وينبغي أن تكون هذه الطريقة ذات فائدة للباحثين الذين يحاولون عزل مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي وتحديد تكوينها عن طريق القياس الطيفي الشامل. ونحن نعتقد أن بروتوكول لدينا سوف تكون مفيدة بشكل خاص لتنقية المجمعات الموجودة في الخلايا بكميات محدودة وتميل إلى فصل خلال إجراءات تنقية متعددة الخطوات طويلة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تنطوي على خطوة تنقية واحدة فقط ويمكن استخدامها مع مواقع الربط RNA من أي طول وتسلسل.
ومن بين الخطوات التي سيتم فيها وضع شياو-كوي يانغ، وهو أحد كبار فنيي البحوث في مجموعتنا. وبالنسبة لمواقع الربط التي تزيد كثيراً عن 65 نيوكليوتيدات، احصل على مادة T7 المولدة من الحمض النووي الريبي (RNA) والمحول ثنائي الفينيل متعدد الكلور oligonucleotide كما هو مبين في بروتوكول النص. مزيج 20 picomoles من الجيش الملكي النيبالي مع 100 picomoles من oligonucleotide محول في أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 100 ميكرولترات من العازلة ملزمة.
ضع الأنبوب في الماء المغلي واتركه يحتضن لمدة 5 دقائق. ثم تسمح للماء لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. الملحق الأول 1 ملليلتر من استخراج الماوس النووية مع EDTA 80 ملليمولار في 8 درجة PH إلى تركيز نهائي من 10 ملليمولار.
ثم إضافة بين 5 و 10 picomoles من الركيزة RNA التي تم وضع علامة مع moiety PCB. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق، مع التأكد من خلط العينة في بعض الأحيان. بعد ذلك استخدام ميكروسنتروجي قبل التبريد في 4 درجات مئوية إلى الطرد المركزي الخليط في 10، 000 مرات ز لمدة 10 دقائق لإزالة أي الترسبات المحتملة.
جمع بعناية في supernatant في أنبوب جديد على الجليد، مع الحرص على تجنب نقل بيليه. نقل ما يقرب من 100 ميكرولترات من streptavidin تعليق الخرز agarose إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة ما يقرب من 1 ملليلتر من العازلة ملزمة لبدء غسل الخرز.
الطرد المركزي الأنبوب في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق وpirate اسخناب. كرر هذه عملية الغسيل والطرد المركزي 2 إلى 3 مرات لتكبيل الخرز مع العازلة ملزمة. تحميل supernatant التي تم جمعها سابقا ، والذي يحتوي على مجمع تجميعها على الخرز التوازنية.
باستخدام دوار أنبوب، تدوير الأنبوب لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية لشل الجيش الملكي النيبالي والمجمعات ملزمة على الخرز. تدور المقبل الأنبوب في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق لجمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب. استلهموا المُنطّع.
وشطف الخرز مرتين مع العازلة ملزمة، وذلك باستخدام عملية الغسيل الموصوفة سابقا. بعد إزالة افرنح من غسل الثاني، إضافة 1 ملليلتر من العازلة ملزمة وتدوير العينة لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية. تدور أسفل العينة في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق.
أضف التالي 1 ملليلتر من العازلة ملزمة ونقل التعليق إلى أنبوب جديد. قم بتدوير العينة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي المجمعات غير المُشلَّة في 25 مرة ز لمدة 2 إلى 3 دقائق.
ثم pirnatate supernatant ، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة ملزمة. نقل الخرز إلى أنبوب 500 ميكرولتر. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة الذي ينبعث منه ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 365 نانومتر ويسمح له بالوصول إلى التألق الكامل.
