بروتوكولنا يوسع استخدام G.mellonella من نموذج العدوى الجهازية إلى نموذج يسمح الإدارة البكتيرية عبر الطريق الفموي الطبيعي. G.mellonella هو نموذج بديل مناسب للقوارض في تحليل السمات المميزة المختلفة للتفاعلات الفطرية المجهرية بعد كما يمكن استخدام اليرقات للبكتيريا المسببة للأمراض البشرية. تبدأ عن طريق نقل البيض التي وضعتها العث الكبار إلى علب لتر اثنين تحتوي على الركيزة العثة الشمع، في 30 درجة مئوية، في الظلام.
بعد أسبوع إلى أسبوعين ، نقل 25 غرامًا من اليرقة التي تحتوي على الركيزة إلى الركيزة الجديدة ، عندما تصبح اليرقة الصغيرة والصغيرة مرئية. مزامنة اليرقات بعد أسبوعين وفقا لحجمها، إلى مجموعات من 30 إلى 40 يرقة في حاويات لترين جديدة على الركيزة عثة الشمع. بعد أسبوعين ، حدد اليرقات للتجربة حسب الوزن.
باستخدام يرقات شاحبة وسريعة الحركة فقط مع كتلة من 180 إلى 200 ملليغرام. لتغذية اليرقات بالقوة ، قم بتحميل حقنة الأنسولين بإبرة غير حادة للاستخدام عن طريق الفم ، مع مرة واحدة 10 إلى البكتيريا السابعة لكل 10 ميكرولترات من DPBS لكل يرقة. قم بتحميل الحقنة في مضخة ميكرويرينغ.
انتظر اليرقة لفتح أجزاء الفم قبل إدخال الحقنة بعناية بين الفك السفلي وتسليم البكتيريا. عندما يتم إطعام جميع اليرقة ، احتضان الحيوانات في الظلام عند 37 درجة مئوية ، بين ساعة واحدة إلى 24 ساعة. لمعالجة اليرقات ، قم بتنظيف غطاء الأمان بالإيثانول ومعشف الرش لمنع تلوث RNase.
المفاجئة تجميد اليرقة الحية في النيتروجين السائل. التجانس كل يرقة المجمدة الفردية باستخدام هاون وحشرات وحجم صغير من النيتروجين السائل. عندما تم إنتاج متجانس مسحوق، نقل المتجانسة إلى قارب الانتظار المتاح وانتظر النيتروجين السائل لتتبخر.
عندما يتم تجانس جميع اليرقة ، اخلط المجانسة المجففة مع ملليلتر واحد من TRIzol في أنبوب ملليلتر. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. في نهاية الحضانة، بيليه التجانس عن طريق الطرد المركزي.
نقل المُندفع إلى أنبوب جديد. خلط اسخن مع 200 ميكرولترات من 1-برومو-3-الكلوروبروبان، أو BCP. دوامة واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، تليها حضانة 10 دقيقة على الجليد.
وفي نهاية الحضانة الثانية، أضافت أجهزة الطرد المركزي تفاعلاً ونقل الطبقة الشفافة العليا إلى أنبوب جديد، ملليلتر. يُعجّل الحمض النووي الريبي للطبقة العليا المنقولة مع 500 ميكرولترات من الأيزوبروبانول عن طريق خلط واناء الأنبوب لمدة خمس دقائق. ثم جمع الجيش الملكي النيبالي المتعجل عن طريق الطرد المركزي.
غسل الكريه RNA عجلت مع 500 ميكرولترات من 75٪ الإيثانول وتجفيف الجيش الملكي النيبالي لمدة خمس إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما يتبخر الإيثانول، إضافة 100 ميكرولترات من مثبطات ريبونوكليس في المياه الخالية من النوى إلى بيليه الحمض النووي الريبي المجفف، ودوامة بعناية الأنبوب حتى يتم حل الكريه تماما. قياس RNA نوعية وكمية من بروتوكولات القياسية، وضمان أن نسبة 260 إلى 280 هو اثنين تقريبا، ونسبة 260 إلى 230 في نطاق اثنين إلى 2.2.
ثم استخدام خمسة ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المعزول للهضم DNase وتحليل التعبير الجيني، وفقا للبروتوكولات القياسية. G.mellonella قادرة على مسح القوة الأولية تغذية الحمل البكتيري حتى لا تكون البكتيريا قابلة للكشف. مع ال 16s نسخة رقم أرقام من كلا [ب.فولغاتوس] و [إي.كولّ] بدرجة كبيرة ينخفض ضمن 24 ساعات.
إدارة Commensal يرقات G.mellonella حث التعبير الجيني الحمض النووي الريبي من مختلف الجينات علامة مناعة الفطرية. على سبيل المثال ، يتم التعبير عن جزيئات التعرف على LPS و apolipophorin والهيمولين بشكل عام بشكل أكثر جدًا في يرقات E.coli التي تدار مقارنة باليرقات التي تدار B.vulgatus. وعلاوة على ذلك، فإن إنتاج الأكسجين التفاعلي وأنواع النيتروجين يتم تنظيمها بقوة على تغذية قوة الإشريكية القولونية مقارنة بـ B.vulgatus، وكذلك التعبير الجيني المضاد للأكسدة GST.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحفيز تعبير الببتيد الميكروبي التفاضلي بقوة أكبر بعد إدارة الإشريكية القولونية أكثر مما يحدث استجابة للتغذية بالقوة B.vulgatus. تذكر أن تستخدم فقط يرقات صحية بيضاء وسريعة الحركة ، لاستخدام الصبر أثناء التغذية القسرية لتجنب اضمار اليرقات وتضمين جميع الضوابط اللازمة. يمكن تحديد تفعيل علامات G.mellonella المناعية مباشرة من قبل RUS أو GST تحليل النشاط ويمكن تحديد وفرة ANPs من قبل مقايسات تثبيط النمو البكتيري.
ويمكن استخدام هذه التقنية كأداة لفحص البكتيريا commensal والبكتيريا المسببة للأمراض واستكشاف symbiomes المعوية و pathobiomes دون التضحية بالعديد من الفقاريات. دائما استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل، BCP، أو TRIzol المواد.
