اليمبانوزومات الأفريقية هي المسؤولة عن داء المثقبيات الأفريقي البشري، أو مرض النوم والحيوانية الأفريقية. والمثقبيات التي تسبب مرض النوم هي ذبابة تسي تسي التي تنتقل الطفيليات الموجودة في العديد من البؤر الجغرافية في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى. الكشف عن الطفيلي ضروري للتشخيص والعلاج والمتابعة.
يمكن أن تعطي المصلية إيجابية كاذبة ولسوء الحظ، نتائج سلبية كاذبة. للمساعدة في الكشف في الدم، يجب أن تتركز المثقبيات. وقد استخدمت تقنيات تركيز الطفيليات المختلفة.
الطريقة الأكثر حساسية هي فصل الطفيليات عن الدم بواسطة عمود من مبادل أنيون ، السليلوز DEAE متبوعاً بالطرد المركزي والملاحظة المجهرية. وبالتالي، فإن طريقة السليلوز DEAE هي الأفضل وتبقى حتى الآن، وهي الطريقة المرجعية لتصور وعزل الطفيليات من الدم لتشخيص داء المثقبيات الأفريقي البشري، خاصة في الظروف الميدانية. هذه الطريقة، التشخيص الأكثر ملاءمة لالطباء المثقبيات الأفريقية كما يوفر الطفيليات النقية للفحوصات البيولوجية المناعية والبيولوجية والبيوكيميائية والصيدلية والجزيئية.
وقد تم الحصول على جميع التحقيقات التي تتفق مع دليل رعاية المختبرات واستخدامها، وتم الحصول على اتفاق من السلطات الفرنسية، وقد وافقت على جميع البروتوكولات المستخدمة من قبل لجنتنا المحلية للأخلاقيات. تزن كل مادة وفقا للبروتوكول المكتوب. إضافة الماء المقطر وضبطها على وجه التحديد إلى درجة PH 8 مع فوسفات ديهيدروجين البوتاسيوم لجعل الحلول المخزنة التالية، ومركزة الفوسفات العازلة المالحة 2X.
إضافة الماء المقطر والجلوكوز للفوسفات المخزنة الجلوكوز المالحة. بالنسبة لـ 100 ملليلتر من عازلة elution ، أضف 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين ، و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتوميسين ، وخمس ميكروغرام ملليلتر من الفينول الأحمر إلى الجلوكوز الملحي الفوسفاتي المخزن. يتم غسلها 100 غرام من السليلوز DEAE أولا مع ثلاثة لترات من الماء المقطر ومن ثم ترك لتسوية.
يتم التخلص من الجسيمات الدقيقة. يتم تكرار الغسلات حتى يكون المابير واضحًا. يتم إضافة الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة 2X وزيلولوز DEAE هو أثار.
يتم تعديل الـ (pH) إلى ثمانية مع فوسفات بوتاسيوم واحد. ثم يتم غسل السليلوز مرتين بالماء المقطر ومرتين مع الجلوكوز الملحي الفوسفاتي المخزن. يتم خلط السليلوز DEAE والفوسفات المخزنة الجلوكوز المالحة في وحدات التخزين المتساوية.
سبائك أرباع وتخزينها في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية أو في ناقص 20 درجة مئوية للتخزين لفترات طويلة. يتم تخزين الدم المصاب بالميبانوزوم في النيتروجين السائل. يتم إذابة ربع سبائك من ملليلتر واحد في درجة حرارة الغرفة.
يتم جمع الطفيليات بعناية من الأنبوب المبرد باستخدام إبرة وحقنة مليلتر واحد. يتم تقييم صلاحية الطفيليات المذابة من خلال الحركة كما هو متصور من خلال مراقبة المجهر الخفيف قبل العدوى. يتم حقن الطفيليات في تجاويف الصفاق من اثنين من الفئران ، 500 ميكرولتر لكل فأر.
كل يوم بعد العدوى ، يتم تقييم الطفيليات عن طريق جمع قطرة دم من الذيل مع إبرة وفحصها عن طريق المجهر. عندما يكون الطفيلي في مستوى مناسب ، يتم جمع الدم المصاب. يتم دعم حقنة 10 ملليلتر في المشبك أو حامل ويتم إضافة قطعة قبل القطع من ورقة التصفية.
يتم صب السليلوز DEAE المعدة في الحقنة تصل إلى مستوى ثمانية أو تسعة ملليلتر. يتم غسل العمود مع العازلة elution. يتم وضع مليلترين من الدم المصاب بعناية على رأس العمود ويتم جمع المثقبيات في رُل العمود في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.
