمس دقائق. عندما يتوقف الحصول على الصورة ، احفظ التجربة وانتقل إلى تحليل البيانات باستخدام برنامج confocal .
لتحليل الصور، افتح صور الفاصل الزمني في البرنامج البؤري وقم بمحاذاة الصور بالنقر فوق صورة، متبوعة بالمعالجة، متبوعة بمحاذاة المستند الحالي، ثم حدد محاذاة إلى الإطار الأول. حدد المناطق ذات الأهمية على طول الخلايا العصبية باستخدام أداة تحديد عائد الاستثمار وحدد أيضا عائد استثمار يمثل كثافة التألق في الخلفية. بعد ذلك ، ابدأ وظيفة القياس من لوحة قياس الوقت لقياس التألق الخام بمرور الوقت لعائد الاستثمار المحدد.
بعد القياس ، قم بتصدير كثافة التألق الخام إلى برنامج جداول البيانات. تظهر هنا الخلايا العصبية القشرية الأولية للفئران المستزرعة المحملة بصبغة الستاريل. تم تحديد خصوصية تحميل الصبغة من خلال وضع العلامات المشتركة مع علامة الحويصلة المشبكية synaptophysin وغالبية البونكتا الإيجابية للصبغة المعقمة إيجابية مشتركة لهذه العلامة.
يكشف تحليل قيم الكثافة الخام على مدار فترة التصوير بأكملها أن المشبك العصبي والشدة لا يزالان ثابتين بينما تنخفض شدة صبغة الستيريل بعد التحفيز. بالنسبة للخلايا العصبية الضابطة المنقولة بالبروتين الفلوري الأخضر ، أدى إطلاق الحويصلة المشبكية بنجاح إلى فقدان مذهل لتألق الصبغة عند إزالة الاستقطاب من كلوريد البوتاسيوم العالي. يظهر هذا الفيديو التمثيلي خلية عصبية تفرغ صبغة الستايريل بشكل انتقائي في منطقة يمين جديدة بعد التحفيز.
في المقابل ، في الخلايا العصبية المنقولة باستخدام C nine ORF 72 المرتبط ببناء تكرار الببتيد الصبغي إلى GA 50 ، يتم تمثيل ضعف الانتقال المشبكي بواسطة فلورة الصبغة المحتفظ بها حتى بعد إزالة الاستقطاب من كلوريد البوتاسيوم العالي. تظهر هنا صور التألق التمثيلية للخلايا العصبية القشرية المنقولة باستخدام GCaMP ستة M قبل وبعد إزالة استقطاب كلوريد البوتاسيوم. تشير زيادة قيم التألق والخلايا العصبية القشرية المنقولة باستخدام GCaMP Six M إلى دخول الكالسيوم إلى الخلايا العصبية بعد إزالة الاستقطاب المستحث بكلوريد البوتاسيوم.
في نهاية فترة تسجيل خط الأساس ، عبرت الخلايا العصبية عن GCaMP ستة M مع تألق منخفض. ثم لوحظت زيادة كبيرة في التألق في بداية التحفيز. تأكد من أن تسجيلات خط الأساس الفلورية لصبغة الستيريل وGCaMP مستقرة.
استخدم دائما التركيز البؤري المثالي لتجنب انحراف الصورة ، مما يجعل معالجة بيانات ما بعد الصورة أمرا صعبا. لا ينصح بمزيد من زراعة الخلايا العصبية ، حيث تتعرض الأطباق للهواء أثناء الغزارة. ومع ذلك ، فإن التلطيخ المناعي أو استخراج البروتين أو الحمض النووي الريبي يمكن أن يقيم الأسباب المحتملة للتغيرات المتشابكة.
