The authors would like to thank Christina Ball&#225;zs, Hug Aubin and J&#246;rn H&#252;lsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على التجارب المعروضة في هذا العمل من قبل مجلس الأخلاقي المؤسسي للجامعة دوسلدورف. 1. إعداد Exosome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم كله في 3 أنابيب سترات عبر بزل الوريد (ما مجموعه 9 مل). صب الدم في أنبوب فالكون 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 1،500 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية لبدء فصل الخلايا من البلازما. نقل طاف ل15 مل جديد أنبوب الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في العينة 2،800 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة جميع الخلايا من البلازما (بلازما خالية من الخلايا، CFP). نقل CFP لأنابيب تنبيذ فائق، 1 مل لكل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 100،000 x ج لمدة 90 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى نضوب exosomes. إزالة 900 ميكرولتر من طاف. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر المتبقية في أنبوب تنبيذ فائق. إضافة 900 ميكرولتر PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي مرة أخرى في 100،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة 900 ميكرولتر من سوpernatant. إعادة تعليق بيليه مع 100 ميكرولتر المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 5 إلى 20 ميكرولتر من اعادة تعليق في 40 مل من الماء المقطر. تعليق تصفية من خلال مرشح 450 نانومتر لفصل exosomes من الجزيئات الكبيرة. استخدام هذا تعليق النهائي لقياس الجسيمات. </li></ol> 2. إجراء بدء التشغيل من تتبع صك الجسيمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة-البرمجيات. انقر على مختلف علامات التبويب البرمجيات (&quot;خلية تحقق&quot;، &quot;قياس&quot;، &quot;تحليل&quot;) للتبديل بينهما في جميع أنحاء البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لتنفيذ الآلية الإجراء بدء التشغيل. حدد خانات الاختيار لكلا نوعية الخلايا ومحاذاة السيارات. ملاحظة: أي من هذه الخطوات يمكن أن تتكرر بشكل منفصل إذا لزم الأمر عن طريق زر (A) أو (B) الضغط على &quot;الاختيار خلية&quot; علامة التبويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح مدخل ومخرج منفذ الصك NTA وحقن 10 مل تقطير المياه عن طريق حقنة في القناة الخلية من خلال مدخل الميناء. إغلاق الميناء منفذا كما يتم حقن كمية الأخير من المياه. ضع الكأس تحت الميناء منفذا لجمع النفايات حل. تأكد من أن الخلية قياس خالية من فقاعات الهواء ولا المحاقن فقاعات الهواء في النظام. إغلاق مدخل الميناء على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء فحص الجودة خلية عن طريق النقر على &quot;OK&quot;. يقوم البرنامج بعرض نتائج نوعية الخلية بعد بضع ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لا تزال تصور أي جزيئات في الشاشة الحية نظرا للبرمجيات أو إذا كانت نتيجة فحص الجودة جيدة فقط أو الفقيرة، يتم إزالة كرر الخطوة 2.3 حتى الجزيئات المتبقية من الخلية القياس. أكرر أيضا خطوة 2.3 بعد كل قياس لتجنب تراكم الجزيئات. إذا تكرار حقن الماء المقطر والاختيار الخلية لا يؤدي إلى نتائج &quot;جيدة&quot;، والمضي قدما إلى 2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق السيطرة تحتوي موحد 200 نانومتر بول الحجمالجسيمات ystyrene لاستخدامها لتحقيق المواءمة بين بؤر الليزر والمجهر. إضافة قطرة واحدة من التركيز تعليق، المقدمة من الشركة المصنعة الصك، إلى 500 مل من الماء المقطر للحصول على التركيز المطلوب بحيث يتم عرض 600 ± 100 الجسيمات في الشاشة في الرؤية الحية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن تعليق محاذاة إلى أداة NTA كما هو موضح في الخطوة 2.3. اضغط على &quot;موافق&quot; لبدء محاذاة السيارات، روتين الآلي من خلالها النظام سوف تجد الموقف الأمثل للبؤر اثنين تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند ظهور موجه يفيد هذا النظام هو الآن على استعداد لإجراء التجارب، انقر على OK لبدء القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أحيانا، وتنظيف قناة خلية يدويا بين التجارب التي كتبها التنظيف الخلية مع حل 30٪ من الايثانول. تنظيف القناة كلما يعرض البرنامج تقريرا عن الخطأ التلقائي. </li></ol> 3. قياس عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح القناة مع الماء المقطر قبل عصامقياس عينة CH رأي (كما هو موضح في الخطوة 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن تعليق exosome (المعد في القسم 1) في إلى القناة، كما هو موضح في الخطوة 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط المعلمات الرئيسية التالية في البرنامج حسب