يتم إضافة عازلة Elution بانتظام وفقا لعبور trypanosomes. يتم فحص عبور المثقبيات من خلال العمود عن طريق أخذ قطرة من رُلود الأعمدة على فترات منتظمة ومراقبة المثقبيات باستخدام المجهر الخفيف. عندما لم تعد تلاحظ المثقبيات في eluate ، يتم طرد الأنبوب المخروطي في 1 ، 800 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
يتم التخلص من المثقبية ويتم حساب الهيمبوسات في البليت مع مقياس للهيموسيت. وتم تخفيف الجرببوسومات التي تم جمعها في الوسط المطلوب للتحقيق المخطط له. هذه الطريقة، التشخيص الأكثر ملاءمة لالطب المثقبية الأفريقية يوفر الطفيليات النقية للفحوصات البيولوجية المناعية والبيولوجية والبيوكيميائية والصيدلية والجزيئية.
وقد وضعت هذه الدراسات لأن الطفيليات المنقية السليلوز DEAE يمكن الحصول عليها بسهولة بكميات كبيرة من المضيفين المصابين بشكل طبيعي أو تجريبي وعلى وجه الخصوص القوارض. يتم تقييم صلاحية الميربانوسوم في وجود عوامل صيدلانية من خلال المراقبة المجهرية. ويرتبط بقاء الطفيليات مع الحركة ، وبالتالي ، يمكن فحصها بالعين تحت مجهر خفيف في 40 مرة أو أعلى التكبير.
يتم تقييم صلاحية الطفيليات من خلال قياس النسبة المئوية للأشكال المتحركة. يتم إضافة التخفيفات من مركبات الاختبار في كل بئر من 96 بئراً من لوحة الأنسجة في حين يتم التعامل مع آبار التحكم وهمية. ويتم تقييم كل تركيز في ثلاث 33.
يتم مقارنة عدد الطفيليات القابلة للحياة لكل تخفيف بعدد الطفيليات في الآبار المسيطرة. يتم عرض آثار Pentamidine، وهو دواء مرجعي، المستخدمة في علاج داء المثقبيات الأفريقي البشري في هذا الشكل. الثقافات الضامة المثقبية تسمح بالتحقيق في التفاعل الطفيلي المضيف على المستوى الخلوي.
في الثقافات المشتركة طفيليات الضامة ، تحفز trypanosomes الخلوية الإضافية إنتاج أرجيناز الضامة الذي يتحلل الأرجينين إلى ornithine. Ornithine هو مقدمة من البوليامينات و trypanothione ، ضرورية لبقاء الطفيلي والنمو. وعلاوة على ذلك، يقلل استنفاد الأرجينين من إنتاج أكسيد النيتريك الإبادة المثقبية.
في وقت لاحق، إضافة مثبط أرجيناز، S-L-السيستين إلى الثقافات المشتركة يقلل بشكل كبير من نمو الطفيليات الناجمة عن الضامة. يتم توسط الاتحريض أرجيناسي بواسطة تريبانوزوم تفرز أو العوامل السرية. وقد تم تحديد هذا العامل المستحث أرجيناز باعتباره كينسين الأورثين.
kinesin يربط إلى C-نوع الليكتين مستقبلات ملزمة. يتم حث أرجيناسي وينتج الأورنيثين الذي يفضل نمو الطفيليات. لا يتم تحريض Arginase بواسطة kinesin في الضامة المستزرعة مع 12.5 ملم مانوز أو في الضامة من الفئران حيث تم حذف مستقبلات مانيوز الضامة.
وأمثلة أخرى على بيولوجيا الخلايا والتجارب الكيميائية الحيوية باستخدام الأراضي المثقبية المنقية من السليلوز DAEA هي التي تظهر في الدراسات التي تم فيها تحديد البروتينات الخلوية الهيكلية الجديدة مثل BILBO1. BILBO1 مطلوب للحصول على النشوء الحيوي للهياكل الهيكلية الحيوية الهامة وبقاء الطفيليات. وهكذا، يمثل بيلبو1 هدفاً هاماً للتدخل في التهيّمات المسببة للأمراض.
صورة تظهر المناعة المناعة وسم من شكل ثقافة مجرى الدم، تظهر خلية البروسي المثقبية مسبر مع الأجسام المضادة BILBO1 في هذا الشكل. بالإضافة إلى ذلك، تم وصف استقلاب الجلوكوز والثريون باستخدام السليلوز تنقية trypanosomes والإنزيمات المشاركة في هذه العمليات تم التحقق من صحة تجريبية. يظهر في هذا الشكل تمثيل تخطيطي للغلوز والتمثيل الغذائي للثريونين في المثقبيات التي تشكل مجرى الدم.
تنقية المثقبيات الأفريقية من الدم عن طريق أنيون التبادلات السليلوز الأعمدة مع التحسينات الأخيرة لا يزال المعيار الذهبي للكشف عن المثقبيات، ليس فقط في المضيفين الطبيعية مع الطفيليات منخفضة في المناطق المتوطنة، ولكن أيضا لمتطلبات الطفيليات بأعداد كبيرة للتحقيقات التجريبية. وقد سمحت التحقيقات بتحديد جزيئات المثقبيات التي تلعب أدواراً أساسية في بقاء الطفيليات ونموها. وقد تمثل الأهداف المحددة الأساس للقاح مستقبلي مع مستضدات محتملة لكل من البشر والحيوانات في نهج صحي واحد.
