هذا الأسلوب يعالج مشكلة شائعة في هذا المجال ويوفر سير عمل كامل لعزل سريع وتوصيف من حويصلات خارج الخلية واحدة مع علامات محددة من الاهتمام. تحليل تتبع الجسيمات النانوية هو طريقة شبه آلية. ويستخدم خصائص الضوء المتناثرة والحركة براونيان لتحليل حجم توزيع من الخلايا خارج الخلية.
سوف يكون إثبات الإجراء فيرا شميدت، طالبة دكتوراه من مختبرنا. لعزل الحويصلات خارج الخلية ، بعد جمع عينتين من الدم الكامل البشري في أنابيب فصل المصل ، اسمح للعينات بالتخثر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل فصل الخلايا عن المصل عن طريق الطرد المركزي. نقل ملليلتر واحد من المصل من كل عينة إلى أنابيب رد فعل 1.5 ملليلتر الفردية للطرد المركزي لإزالة الصفائح الدموية، ونقل 100 ميكرولترات من البلازما الصفيحات الفقيرة إلى أنابيب تفاعل جديدة 1.5 ملليلتر.
المقبل، إضافة 25 ميكرولترات من محلول هطول الأمطار اكسوزومات إلى البلازما ودوامة العينات بدقة. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد، وجمع حويصلات خارج الخلية عن طريق الطرد المركزي. وسوف تظهر بيليه باللون البيج أو اللون الأبيض.
استلهموا المُنطَع والطرد المركزي العينة مرة أخرى. ثم، وإزالة جميع نشوة السوائل وإعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لطخة أغشية الخلايا من الفينات، إضافة 10 ميكرولترات من تعليق EV إلى 50 ميكرولترات من الطازجة أعدت PKH67 محلول صبغة الإيثانول وخلطها جيدا.
بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام، تمييع 50 ميكرولترات من تعليق الحويظة خارج الخلية الملطخة مع 2.5 ملليلتر من الماء المقطر في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، مع خلط شامل. لتسمية العويصلات بالأجسام المضادة ، قم بتخفيف 10 إلى 20 ميكرولترات من تعليق الفُضَي خارج الخلية غير المطّع مع 50 ميكرولترات من الماء المقطر في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر ، مع خلط دقيق. إضافة 2.5 إلى خمسة ميكرولترات من الأجسام المضادة ذات الفائدة إلى أنبوب التفاعل، مع خلط شامل، لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ثم، نقل 50 ميكرولترات من الفحوى المسمى إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على الحجم التجريبي المناسب من الماء المقطر، مع خلط شامل، كما هو مبين في الجدول. قبل تحليل العويصلات الخارجة عن الخلية الملطخة أو المسماة، قم أولاً بتحريك فلتر الفلوريسنس إلى المسار البصري للمجهر والكاميرا، ثم ابدأ البرنامج، باتباع التعليمات على الشاشة للتنفيذ الآلي. ضمن علامة التبويب "فحص الخلية"، حدد رقم الخلية الصحيح لقياس الفلوريسنس والموضع المرجعي للبصريات، للتأكد من أن الليزر والمجهر في بؤرة مشتركة.
استخدام حقنة لطرد قناة الخلية مع 10 ملليلتر من الماء المقطر، مع الحرص على أن خلية القياس خالية من فقاعات الهواء وأن فقاعات الهواء لا يتم حقنها في النظام. بعد ذلك، تمييع 10 ميكرولترات من 200 نانومتر بحجم الفلوريسكين المسمى جزيئات البوليسترين في 990 ميكرولتر من الماء المقطر وإضافة 10 ميكرولترات من هذا التعليق الجسيم في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من الماء المقطر. ثم، حقن 2.5 ملليلتر من أول حل الجسيمات المخففة في قناة الخلية وانقر فوق تحسين التركيز لضبط الكاميرا.
لقياس العينة، قم بمسح قناة الخلية عدة مرات بـ 10 ملليلتر من الماء المقطر وحقن تعليق الفُنْض خارج الخلية الملطخ. باستخدام موضع المرجع، قم بضبط معلمات الامتلاك المناسبة ضمن علامة التبويب "فحص الخلية"، كما هو موضح في الجدول. لتحديد نطاق الحساسية الأمثل، انقر فوق عدد الجسيمات مقابل.