الحاجة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساسية. من أجل العثور على مجموعة حساسية الأمثل، انقر على زر &quot;عدد الجسيمات مقابل حساسية&quot; لعرض منحنى للجسيمات قياس الشاشة في لمستويات حساسية مختلفة. اختار مستوى الحساسية قبل المنحدر الأقصى للمنحنى. مستوى حساسية أعلى يسمح التصور من المزيد من الجسيمات الصغيرة ولكن أيضا يزيد من القضايا ذات الصلة للضجيج في الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحد الأدنى السطوع. اختار سطوع ابتداء من 20 لقياس exosome لاستخدام هذه الوظيفة كعامل تصفية. تنظيم هذه المعلمة إلى فارغة بقوة جزيئات خفيفة نثر. تنظيم ذلك وصولا الى تضخيم ضعيف تناثر القطع الأثرية. تختلف السطوع حسب الحاجة في كافة مراحل التجربة. ملاحظة: الجسيمات التي ضوئيةمبعثر تتداخل بقوة أكثر من اللازم ويمكن استبعادها من التحليل عن طريق الخطأ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Min و Max الحجم. وضع فلتر رقمي للقضاء على الضوضاء بكسل ومبعثر غير المرغوب فيها من جزيئات كبيرة الحجم من خلال تنظيم حجم الحد الأدنى والحد الأقصى. استخدام مجموعة من 10-500 بكسل لقياس exosomes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصراع. ضبط الفترة الزمنية التي الكاميرا مفتوحة ل1/300 ثانية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعيش المعلمات تلا: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل بين الرقمية والتناظرية وجهة نظر عمل في أي لحظة عن طريق النقر على زر &quot;لايف-الصورة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كافة مراحل التجربة، ومراقبة شريط كثافة نثر، الذي يعرض حالة التشبع من العينة كمؤشر ونا مميزا. لا تحليل exosomes إذا كان شريط نثر أحمر. في مثل هذه الحالة مزيد من تمييع عينة لتجنب هذه الظاهرة. إذا تحظر حالة تجريبية التلاعب من العينة تعليق، أسفل تنظيم حساسية أو يصل تنظيم سطوع في برنامج لياليettings لتحسين نتائج القياس. ملاحظة: عندما يتم تحليل العينات مع تركيز عال جدا من الجسيمات مبعثر احتمال اشتعال الجزيئات الفردية وتحسب على أنها جسيم واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ عدد من الجسيمات تحسب في مجال الرؤية من العرض. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على &quot;القياس&quot; علامة التبويب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الإعدادات في &quot;تشغيل خيارات&quot; صفيف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل كل الاستحواذ، حدد &quot;حركة الاختيار&quot; لفحص المتكررة اختبار الانجراف الجسيمات. إجراء اختبار مرة واحدة على الأقل قبل البدء في تحليل كله. إذا كان الانحراف هو أعلى من 20 ميكرون / ثانية، والانتظار قبل مواصلة قياس بحيث العينة توقف تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد عدد من التجارب (5) وتأخير الوقت بينهما (0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء &quot;فحص عينة&quot; إذا لزم الأمر. هذا الاختبار هو جزء من محاذاة السيارات في الإجراء بدء التشغيل ويمكن أن يتكرر بعد ذلك حسب الحاجة. </لى&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأخيرا انقر على زر &quot;الاستحواذ الفيديو تشغيل&quot;. في النافذة الجديدة، وتحديد عدد الدورات (15) وعدد من المناصب القياس (11). ملاحظة: رئيس الليزر ويمكن نقل المجهر لتحليل عدد الجسيمات في 11 وظيفة مختلفة. اعتمادا على الطلب التجريبي، أن تقرر ما إذا كانت التجربة ينبغي أن يقوم على موقف واحد أو على مواقع مختلفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد الحد الأدنى من المدة الزمنية جسيم لابد من تتبع ليكون بمثابة الجسيمات فرد واحد من خلال تحديد دقة الفيديو (منخفض). وهناك نتائج أقل دقة في مدة أقصر تتبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد اسم الملف وانقر على &quot;OK&quot; لبدء القياس. </li></ol></li></ol> 4. تفسير نتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض النتائج والمعلمات التالية عرض بعد القياس على &quot;النتائج&quot; علامة التبويب: (1) العدد الكلي للجسيمات تتبعها، (2) متوسط ​​عدد جزءاicles في الموقف، و (3) تركيز الجسيمات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض متوسط ​​الجدول نتيجة للنسبة العددية لحجم الجسيمات (قطر، السطحية والحجم) إلى نسبة أعداد الجسيمات، فضلا عن قيم المتوسط ​​والتمايز القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم الجدول تحليل ذروة الذروة في حالة وجود أكثر من واحد في التحليل البياني. هذا الجدول يبين توزيع الجسيمات التي تكون أصغر من ذروة الأولى أو الثانية على التوالي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الرسم البياني تحسب بعد قياس لرؤية توزيع الجسيمات من حيث الحجم. استخدام الرموز في وضع العرض وفوق الرسم البياني لتغيير الإعدادات. </li></ol>

