يسمح هذا البروتوكول بالتوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم الوظيفية للفأر ، مما يسمح بفهم أعمق لبيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم وتكون الدم. ميزة هذه التقنية هي أنها يمكن أن تدعم الخلايا الجذعية المكونة للدم في الثقافة خارج الجسم الحي على المدى الطويل وتسمح بالتلاعب الجيني لاستجواب علم الوراثة لتكوين الدم. يوفر نظام الاستزراع هذا تقنية منصة للدراسات المختلفة في بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم وتكون الدم ، بما في ذلك الدراسات الجينية والجزيئية والكيميائية الحيوية.
يسرد جدول استكشاف الأخطاء وإصلاحها أسباب وحلول الصراعات الشائعة التي تمت مواجهتها مع هذه التقنية. من الأسهل والأكثر فعالية إظهار كيفية استخراج خلايا نخاع العظم بشكل صحيح وإجراء تغييرات كاملة في الوسائط بدلا من القراءة عنها. لبدء استخراج الخلايا الجذعية المكونة للدم ، أو HSC ، استخدم مناديل المهام الدقيقة الخالية من النسالة لتنظيف العظام المعزولة حديثا من الفئران التي تم قتلها رحيما بشكل صحيح.
قم بإزالة العضلات والحبل الشوكي من العظام قبل إضافتها إلى ملاط يحتوي على ما يقرب من ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. باستخدام مدقة ، سحق العظام دون طحنها لتقليل قوى القص. بعد ذلك ، باستخدام إبرة قياس 19 متصلة بحقنة سعة 5 ملليلتر ، قم بتفتيت شظايا نخاع العظم الكبيرة التي تم إطلاقها في PBS ونقل التعليق من خلال مرشح 70 ميكرون إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر.
بمجرد نقل التعليق ، كرر العملية باستخدام برنامج تلفزيوني جديد حتى يتم تبييض العظام. استهدف حجما نهائيا يبلغ حوالي 30 ملليلترا لكل فأر و 50 ملليلترا لفأرين لتبييض العظام حتى لا يظهر المزيد من النخاع. استعد لتخصيب العمود عن طريق وضع عمود ترشيح مغناطيسي في مغناطيس فاصل عمود مغناطيسي مع مرشح 50 ميكرون في الأعلى وأنبوب مخروطي 15 ملليلتر أدناه.
بعد ذلك ، بعد معالجة الخلايا بالأجسام المضادة allophycocyanin anti-c-Kit والميكروبيدات المغناطيسية allophycocyanin ، قم بتشغيل ثلاثة ملليلتر من PBS المعقم من خلال مرشح 50 ميكرون وعمود الترشيح. بمجرد تشغيل PBS ، مرر تعليق الخلية عبر العمود ، متبوعا بثلاث غسلات من ثلاثة ملليلتر من PBS البارد في كل مرة. بعد كل غسلة ، انتظر حتى يتوقف العمود عن التنقيط قبل إضافة PBS للغسيل التالي.
بعد ذلك ، قم بإزالة العمود من المغناطيس وضعه فوق أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر وأضف خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني بارد إلى العمود قبل تركيب مكبس العمود عليه وسحب الخلايا عن طريق دفع المكبس. اتبع البروتوكول الموضح في النص لإعداد ما يكفي من وسط HSC للعدد المطلوب من الخلايا أو الآبار لزرع 0.5 إلى 1 مليون خلية لكل ملليلتر. ثم قم بتدوير الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم المخصبة ب c-Kit ، أو HSPCs ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط HSC المحضر حديثا بكثافة الخلية المطلوبة.
انقل الخلايا إلى ألواح مشحونة بالسطح مغلفة بالفبرونيكتين أو سالبة ، مع الحفاظ على الحجم المناسب. ضع الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد إزالة اللوحة برفق من حاضنة زراعة الأنسجة دون إزعاج مزارع الخلايا ، استخدم ماصة أو مضخة تفريغ لشفط ما يقرب من 90 إلى 95٪ ببطء من الوسط من الغضروف المفصلي السائل لكل بئر.