حساسية، لعرض منحنى من الجسيمات قياس لكل شاشة لمستويات حساسية مختلفة. بالنسبة لمعلمة "الغالق"، قم بضبط الفترة الزمنية التي تسمح الكاميرا للضوء بتمريرها لفترة زمنية محددة. بالنسبة لبارامترات ما بعد الحداثة، حدد الحد الأدنى للسطوع البالغ 20، والحد الأدنى لحجم 20 نانومتر، والحد الأقصى لحجم القياس 500 نانومتر.
لاحظ عدد الجسيمات المكتشفة في مجال عرض الشاشة. يجب أن يكون شريط التشتت في نطاق الجزيئات الخضراء إلى البرتقالية ، من 50 إلى 300. انقر فوق فحص انجرف الجسيمات في فولت صفر وفتح علامة التبويب القياس.
انقر فوق تشغيل الحصول على الفيديو وتعيين عدد التجارب إلى ثلاثة إلى خمسة، وتأخير الوقت بين التجارب إلى صفر دقيقة. تعيين عدد المواضع دون الوحدة الفردية إلى 11 وعدد دورات القياس إلى 10 في كل موضع قياس التي يتم فيها تحليل الجسيمات. ثم حدد مجلداً، وقم بإنشاء اسم ملف جديد، ثم انقر فوق "حسناً" لبدء القياس.
في نهاية التحليل، افتح علامة التبويب تحليل لمراجعة النتائج. ثم تحقق من متوسط عدد الجسيمات لكل موقع، والعدد الإجمالي للجسيمات التي تم تتبعها وتركيز الجسيمات، وعرض توزيع الجسيمات، وقيمة الوسط، والانحراف المعياري. استخدام الخرز الفلورسنت لتعديل ومعايرة القياس يعطي حساسية الإعداد الأمثل من 85٪ باستخدام هذه الإعدادات، والكاميرا يعرض صورة حادة والقياسات المتكررة تظهر انحراف معياري منخفض.
يُظهر التلطيخ مع مجموعة رابط الخلايا التي تتضمن رابطًا لخلايا فلورية يتضمن صبغة فلورية خضراء ذات ذيول طويلة وأليفية في مناطق الدهون في غشاء الخلية، ارتباطًا قويًا بين الحساسية وعدد الجسيمات المقاسة. إن وجود جسم مضاد من خارج الخلية يلطّخ الجسم المضاد ضد بروتين من الاهتمام يشير إلى توزيع الجسيمات من 220 إلى 1، 145 نانومتر، مع ذروة قصوى من 541 نانومتر. يتم الكشف عن أي حويصلات خارج الخلية بعد تلطيخ الأجسام المضادة من الماء الخالي من حويصلات التحكم، تصل إلى حساسية قريبة من 100٪إذا بدأ القياس عندما يكون الانجراف أكبر من 5 ميكرومتر في الثانية الواحدة، والتكرار الفردية إظهار انحرافات متميزة.
ومن المهم ملاحظة أن استخدام الفلوريسين متساوي الوهليوسايانات كفلوروكروم يؤدي إلى قياسات غير دقيقة وغير قابلة للانتكاس، لأن هذا الفلوروفور عرضة للتعرض للفوتولوباتش السريع. يتناول هذا البروتوكول الطلب الرئيسي للعديد من الباحثين في هذا المجال للحصول على توصيف سريع للحثي الوحيدة خارج الخلية ، وذلك باستخدام علامات محددة. وعلى الرغم من أن الأساليب قد تحسنت كثيراً على مدى العقد الماضي، لا يوجد حتى الآن بروتوكول موحد لتحليل الفُرَضَة الوحيدة خارج الخلية.
بغض النظر عن التقدم في المستقبل من البحوث على علم الأحياء خارج الخلية، ويوفر هذا الأسلوب بروتوكول سريع وموثوق به لتوصيف من الفُيْيْسَة خارج الخلية باستخدام علامات محددة. لأن البروتوكولات الحالية لا تتضمن أوقات المعالجة الطويلة أو خطوات العمل المكثف، فهي أيضاً مناسبة لـ سرعة نقل العينة عالية.
