السابقين vivo التوسع في الخلايا الجذعية الدموية من وحدة دم الحبل السري عقد وعد كبير لتطبيق HSC في الطب التجديدي والعلاج زرع. يستخدم هذا البروتوكول كوكتيل السيتوكين إلى جانب علاج حمض فالبرويك لتوسيع عدد كبير من HSCs الوظيفية بسرعة مع الخصائص التي تشبه إلى حد كبير HSCs البدائية الأولية.
وقد تكون هذه الطريقة مفيدة لتوليد عدد أكبر من الخلايا المعدلة وراثياً في غضون فترة زمنية تكون ذات صلة لبروتوكولات تعديل الجينات المستخدمة حالياً. حمض فالبرويك السابقين بروتوكول التوسع vivo بسيطة نسبيا وموثوق بها. تنقية الخلايا إيجابية CD34 مع الجهاز فاصل الخلية هو استنساخ للغاية وسريعة، مما يسمح لاسترداد سريع من الخلايا CD34-إيجابية عالية تنقية.
قبل 24 ساعة من عزل الخلايا الإيجابية CD-34 من دم الحبل السري، قم بإعداد عازلة الفصل بإضافة ميليلترين من 0.5 EDTA 0.5 مولار و33 ملليلتر من 7.5٪ BSA إلى 465 ملليلتر من PBS 1× . اخلط الحاجز بلطف وحافظ عليه بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في يوم التنقية، تدفئة وسائل الإعلام إلى درجة حرارة الغرفة.
الاستغناء عن وحدة دم الحبل السري بأكملها في قارورة 75 سم مربع. تخفيف الدم مع حجم متساو من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة ومزيج بلطف. بعد ذلك، تحديد عدد الأنابيب المطلوبة لمعالجة وحدة دم الحبل السري بأكملها.
إضافة 15 ملليلتر من كثافة وسائط التدرج لكل أنبوب. الاستغناء عن الدم المخفف ببطء شديد على أعلى التدرج الكثافة في حين عقد الأنبوب في زاوية 45 درجة لخلق طبقتين. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 400 غرام لمدة 30 دقيقة مع تسارع منخفض ومعدل التباطؤ.
بعد الطرد المركزي، سوف تكون موجودة الخلايا أحادية النوى في طبقة بيضاء بين البلازما وكثافة طبقات الوسائط التدرج. نقل بعناية طبقة معطف بافي في أنبوب جديد, 50 ملليلتر. جمع كل من الخلايا أحادية النوى من نفس وحدة دم الحبل السري في أنبوب 50 ملليلتر حتى تصل إلى 25 ملليلتر.
إضافة 25 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى أنبوب يحتوي على 25 ملليلتر من الخلايا أحادية النوى ومزيج جيد. جهاز طرد مركزي في 400 غرام و4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. التعرق بعناية وssuspend بيليه الخلية في 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
بعد ذلك، إزالة 20 ميكرولترات من تعليق الخلية للعد. استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب عدد الخلايا الملطخة إما ببرتقال أو يوديد بروبديسيوم وحساب العدد الإجمالي للخلايا أحادية النوى. ثم، الطرد المركزي الخلايا في 400 غرام و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
أولا ، مزيج 300 ميكرولترات من العازلة الفصل مع 100 ميكرولترات من الإنسان IgG الإنسان FCR و 100 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي CD34 لعزل الخلايا CD34 إيجابية من 10 مليون خلية أحادية النوى. بعد ذلك، قم بإزالة المُنطَر من أنبوب الخلايا أحادية النوى المُثبَّتة من قبل. Resuspend بيليه في الحل حبة المغناطيسي باستخدام 500 ميكرولترات لكل 10 مليون خلية.
اخلطي بلطف وحضني أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. أثناء الحضانة، قم بإعداد جهاز فاصل الخلايا عن طريق استبدال حل التخزين بمخزن مؤقت يعمل وتشغيل برنامج غسيل متبوعاً ببرنامج الشطف. ثم، إضافة فاصل خلية الباردة تشغيل المخزن المؤقت إلى الأنبوب الذي يحتوي على خليط الخلية حتى يتم تعبئة الأنبوب تماما.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 400 غرام و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. التعرق وssuspend بيليه الخلية في فاصل الباردة تشغيل العازلة باستخدام ميليلتر اثنين لكل 10 مليون خلية. نقل خليط تعليق خلية مليلتر إلى أنابيب 15 ملليلتر.
تحميل ثلاث مجموعات من الأنابيب في رف فاصل الخلية، والتي تم تبريدها مسبقا إلى أربع درجات مئوية. مجموعة واحدة من الأنابيب تحتوي على MMCs، وسوف تستخدم المجموعة الثانية من الأنابيب لجمع الكسر السلبي، وسوف تستخدم مجموعة ثالثة من الأنابيب لجمع الخلايا CD34-إيجابية النقية. قم بتحميل الحامل في جهاز فاصل الخلايا ثم قم بتشغيل البرنامج المحدد مسبقاً.
بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على جزء إيجابي في 400 غرام في و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. استلهم من فوق و resuspend الخلايا CD34 إيجابية المنقاة في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام خالية من المصل. ثم، استخدم عداد خلية الآلي لحساب الخلايا الملطخة مع البرتقال أو يوديد بروبيد بروبيد.
أولاً، إعداد حجم كاف من الوسائط لصفيح الخلايا الموجبة CD34 المنقية بكثافة 33000 خلية لكل ملليلتر. لوحة الخلايا CD34-إيجابية المنقية في لوحة 12-جيدا في كثافة خلية من 50, 000 الخلايا في 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام في بئر. احتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون مرطب لمدة 16 ساعة.
إضافة حمض فالبرويك إلى الثقافات بحيث يكون التركيز النهائي هو ملليمتر واحد. مواصلة زراعة الخلايا في نفس الظروف لمدة سبعة أيام إضافية. في هذا البروتوكول السابق vivo، يتم زيادة عدد الخلايا الجذعية الدموية البدائية التي تم إنشاؤها من الخلايا إيجابية CD34 معزولة عن دم الحبل السري.
العدد الإجمالي للخلايا النووية أعلى بكثير في الثقافات المعالجة مع كوكتيل السيتوكين وحده. على الرغم من ارتفاع عدد الخلايا النووية الإجمالية، فإن عدد الخلايا الجذعية الدموية في الثقافات التي تتلقى كوكتيل السيتوكين وحده لا يزال منخفضًا خلال فترة التوسع بأكملها، مقارنة بالثقافات المعالجة بكوكتيل السيتوكين وحمض فالبرويك. يتم إنشاء أكبر عدد من الخلايا الجذعية للدم في الثقافات المعالجة بمزيج من كوكتيل السيتوكين وحمض فالبرويك.
على وجه الخصوص ، يتم التوصل إلى أكبر توسع بعد خمسة إلى سبعة أيام بعد العلاج بحمض فالبرويك. ويرتبط هذا العدد المتزايد من الخلايا الجذعية للدم مع زيادة سريعة في النسبة المئوية للخلايا الجذعية للدم، والتي هي ملحوظة في غضون 24 ساعة من العلاج مع حمض فالبرويك. بينما يحافظ الزيادة في النسبة مئويّة أثناء الأولى أربعة أيام من سابقة تربية, ينخفض هو تدريجيّا بعد خمسة إلى سبعة أيام المعالجة.
ومع ذلك، يرتبط هذا الانخفاض عكسياً بزيادة العدد المطلق للخلايا الجذعية للدم. والزيادة السريعة في النسبة المئوية للخلايا الجذعية التي تحتوي على ترسبات الدم في الثقافات المعالجة بالفالبرويك- حمضية ترجع إلى اكتساب النمط الظاهري CD90. الخلايا إيجابية CD34 التي تعبر عن علامة فينونتيبيك CD90 تصل إلى ما يقرب من 40 إلى 50٪ من الخلايا الموسعة في الثقافات فيفو السابق تعامل مع كوكتيل السيتوكين وحمض فالبرويك لمدة أربعة أيام.
ثم يتم تأكيد اقتناء النمط الظاهري CD90 من خلال التوسع السابق في الجسم الحي للخلايا CD34-الإيجابية عالية النقية التي تفتقر إلى التعبير عن علامة CD90. في غضون 24 ساعة من العلاج مع حمض فالبرويك, ما يقرب من 75٪ من الخلايا الموسعة السابقين فيفو التعبير عن CD90. هذا النمط الظاهري هو الاحتفاظ بها بشدة خلال الأيام الأربعة الأولى في هذه الثقافات.
يجب أن يتم صرف دم الحبل السري المخفف ببطء شديد فوق تدرج الكثافة أثناء حمل الأنبوب بزاوية 45 درجة لإنشاء طبقتين متميزتين. بعد هذا الإجراء التوسع في الجسم الحي السابق، يمكن حقن الخلايا الموسعة في الفئران NSG المناعية ناقصة في النيفة لاختبار وظائفها وإمكانات engraftment. يمكن استخدام الخلايا الموسعة لاختبار مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة ببيولوجيا HSC البشرية والفأر ودور الجينات المختلفة أو لاعب حاسم في السلامة الوظيفية للHSCs.
وظيفة السابقين vivo الموسعة HSC من وحدة دم الحبل السري البشري، وذلك باستخدام هذه التقنية، وسيتم اختبار قريبا في تجربة سريرية في المريض مع الأورام الخبيثة الدم الذين يحتاجون زرع نخاع العظام المسببة للحساسية. وقد سمحت لنا هذه التقنية أيضًا بالتحقيق في الآلية التي تقوم عليها توسعة الجسم الحي السابق مع علاج VPA والحصول على رؤى في بيولوجيا HSCs البدائية.