<ol>
	<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.+.">Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. .</a> Current protocols in cell biology / editorial board. (3.22), (2006).</li><li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling.">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).</li><li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes.">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. , e3037 (2012).</li><li>Konokhova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-scattering+flow+cytometry+for+identification+and+characterization+of+blood+microparticles.">Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles.</a> Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).</li><li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+current+knowledge+of+their+composition,+biological+functions,+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials.">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).</li><li>Sokolova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+exosomes+derived+from+human+cells+by+nanoparticle+tracking+analysis+and+scanning+electron+microscopy.">Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy.</a> Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).</li><li>Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+antigen+presenting+cell+derived+exosomes,+based+on+immuno-magnetic+isolation+and+flow+cytometry.">Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry.</a> Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).</li><li>Carr, B., Warren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Company+profile:+NanoSight:+delivering+practical+solutions+for+biological+nanotechnology.">Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology.</a> Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).</li><li>Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> International immunology. 17, 879-887 (2005).</li></ol>

This work was supported by the institutional funds of the Dept. of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, HHU. The publication costs of this study were provided by Particle MetrixGmbH.

علينا أن نظهر بروتوكول مفصلة لعزل exosome من الدم والحاضر تتبع جسيمات متناهية الصغر باعتبارها الرواية وطريقة مبتكرة لقياس حجم exosome والتركيز في السائل البيولوجي. في التجارب المعروضة تم استخدام الدم المحيطي البشري وأصل exosomes. ومع ذلك، أصول أخرى، مثل البول، البلغم، وزراعة الخلايا طاف وغيرها، ويمكن أيضا أن تستخدم كمادة اختبار. على أساس التباين البيولوجي للتركيز exosome في البشر، قد المقايسات من مختلف الأفراد ميزة تركيز متفاوتة بشكل ملحوظ من exosomes. ومع ذلك، فإن تركيز الجزيئات في اختبار التحقيق البيولوجي قد يكون لها تأثير على النتائج. ولذلك، هناك حاجة إلى نهج موثوق وموحد لتخفيف من تحقيقات. في طريقة عرض تم إنشاؤها exosome تحتوي البلازما من 9 مل من الدم الكامل الطرفية. باستخدام الطرد المركزي التفاضلي الخطوات تم عزل بيليه exosome من<html> 1 مل البلازما وإعادة وقف التنفيذ في 5 مل من الماء المقطر أن يؤدي في العينة عمل exosomes مع وقف التنفيذ. وقد وفرت هذا الإعداد محددة مسبقا لنا مع تركيز السليم للجزيئات، أي كثافة مبعثر المناسبة أثناء NTA. بجانب حجم والتخفيف الجانب، وتكوين الحلول التي تستخدم أيضا من أهمية. وقد استخدمنا الماء المقطر لنهائي اعادة تعليق من exosomes. وبطبيعة الحال، وسائل الإعلام المختلفة للخطوة التخفيف النهائية يمكن أن تستخدم أيضا، وفقا لمتطلبات التجريبية مجموعة المتابعة. ومع ذلك، في حالة القياسات زيتا المحتملة من الحلول الأيونية، وخاصة عند اختبار عينات بسعة التخزين المؤقت، والتخفيف من الحكمة في ظروف خالية الاضطراب مفيد. للمقارنة مباشرة من عينات متعددة نوصي الحفاظ على مستوى التخفيف نفسه لجميع العينات. يمكن تغيير جميع إعدادات باستثناء حساسية ودقة الفيديو بعد ذلك باستخدام برنامج التحليل ZetaView. &quot;jove_content&quot;&gt; على الرغم من أن الكتاب يعتقدون أن النظام قدم هنا يمثل حاليا الصك الأنسب، أنها ليست متوفرة نظام NTA الوحيد. وهناك عدد من التقارير السابقة قد استخدمت النظم الأخرى التي تطبق مبادئ NTA نفسها ولكن توفير تصميم آخر الصك الذي يسير جنبا إلى جنب مع بعض الميزات المختلفة 10. ونحن نعتقد أن الجوانب العملية المتعلقة التعامل مع العينة واستنساخ نتائج ذات أهمية مركزية في اختيار تسلسل منهجي لتقييم exosome. ونحن نعتقد أيضا أن نظام الكشف المثالي يجب القضاء على عوامل اعتمادا المستخدم التي قد تتداخل مع نتائج القياسات. نهج تحليل exosome أن يرد هنا يفي معيار سهولة التعامل بدرجة عالية. باعتبارها ميزة أخرى، يتم إجراء التحليل الآلي شبه من العينات في عملية سريعة، وتوليد النتائج في وقت قصير. والتصور عبر الإنترنت من exosomes الايدز محلل لالجافي فكرة الفورية من الخصائص exosome، على سبيل المثال، وتركيز الإجمالي. إضافة بسيطة جدا ولكن أنيقة لتقنية قياس المقدمة هنا هي استخدام الأجسام المضادة المسمى exosomes والقبض على شعاع الليزر المنتشرة باستخدام فلتر السابق أمام كاشف. وبهذه الطريقة يمكن التمييز بين المجموعات السكانية الفرعية exosome وفقا لمستضدات السطحية وخصائصها الأخرى ذات الصلة من الناحية البيولوجية التي يمكن الوصول إليها من الناحية الفنية إلى تلطيخ الفلورسنت انتقائي. عيب واحد من الإصدار الحالي من لدينا أداة تتبع الجسيمات هو حقيقة أنه في مستويات حساسية عالية جدا التحف مثل الضوضاء الخلفية قد تصبح الحالي، الذي يقوم على الجدار قناة الخلية. قد يصبح الحل التقني وتحسين للنظام الحالي متاحة في المستقبل القريب. بواسطة هذه الطريقة انعكاسات ضوء الليزر مبعثر على الحائط القناة سيتم تخفيض، وبالتالي زيادة<html> دقة الإشارات قياس والبيانات التي تم الحصول عليها وخفض الحد من الكشف. على الرغم من أن البروتوكول المستخدم حاليا لexosome العزلة راسخة وتطبيق أداة تتبع الجسيمات لديه قرار دقيقة بشكل ملحوظ مع توزيع حجم أقل من 30 نانومتر، ليس هناك ما يضمن أن الجسيمات الكشف هي في الواقع exosomes حقيقية تماما. الجزيئات الأخرى، مثل شظايا خلية ميتة أو مجمعات البروتين أكبر قد تكون أيضا موجودة في تعليق exosome وتؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة. واحد طريقة موثوق بها التي من هذا القبيل &quot;التلوث&quot; يمكن استبعادها قد يكون المجهر الإلكتروني (EM)، إما EM نقل أو مسح EM. للأسف، لم يتم التعرف على علامة العامة والخاصة لexosomes حتى الآن، على الرغم من أن عددا من علامات سطح المقترحة سابقا اكتسبت قدرا متزايدا من الاهتمام، بما في ذلك tetraspanin (Tspan)، CD81، C63، CD9، الخ 11. &quot;&gt; وبغض النظر عن التقدم في المستقبل من البحوث حول علم الأحياء exosome، ولا سيما فيما يتعلق علامات محددة exosome، فإن البروتوكول الذي يرد هنا توفر وسيلة قوية لعزل والكشف عن exosomes. يمكن تحديد تركيز وحجم بسهولة في المساعدة البرمجيات سوف الأزياء واضحة. وإضافة علامات الفلورسنت انتقائية أو fluorophore إلى جانب الأجسام المضادة من المرجح زيادة تعزيز التطبيقات الممكنة للنهج قدمت من NTA.