ملء الجزء السفلي من طبق بيتري مع الجليد معبأة بإحكام التراص على غطاء الطبق. دوامة وجيزة الأنبوب الذي يحتوي على المجمعات غير المُشلَّلة. ثم ضعه أفقياً على الجليد واغطيه بالمصباح الذي تم تسخينه قبل ذلك، مع التأكد من أن العينة تتراوح من 2 إلى 3 سنتيمترات من سطح المصباح.
تشع العينة لمدة إجمالية 30 دقيقة بينما كثيراً ما تُعكس وتدامة الأنبوب لضمان التعرض الموحد ومنع ارتفاع درجة الحرارة. بعد ذلك، تدور أسفل الخرز في 25 مرات ز لمدة 2 إلى 3 دقائق وجمع ناظر. جهاز طرد مركزي هذا الماسخ مرة أخرى باستخدام نفس الشروط.
جمع نابيراتون الناتجة التأكد من ترك كمية صغيرة في الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب نقل أي الخرز المتبقية. باستخدام الكهرباء SDS-PAGE، فصل جزء من UV مائل فائقة والكسر المقابل من المواد المتبقية على الخرز بعد elution الأشعة فوق البنفسجية. المقبل استخدام طقم ملونة الفضة المتاحة تجاريا لطخة هلام.
تقييم كفاءة elution الأشعة فوق البنفسجية من خلال مقارنة شدة البروتينات الموجودة في UV eluted فائقة وتلك التي تركت على الخرز بعد الأشعة فوق البنفسجية. اكوس نطاقات البروتين من الفائدة وتحديد هوياتهم عن طريق القياس الطيفي الشامل. بعد ذلك، تحليل مباشرة جزء من UV مائل متراكب بواسطة قياس الطيف الشامل لتحديد البروتيوم بأكمله من المواد النقية بطريقة غير متحيزة.
في هذه الدراسة، الجذعية حلقة RNA الموسومة مع البيوتين الصورة مشقوق هو محتضن مع 1 ملليلتر من مستخلص S100 السيتوبلازمي التي تم الحصول عليها من خلايا المايلوما الفئران. ويتم تحليل تأثير وكفاءة للأشعة فوق البنفسجية من قبل تلطيخ الفضة. يتم الكشف عن عدد من البروتينات على الخرز streptavidin قبل elution الأشعة فوق البنفسجية.
الإشعاع مع الموجات الطويلة UV تطلق فقط بعض هذه البروتينات في supernatant ترك خلفية غير محددة على الخرز. وهذا يؤكد على أهمية خطوة elution الأشعة فوق البنفسجية. يحدد قياس الطيف الكتلي البروتينات UV المائلة الرئيسية على أنها 3'hExo و SLBP مع SLBP يتم تمثيلها من خلال كل من البروتين الكامل الطول وعدد من منتجات التحلل الأقصر.
كميات أصغر من البروتينات الأخرى التي تم تحديدها كبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي المختلفة التي يتم إطلاقها أيضًا بشكل انتقائي في محلول بواسطة الأشعة فوق البنفسجية. أدى elution من شل الحركة Drosophila histone قبل مرنا الموسومة مع biotin يندمج مع مستخلص نووي إلى إطلاق انتقائي لعدد قليل فقط من البروتينات في السوبر مع خلفية مكثفة من البروتينات غير محددة المتبقية على الخرز. يحدد قياس الطيف الكتلي هذه البروتينات لتكون مكونات U7 snRNP.
لم يتم الكشف عنها في وجود المنافسين معالجة التي كتلة ملزمة من U7 snRNP إلى histone قبل مرنا. من المهم استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية عالية الكثافة ووضعها على مسافة قريبة من العينة المشععة مع التأكد أيضا من أنها لا ترتفع درجة الحرارة. طريقة elution الأشعة فوق البنفسجية تسفر عن مجمعات البروتين الحمض النووي الريبي الأصلي التي تفتقر إلى الملوثات الرئيسية ومناسبة مباشرة لمزيد من خطوات تنقية والتقديس الوظيفي.
تجنب التعرض للعين والجلد أثناء التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