تجنب سحب وسيط من قاعدة البئر. ثم أضف ملليلتر واحد من الوسط الطازج المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية في البئر. أعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الأنسجة ، وقم بتغيير الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تتطلب التجربة.
بعد إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت nucleofection ، انقل تعليق الخلية على الفور إلى أنبوب PCR الذي يحتوي على البروتين النووي الريبي المعقد ، واخلطه برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ببطء. الآن انقل الخليط إلى كوفيت كهربائي بحجم مناسب ببطء شديد ، مع الحفاظ على حركة السوائل المستمرة لتجنب تكوين فقاعات هواء داخل الكوفيت. ثم ، على جهاز الحفر الكهربائي ، حدد موضع الآبار التي يتم تقويضها بالكهرباء.
باستخدام شاشة اللمس، حدد برنامج نوع الخلية كإنسان إيجابي CD34 أو اكتب الرمز النبضي EO100، ثم اضغط على الزر موافق ( OK) . انقل الكوفيت إلى جهاز التثقيب الكهربائي واضغط على زر البدء على شاشة اللمس لبدء التثقيب الكهربائي. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، أضف خمسة أضعاف حجم تفاعل وسط الاستزراع إلى الكوفيت.
الآن قم بنقل الخلايا برفق إلى اللوحة المعدة ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة زراعة الأنسجة. بعد إجراء تغيير متوسط كما هو موضح سابقا ، اجمع 10 ميكرولتر من الخلايا وعدها باستخدام محلول Turk بتخفيف 1: 2 باستخدام مقياس الدم. أعد طلاء الجرعة المطلوبة من الخلايا في الألواح المطلية بالفبرونيكتين للتنبيغ ، وبشكل منفصل ، قم بطلاء خلايا التحكم السلبية غير المحولة.
ثم أضف ناقل الفيروس العدسي إلى كل خلية تحتوي على بئر ، مع الحفاظ على جرعة 20 وحدة نقل لكل خلية لتحقيق حوالي 30٪ من كفاءة النقل. ومع ذلك ، حدد جرعة الناقل الفيروسي العدسي تجريبيا اعتمادا على المتطلبات التجريبية. أخيرا ، أعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة لمدة ست ساعات.
قم بإجراء تغيير متوسط كما هو موضح سابقا. أسفر فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ل HSCs المخصبة ب c-Kit عن حوالي 0.2٪ من الخلايا التي كانت إيجابية CD150 ، وسلبية CD34 ، وإيجابية c-Kit ، وإيجابية Sca1 ، وسلبية النسب. بعد أربعة أسابيع من زراعة HSPC ، تم العثور على الكسور الإيجابية CD201 ، وإيجابية CD150 ، وإيجابية c-Kit ، وإيجابية Sca1 ، وسالبة النسب لتكون حوالي 10٪ بعد التحويل باستخدام ناقل فيروسي عدسي يعبر عن GFP ، كانت الخلايا الإيجابية ل GFP حوالي 30٪ عند الالتقاء ، كانت الكثافة المتوقعة للمزارع حوالي 2 مليون خلية لكل ملليلتر.
لوحظ ما يقرب من 50٪ من موت الخلايا خلال ال 24 إلى 48 ساعة الأولى قبل إجراء أول تغيير متوسط. ومع ذلك ، بعد أسبوع واحد ، عادت أعداد الخلايا إلى 80 إلى 100٪ من عدد الخلايا المصنفة. تعد التغييرات الدقيقة في الوسائط باستخدام وسائط جديدة ودافئة أمرا بالغ الأهمية لاستقرار طريقة ثقافة HSC هذه على المدى الطويل.
منذ نشر الطريقة الأصلية في عام 2019 ، بدأ المجال في استخدامها بطرق مختلفة لدراسة بيولوجيا HSC.