وظلت وظيفة بالضبط من exosomes تعميم مجهولة لفترة طويلة من الزمن. حتى الآن ليست مفهومة تماما آلية المسار الكامل من exosomes. منذ exosomes تحمل بصورة رئيسية أعطيت المستضدات والبروتينات والحمض النووي الريبي (مرنا وميرنا) التي تتعلق بهم إلى خلية الوالدين الأصلية، وظيفتها والإرسال يشير خلية خلية ذات الأولوية. وقد وصفت العديد من الأساليب المختلفة في الأدب لعزل والكشف الكمي للexosomes 1،2. ومع ذلك، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن &quot;معيار ذهبي&quot;. وفي الوقت نفسه فإن غالبية العلماء نشط في مجال البحوث exosome يتفقون على أن طريقة متسقة من العزلة وتبرر للغاية لتحقيق درجة أعلى من المقارنة بين التقارير والدراسات المختلفة. مضان تنشيط الفرز الخلية (FACS) هو الأداة الأكثر شيوعا وانتشارا للتحليل exosome 3. FACS لديه بنefit ذلك، عن طريق وضع العلامات مضان، الخلايا من أصول مختلفة يمكن مقارنة في خطوة واحدة. المساوئ الرئيسية للFACS هي أن هذه الطريقة ليست حساسة بما فيه الكفاية لتحديد جزيئات أصغر من 0.5 ميكرومتر 4، في حين exosomes عموما بين 30-120 نانومتر في القطر 5، وحتى أقل لقياس حجمها. المجهر الإلكتروني (SEM) وانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) هي أدوات أخرى لتحليل حجم الجسيمات ومورفولوجية exosomes. ومع ذلك، على حد سواء SEM وTEM يكون العيب أن إعداد عينات هو، على حد سواء أساليب تنطوي على خطوات كثيفة العمالة تستغرق وقتا طويلا ولكل منها بعض المخاطر من الجيل قطعة أثرية. لا طريقة مناسبة لعالية الإنتاجية عينة وتوصيف عدة آلاف من الجزيئات واحدة من عينة واحدة. وعلاوة على ذلك، والتحليل الكمي للروتين اليومي السريرية حيث توجد عينات كثير من الأحيان ليتم تحليلها في وقت واحد أو على الأقل في فترة قصيرة جدا هومن الصعب القيام بها. تقنيات الجيل الجديد يسمح لنا الآن لتحليل exosomes دون العمل التحضيري المكثف مسبق (SEM على سبيل المثال، البيئية). هذه التقنيات الحديثة لا تزال غير مريح بدلا لتحليل تعليق حجم كبيرة تحتوي على exosomes لتحديد متوسط ​​عدد وحجم التوزيع 6. طريقة أخرى حساسة للغاية لتصور وتحليل exosomes هو تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA). هذه الطريقة يستفيد من مبدأين مختلفة من الفيزياء. أولا، والكشف عن جسيمات من قبل الضوء المتناثرة عندما يتم المشع أنها مع شعاع الليزر. ومن المعروف أن الظاهرة الثانية كما الحركة البراونية، التي تنص على نشر جزيئات مختلفة في تعليق السائل يتناسب عكسيا مع حجمها. في الحالة الأخيرة يعتمد الحركة أيضا على درجة الحرارة واللزوجة من السوائل. ومع ذلك فإن هذه النسبة ترتبط مباشرة حجم الجسيمات ويستخدم من قبل NTA. باستخدام لينةالتحليل القائم وير، وتسجل الصور الرقمية من الضوء المتناثرة من الجزيئات واحدة. قطع من بقع الضوء المتناثرة وسرعتهم الحركة توفر البيانات التي تسهل تحديد إجمالي عدد الجسيمات وحجم التوزيع. هذه التقنية هي قوية بشكل خاص لتحليل جزيئات بقطر متوسط ​​أقل من 100 نانومتر. يتم تنفيذ قياسات حجم وتركيز مع ZetaView البراونية وتحليل الكهربائي فيديو الحركة المجهر. وهذا هو أعلى جسيمات متناهية الصغر تحليل صك الآلي شبه مكتب للعينات السائلة (المشار إليه فيما بعد كأداة تتبع الجسيمات). وهو يتألف من جسيمات تتبع محلل وكذلك جهاز كمبيوتر محمول مع البرمجيات المستخدمة لتحليل البيانات. عينات بيولوجية غير المتجانسة هي كما مناسبة لهذا الأسلوب إلى التوقيف أكثر تجانسا من الجزيئات غير العضوية. ويستخدم المجهر نثر الليزر مع كاميرا الفيديو للكشف عن الجسيمات وللobservation من حركتهم. في حين أن محور المجهر