دوشين هو ضمور العضلات مما تسبب في استنفاد سابق لأوانه من الخلايا السلف العضلات. وهي واحدة من عسر الهضم الأكثر شدة العضلات. لتعزيز تجديد العضلات الوظيفية، ونحن نستخدم CRISPR / Cas9 بوساطة تحرير الجينات لاستعادة التعبير dystrophin في الخلايا الجذعية المستحثة الخلية الجذعية المشتقة من الخلايا السابقة.
إن تحرير الجينات CRISPR-Cas9 لديه القدرة على استعادة التعبير الجيني للديستروفين. يمكن للخلايا سلف العضلات المشتقة من iPSC الذاتية تجديد مسام الخلايا الجذعية وإصلاح الضرر ومنع حدوث مضاعفات أخرى في DMD دون التسبب في استجابة مناعية. عوامل مختلفة من الخلايا iPS في الخلايا بروجينيك ميوجيني خفضت من خطر الورم إعادة التكوين في خلايا iPS.
العديد من العلاجات التي تجمع بين الخلايا السلف العضلية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات الذاتية مع تصحيح وراثي بوساطة CRISPR-Cas9 هي استراتيجيات علاج ضمور العضلات الدوشين الواعدة. يمكن استخدام هذه التقنية لعلاج العديد من الأمراض الخلقية عن طريق تحرير الخلايا الجذعية الذاتية وراثيا، بما في ذلك أمراض القلب والدماغ والدم. وأظهرنا دليلا على هذا النهج يمكن أن توفر للقراء مع الخبرة في التعامل مع إعادة برمجة الخلايا وتحرير الجينات، الذي لا يزال يشكل تحديا.
تحت مجهر مقلوب، فحص مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية الماوس المصابة. وضع علامة على المستعمرات في الجزء السفلي من الطبق مع علامة الكائن ذاتية التحبير. تطبيق حلقات الاستنساخ مدهون لتغطية مستعمرات الخلية ملحوظ.
إضافة 100 ميكرولترات من 0.05٪ تريبسين-EDTA لكل حلقة الاستنساخ ووضع لوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم, نقل الخلايا المهضوية مع نصائح ماصة 100 ميكرولتر إلى لوحات ثقافة 48 جيدا تحتوي على 250 ملليلتر من متوسط نمو MES. احتضان الخلايا في حاضنة درجة 37 مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة 85٪.
عندما يقرأون التقاء 70٪، حدد الآبار مع خلايا جيدة النمو وإضافة 250 ملليلتر من حل TVP لهضم لمدة 30 دقيقة. ثم، نقل ثقافة الخلية من كل بئر إلى طبق ستة سنتيمترات. كرر تطبيق حلقات الاستنساخ والاحتضان لعدة مرات حتى يتم الحصول على موحدة، والمستنسخات على شكل النوم.
الآن، هضم iPSCs الماوس المعد عن طريق إضافة ملليلتر واحد من حل TVP. نقل ثقافة الخلية إلى لوحة 24-well المغلفة مع فيبونكتين وجيلاتين واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الخلايا تصل إلى التقاء 50٪، والتحول إلى 500 ميكرولترات من الثقافة الطازجة المتوسطة التي تحتوي على ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر بوليبرين.
ثم، إضافة 100 ميكرولترات من حل جزيئات العدسي فيروس إلى iPSCs الماوس. احتضان الخلايا لمدة ثلاثة أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. المقبل, تحديد الحد الأدنى تركيز Blasticidin وHygromycin B الذي هو في نصف معدل القتل في غضون 24 ساعة.
إضافة وسائل الإعلام من 2.5 ميكروغرام لكل المليلتر Blasticidin و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر Hygromycin B في الخلايا، والانتظار لمدة ثلاثة أيام، وتحديد الخلايا التي لا تزال تنتظّر كخلايا مصابة طعن. اجسّد الماوس المحدد iPSCs مع 0.5 ملليلتر من حل TVP ، كل بئر في لوحة جديدة من 24 بئرًا ، وخلايا احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم، ماصة iPSCs في خلايا واحدة وعد الخلايا مع غرفة العد خلية.
حدد حوالي 150 الخلايا المفردة المهضمة وتمييع مع MES المتوسطة في 10 سم طبق, ثقافة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد حوالي 10 أيام، تحت مجهر مقلوب، واستخدام 10 نصائح الماصات معقم ميكرولتر لاختيار مستعمرات واحدة ونقل كل مستعمرة إلى 50 ميكرولترات من حل TVP في لوحة 96 جيدا. اجسه في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
يعتبر التقاط الاستنساخ اليدوي الموثوق به أمرًا بالغ الأهمية لنجاح حصاد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من نوع CRISPR/Cas9. ثم، نقل وتقسيم الخلايا المهضوية من كل بئر إلى اثنين آخر لوحات ثقافة 96-well. احتضان في 37 درجة مئوية حتى 70٪ التقاء.
مع مستعمرات الخلية في التقاء 70٪، وإزالة المتوسطة في لوحة 96-جيدا. إضافة 25 ميكرولترات من كاشف التحلل التي تحتوي على 1٪ محلول البروتين K لكل بئر ونقل lysate إلى آخر 96 جيدا PCR لوحة. ختم لوحة PCR مع الأختام لاصقة واحتضان لوحة في دورة حرارية في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم في 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لlyse الخلايا وdenaturee البروتينات K.Then، في أنبوب PCR، إضافة اثنين من microliters من lysate، 10 ميكرولترات من 2x الحمض النووي بوليميراز بريميكس، 7 ميكرولترات من المياه الخالية من DNase ، و مصغرة واحدة من الزهق DMD Exon23.
بدء تفاعل PCR وفقا للمخطوطة. ثم، تحميل تفاعل PCR الموردة مع 2.2 ميكرولترات من تحميل العازلة على هلام agarose 2٪. تشغيل الجل في 100 إلى 150 فولت لمدة 30 دقيقة وفحص هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
في هذا البروتوكول، تم تصميم اثنين من RNAs دليل التي تحيط Exon23 متحولة. بعد كاس 9 بوساطة فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل وغير متجانسة نهاية الانضمام، تم حذف إكسون23 متحولة، مما يسمح للإنتاج Dystrophin اقتطاع ولكن وظيفية. لتجنب تسرب من محلول تريبسين، نحن بحاجة إلى تطبيق الشحوم بالتساوي إلى الجزء السفلي من الحلقات.
مزيج من CRISPR / Cas9 الجينوم تحرير مع نظام تنشيط ميود متكت على توفير استراتيجية آمنة ومجدية وفعالة لزرع الذاتية في مرضى ضمور العضلات دوشين مع الخلايا البروجينية القاعدية الانتعاش الجيني.