هو أفقي وركز في القناة خلية مليئة تعليق يحتوي على exosomes، يتم توجيه شعاع الليزر عموديا. الجسيمات المشع من قبل مبعثر ضوء الليزر، والتي يتم تسجيلها تحت 90 ° بواسطة كاميرا الفيديو الرقمية عبر المجهر (الشكل 1). شدة الضوء المتناثرة تتيح مراقبة الجزيئات الكبيرة 60 نانومتر القطر. في مثل هذا الوضع سطوع الجسيمات ليست المؤشر الوحيد من حجم الجسيمات. عندما يتم تطبيق أي حقل كهربائي، حركة الجسيمات يتبع فقط الحركة البراونية ويمكن أن تكون مؤشرا لحساب حجم الجسيمات. ومع ذلك، فإن الصك هو أيضا قادرة على تطبيق مجال كهربائي عبر القناة الخلية. عندما تتعرض لهذا المجال، والمحتملين، والاستقطاب ومستوى الأيونية تهمة للexosomes علقت تصبح مزيد من محددات اتجاه حركتها. السرعة والاتجاه نتيجة في مو الكهربيبيليتي الرسم البياني. في حين إيجاد طريقة الأمثل لتحليل exosomes معزولة هو مشكلة واحدة، وآخر يكمن في عزلة فعالة من exosomes من وسائل الإعلام المختلفة، مثل الدم، استسقاء، والبول، والحليب، والسائل الذي يحيط بالجنين أو وسائل الإعلام الخلية. وقد وصفت أساليب مختلفة حتى الآن، والتي تقوم على تنبيذ فائق 1، الكواشف فصل الصناعية (مثل Exoquick) 7، حبات مغناطيسية للمستضد توظيف الفصل 8 أو 9 خطوات الترشيح الفائق. في هذا البروتوكول ونحن لشرح العملية برمتها من exosome العزلة عبر تنبيذ فائق وإظهار كيفية تحليل exosome الناتجة تحتوي على تعليق من خلال أداة تتبع الجسيمات. وتقدم اعتبارات محددة لتحليل البلازما أو زراعة الخلايا البشرية المتوسطة exosomes مشتقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:159px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citrate tube</td>
			<td>BD</td>
			<td>364305</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Distilled water</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3880087</td>
			<td>Aqua ad iniectabilia</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tube</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>188271</td>
			<td>PP Tube, Steril 15ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifugation tube</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>357448</td>
			<td>Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybead</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>07304</td>
			<td>2,6% Solids-Latex 
			Alignment Solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (Filter)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617053V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (ZetaView)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606051V</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305180</td>
			<td>BD Blunt Fill Needle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td>16555</td>
			<td>Syringe filter, hydrophilic, 450&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Material Name&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>L8-M</td>
			<td>Rotor: 70Ti Ser. No E21078</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZetaView</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>PMX 100, Type 101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td>Rotor: A-4-44</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an innovative method for exosome quantification and size measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

العينة المستخدمة في هذه التظاهرة معارض جو الأمثل لقياس مع وجود حساسية من 85٪، وذلك قبل المنحدر الحد الأقصى لمنحنى حساسية (الشكل 2). السطوع، ودقيقة / تم اختيار القيم كحد أقصى على النحو الموصى به في البروتوكول. وهناك تركيز 5.3 الجسيمات / مل × 10 6 تم قياس، في حين كان متوسط ​​حجم الجسيمات 0.149 ميكرون، معظمهم من 0.137 ميكرون. يمكن حفظ القيم وردت بعد قياس في تقرير مع تنسيق ملف من قوات الدفاع الشعبي أو في شكل. TXT للتصدير إلى قاعدة البيانات. يمكن تعديل الرسم البياني كما يفضل كما هو موضح في البروتوكول (القسم 4). يتم حفظ تسلسل الفيديو أيضا، ويمكن استخدامها في وقت لاحق خارج الخط إعادة التحليل. ومع ذلك، في هذا التحليل خارج الخط، إعدادات ما قبل الاستحواذ على الكاميرا لا يمكن تغيير بأثر رجعي. من أجل العثور على إعدادات المعلمة المثلى لقياس، ونحن هنا وصف عشرالبريد تعظيم الاستفادة من إعدادات الأداة على سبيل المثال من 100 نانومتر حجم البوليسترين المعيار. وتناقش تأثير معلمتين والحساسية ودقيقة / الحد الأقصى لحجم على صورة الفيديو وحجم الجسيمات التوزيع بالتفصيل. وتتلخص جميع البارامترات الأخرى في الجدول 1. هو تصور وانطباع البصري للتأثير الحساسية (تتراوح 50-94) على التناظرية والرقمية الصور في الشكل (3). وتقدم المعلومات الكمية المستمدة من الصور في الشكل (4)، استنادا إلى الإعدادات في الجدول رقم 1، مين الحجم = هو مبين (5) وماكس الحجم = 200. وثمة علاقة نموذجية من عدد الجسيمات الكشف مقابل حساسية في الشكل 4A. ما بين 50 و 90، وزيادة عدد جزيئات الكشف عن بحساسية وارتفع بشكل كبير عن الحساسيات&gt; 90. تم العثور على مجموعة الأمثل للحساسية بين 66 و 86 (A). توزيع حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها مع DIFوتظهر إعدادات حساسية ferent في الشكل 4B. التوزيعات حجم الجسيمات تمثل متوسط ​​ثلاثة القياسات الفردية. لمنخفضة للغاية الحساسية (حساسية = 62، المنحنى الأحمر) وقد تم تحليل عدد قليل من الجزيئات فقط مما أدى إلى إحصاءات الفقيرة إلى حد ما. ارتفع عدد الجسيمات تحليلها مع الحساسية والتوصل إلى الحد الأمثل بين 70 (منحنى الأصفر) و 86 (منحنى تان). زيادة كذلك الرصاص حساسية إلى تدهور توزيع حجم الجسيمات مع عدد الجسيمات اسقاط وتوزيع حجم التحول نحو الأحجام الأصغر (حساسية = 94، المنحنى الأزرق). ويبين الشكل 4C اتجاه عدد مقرها قطر X50 (50٪ من جسيمات أصغر من هذا القطر) كدالة للحساسية. في الفترة الفاصلة البيج، كان RSD من حجم الجسيمات أقل من 8٪، ويتوافق مع فترة الأمثل في A. المناطق الحمراء تشير RSD&gt; 8٪ نتيجة لإحصاءات الفقيرة (حساسية منخفضة للغاية) أو زعته واسعbutions مع التحول إلى أحجام أصغر (حساسية عالية للغاية). إعدادات الحد الأدنى الحجم وماكس الحجم هي مرشحات تطبيقها على الصور الرقمية من أجل إزالة الجزيئات مع أحجام نقطة أصغر من الحد الأدنى الحجم وأكبر من ماكس الحجم. بسبب القدرة على تبعثر الضوء، الجسيمات يخلق بقعة من حجم معين على صورة رقمية. يتم قياس حجم البقعة وعدد من بكسل (بكسل). عندما ينثر جسيم الضوء بشكل جيد للغاية (على سبيل المثال، والجسيمات&gt; 200 نانومتر أو المجاميع)، وحجم البقعة هو كبير جدا، على سبيل المثال،&gt; 500 بكسل. حجم بقعة صغيرة جدا (على سبيل المثال، &lt;10 بكسل) للجسيمات صغيرة (على سبيل المثال، &lt;20 نانومتر) اعتمادا على المواد الجسيمات. حجم البقعة (بكسل) قد لا يكون متبادل مع حجم الجسيمات (نانومتر) لأنها ليست متطابقة وليس هناك علاقة مباشرة بين هذين المتغيرين. لتعظيم الاستفادة من الحد الأدنى والحد الأقصى الحجم يسمح للمستخدم لتصفية الأشياء غير المرغوب فيها مثل الكتل (ماكس الحجم) أو صغيرةكائنات مثل الضوضاء الخلفية (مين الحجم). ويظهر تأثير مين / ماكس الحجم على توزيع حجم الجسيمات من حجم قياسي 100 نانومتر في الشكل 4D (حساسية = 82). عندما يتم تعيين الفاصل الزمني إلى أحجام بقعة صغيرة (على سبيل المثال، دقيقة = 1، الحد الأقصى = 52؛ منحنى البرتقال)، ينخفض ​​عدد الجسيمات تحليلها ويتم إزاحة عدد مقرها قطر X50 قليلا نحو الأحجام الأصغر. إعداد لبقع أكبر (دقيقة = 40، الحد الأقصى = 1،000، المنحنى الأحمر) النتائج في توزيع حجم الجسيمات واسع تحول نحو أحجام أكبر. من أجل الحصول على الأرقام الإجمالية متساوية من الجسيمات، تم تعديل الحدود الفاصلة التوزيعات على حد سواء البرتقالي والأحمر لمباراة 80 الجسيمات. توزيع مع الإعدادات المثلى (دقيقة = 5، الحد الأقصى = 200؛ منحنى تان) ويتكون من 360 الجسيمات. وأجريت سلسلة من التجارب الناجحة مع exosomes معزولة بسبب تنبيذ فائق ويقاس NTA باستخدام نظام المقدمة. وكانت البيانات الناتجة غايةبما يتفق وأكد على مستوى عال من التكاثر. يجب أساليب عزل أخرى تظهر نتائج مماثلة. ومع ذلك، تم تحديد الخطوة تخفيف كخطوة حاسمة بشكل خاص وتأثيرها على الأرقام الإجمالية المحسوبة للجسيمات لابد من إعادة تقييم. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig1.jpg" /> الشكل 1. تخطيطي من الإعداد للNTA. والموجه المجهر / محور الفيديو وشعاع الليزر متعامد مع بعضها البعض، وعبور في المقطع العرضي قناة الخلية. يتم عرض الضوء المتناثرة من الجزيئات في &quot;العيش رأي&quot; نافذة البرنامج. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig2.jpg" /> <stronز&gt; الشكل 2. عدد الجسيمات مقابل منحنى حساسية. يعرض عدد من الجسيمات مقابل منحنى حساسية الجسيمات في موقف واحد في لحظة واحدة خلال مسح حساسية التلقائي. ويستخدم هذا التصور رسومية لتحديد أفضل التفضيلات الخاصة القياسات الأولية. يتم اختيار قيمة حساسية قبل المنحدر الحد الأقصى من الرسم البياني. من المهم أن نتذكر أن القطع الأثرية لا القضاء في هذه التجربة اختبار ويمكن أن تؤثر على الرسم البياني. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig3.jpg" /> يتم عرض الشكل 3. تأثير الحساسية على التناظرية وصورة رقمية. التصور من الجزيئات التي تظهر على الشاشة رأي الحية لحساسيات بين 50 و 94 لكل من التناظرية (الصف العلوي) لد الرقمية آراء (الصف السفلي). عندما حساسية منخفضة جدا، يتم الكشف سوى عدد قليل من الجسيمات (يسار). في حساسية الأمثل تظهر الجسيمات النقاط واحدة كما معزولة جيدا عن بعضها البعض (وسط). في دمج الجسيمات حساسية عالية نسبيا تؤدي معا إلى سوء جودة الصورة (يمين). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/50974/50974fig4.jpg" /> الرقم 4. تأثير حساسية دقيقة وإعدادات حجم الحد الأقصى لعينة السيطرة 100 نانومتر البوليسترين الجسيمات (A) قطعة حساسية في مقابل الكشف عن عدد من الجسيمات؛ الفترة الأمثل هو 66-86، قبل المنحدر الأقصى للمنحنى. توزيعات (B) حجم الجسيمات التي تم الحصول عليها مع العديد من إعدادات الحساسية (62-94)؛ الرسوم البيانية لمنخفضة جدا (62) أو مرتفعة جدا (94) حساسية لا تلتقط توزيع حجم الجسيمات ل100 نانومتر العينة الضابطة البوليسترين. (C) عدد مقرها X50 قطر مقابل حساسية. الخطأ من X50 في الفترة الفاصلة البيج هو أقل من 8٪، فاصل الأمثل هو من 66 إلى 86. (D) أثر Min و Max الحجم على توزيع حجم الجسيمات. المعلمات المثلى (دقيقة = 5 و الحد الأقصى = 200) التقاط التوزيع الصحيح للالعينة الضابطة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50974/50974fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> المعلمات ما قبل الاستحواذ </td></tr><tr><td> حساسية </td><td> متغير </td></tr><tr><td> مصراع </td><td> 40 </td></tr><tr><td> معدل الإطار </td><td> 30 إطارا في الثانية </td></tr><tr><td> قرار </td><td> مرحباGH </td></tr><tr><td> دورات </td><td> 10 </td></tr><tr><td> الاستحواذ متعددة </td><td> 3 </td></tr><tr><td> موقف </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> المعلمات في مرحلة ما بعد الاستحواذ </td></tr><tr><td> دقيقة السطوع </td><td> 30 </td></tr><tr><td> ماكس الحجم </td><td> متغير </td></tr><tr><td> دقيقة الحجم </td><td> متغير </td></tr></tbody></table> الجدول 1. ملخص من المعلمات قبل وبعد اكتساب لوضع وثيقة تتبع الجسيمات.

Watch this Scientific Journal Video about An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement at JoVE.com

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

an-innovative-method-for-exosome-quantification-and-size-measurement

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Views.  Heinrich-Heine-University Dusseldorf. A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Video: An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

بمساعدة الحاسوب على نطاق واسع التصور النوعي والكمي لقداس جزيرة البنكرياس والتوزيع الحجم والعمارة

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &amp;ldquo;Green&amp;rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

عرضية الترشيح الفائق التدفق: A &quot;الخضراء&quot; طريقة لاختيار الحجم وتركيز الجسيمات النانوية الفضة الغروية

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

لتحسين طريقة لقياس دقة وسرعة الأداء في الطيران<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

على الطريقة مناعي لتوصيف خلايا المريء باريت

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

An Efficient and Flexible Cell Aggregation Method for 3D Spheroid Production

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. Three-dimensional (3D) cell culture techniques are a recent innovation developed to address the shortcomings of adherent cell culture. While several techniques for generating tissue analogues in vitro have been developed, these methods are frequently complex, expensive to establish, require specialized equipment, and are generally limited by compatibility with only certain cell types. Here, we describe a rapid and flexible protocol for aggregating cells into multicellular 3D spheroids of consistent size that is compatible with growth of a variety of tumor and normal cell lines. We utilize varying concentrations of serum and methyl cellulose (MC) to promote anchorage-independent spheroid generation and prevent the formation of cell monolayers in a highly reproducible manner. Optimal conditions for individual cell lines can be achieved by adjusting MC or serum concentrations in the spheroid formation medium. The 3D spheroids generated can be collected for use in a wide range of applications, including cell signaling or gene expression studies, candidate drug screening, or in the study of cellular processes such as tumor cell invasion and migration. The protocol is also readily adapted to generate clonal spheroids from single cells, and can be adapted to assess anchorage-independent growth and anoikis-resistance. Overall, our protocol provides an easily modifiable method for generating and utilizing 3D cell spheroids in order to recapitulate the 3D microenvironment of tissues and model the in vivo growth of normal and tumor cells.

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

على طريقة تجميع خلية فعالة ومرنة ل3D كروي الإنتاج

Monolayer cell culture does not adequately model the in vivo behavior of tissues, which involves complex cell-cell and cell-matrix interactions. ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

أوديلاي: طريقة على نطاق واسع لالمعلمات المتعددة الكمي للنمو الخميرة

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

إنشاء درجة الحموضة خارج الخلية الحمضية منظومة الثقافة

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...